Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-04-05T17:29:19Z No. of bitstreams: 2 Tese - Maria Auxiliadora Andrade - 2005.pdf: 1009311 bytes, checksum: fc89542ce0a0fb7c6a73727f348fc5a1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-06T11:11:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Maria Auxiliadora Andrade - 2005.pdf: 1009311 bytes, checksum: fc89542ce0a0fb7c6a73727f348fc5a1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-06T11:11:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Maria Auxiliadora Andrade - 2005.pdf: 1009311 bytes, checksum: fc89542ce0a0fb7c6a73727f348fc5a1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2006-09-16 / Two experiments were carried out to evaluate the use of quaternary ammonia on Salmonella Enteritidis inoculated in eggshell and its penetration capacities, verify the ability to infect the egg inoculated in eggshell, determine embryo mortality, infect hatched chicks and affect incubation parameters of two broiler lines. A total of 302 and 290 fertile eggs of Ross and ISA Label, respectively, were distributed in six treatments: eggs sanitized with placebo (Treatment 1- PC) quaternary ammonia inoculated with Salmonella Enteritidis (Treatment 2-PI); eggs non-sanitized and inoculated placebo (Treatment 3- NPC) with Salmonella Enteritidis (Treatment 4- NPI); eggs inoculated in allantoidal cavity with placebo (Treatment 5-CAC) or Salmonella Enteritidis (Treatment 6- CAI). Immediately after inoculation, the eggs were hatched and embryo mortality was evaluated after 96, 432 and 528 hours. The qualitative results were analyzed by non-parametric tests of chi-square and Kruskall-Wallis. The incubation parameters were not affected when the pathogen was inoculated in eggshell. It was observed that Salmonella Enteritidis inoculated in allantoidal cavity determined late embryo mortality in fast 17,02% and slow growing 13,04% lines, and eggs inoculated in allantoidal cavity originated chicks with high frequency of intestinal colonization by Salmonella Enteritidis of 76,67% and 26,67% Ross and ISA Label, respective. / Foram conduzidos dois experimentos para avaliar os efeitos de quaternários de amônia sobre Salmonella Enteritidis inoculados na casca e a capacidade de penetração deste patógeno na casca e para verificar sua habilidade em infectar os ovos inoculados pela casca e cavidade alantóide, determinar mortalidade embrionária, infectar os pintos eclodidos e afetar os parâmetros de incubação em duas linhagens de frango de corte. Utilizaram-se, respectivamente, 302 e 290 ovos férteis das linhagens Ross e ISA Label, distribuídos em seis tratamentos: ovos sanitizados e inoculados com o placebo (tratamento 1- PC) ou com quaternários de amônio inoculados na casca com Salmonella Enteritidis fagotipo 4 (tratamento 2-PI); ovos não sanitizados e inoculados na casca com placebo (tratamento 3-NPC) ou com Salmonella Enteritidis (tratamento 4-NPI); ovos inoculados na cavidade alantóide com placebo (tratamento 5-CAC) ou com Salmonella Enteritidis (tratamento 6-CAI). Imediatamente após a inoculação, os ovos foram incubados e a mortalidade embrionária avaliada após 96, 432 e 528 horas. As respostas qualitativas foram analisadas pelos testes não paramétricos de qui-quadrado e de Kruskal-Wallis. Constatou-se que a sanitização dos ovos não eliminou a Salmonella Enteritidis inoculada na casca sendo que o agente manteve-se viável na casca durante todo o período de incubação e migrou para o interior dos ovos em três das 20 amostras analisadas. Os parâmetros de incubação não foram afetados quando o patógeno foi inoculado na casca. Constatou-se também que a Salmonella Enteritidis inoculada na cavidade alantóide determinou mortalidade embrionária tardia nas linhagens Ross de 17,02% e ISA Label de 13,04%, assim como os ovos inoculados nesta cavidade originaram pintos com maior freqüência de colonização intestinal pela Salmonella Enteritidis de 76,67% e 26,67% para Ross e ISA Label, respectivamente.

Objetivou-se avaliar a influencia da suplementação de ácidos graxos ω3 e ω6, sobre desempenho produtivo, perfil metabólico, qualidade oocitária e embrionária, função imune em vacas leiteiras no período de transição e inicio de lactação. Foram selecionadas 42 vacas da raça holandesa, multíparas e gestantes, com parto previsto para 35 dias após o início da avaliação e fornecimento das dietas experimentais. As vacas foram alojadas em estábulo tipo “free-stall”, providos de baias individuais. Os animais foram distribuídos aleatoriamente para receber uma das quatro dietas experimentais fornecidas a partir de 35 dias antes da data prevista para o parto até 84 dias do pós-parto: controle (n=11) (C): dieta sem adição de gordura; semente de linhaça (n=10) (SL): inclusão de 60 a 80 g/kg de MS (fonte de ômega 3); grão de soja cru e integral (n=11) (GS): inclusão de 120 a 160 g/kg de MS (fonte de ômega 6); sais de cálcio de ácidos graxos insaturados (n=11) (SC): inclusão de 24 a 32 g/kg de MS (fonte de ômega 6). As dietas experimentais tiveram a mesma concentração de ácidos graxos insaturados, porém o perfil de ácidos graxos das fontes foi diferente. Os animais foram arraçoados de acordo com o consumo de matéria seca no dia anterior, de forma a ser mantido porcentual de sobras das dietas, diariamente, entre 5 e 10%. As amostras dos alimentos e sobras foram coletadas diariamente e armazenadas a -20ºC. Semanalmente as amostras coletadas diariamente foram misturadas e foi retirada uma amostra composta referente a um período de uma semana, a fim de mensurar o consumo de matéria seca e nutrientes. Amostras de fezes foram coletadas nos dias -28, -14, 21, 42 e 84 dias em relação ao parto, com o propósito de mensurar a digestibilidade da matéria seca e nutrientes. A produção de leite foi mensurada diariamente e para a composição dos teores de gordura, proteína, lactose e perfil de ácidos graxos foram coletados amostras semanalmente e analisadas a fresco. Amostras de sangue foram coletadas nos dias -21, -14, -7, parto (até 24 horas), 7, 14, 21, 42 e 84 dias em relação ao parto, a fim de mensuração a concentração dos metabólitos plasmáticos e função imune. O scaneamento das estruturas ovarianas por ultrassonografia foi realizada do 14° ao 72° dia de lactação a fim de analisar a dinâmica folicular dos animais. Aspirações foliculares foram realizadas nos dia 35±7 e 65±7, com o objetivo de avaliar a quantidade e qualidade oocitária e embrionária, por fertilização” in vitro”. Foi observado maior CMS para a dieta SL em relação às dietas GS e SC no pré-parto. No pós-parto não foi observado diferenças no CMS. Foi observado maior consumo de EE para as dietas SL, GS e SC no pré e pós-parto em relação à dieta C. Não foi observado diferença na digestibilidade da matéria seca no pré e pós-parto entre as dietas experimentais. Foi obtido maior digestibilidade do EE para a dieta SL em relação às dietas GS e SC no pós-parto. Não foi observada diferença no balanço de energia no pré-parto. No entanto no período pós-parto foi observado melhor balanço de energia para as dietas SL, GS e SC em relação à dieta C. Não foi observada diferença para o balanço de nitrogênio nos períodos pré e pós-parto entre as dietas avaliadas. Foi observado maior teor e produção de gordura no leite para a dieta GS em relação às dietas SL e SC, porém não foi observado diferença para a produção de leite entre as dietas experimentais. No perfil de ácidos graxos do leite foi obtido maior concentração de C18: 1 trans e CLA cis-9 trans-11 para a dieta SC em relação as demais dietas experimentais, maior concentração de C18:2 para a dieta GS e SC em relação a dieta SL e C18:3 para a dieta SL em relação as dietas GS e SC. Não foi observada diferença no escore de condição corporal e peso corporal no pré e pós-parto. Foi observada maior concentração de glicose no pré e pós-parto para a dieta SL em relação às dietas GS e SC. Foi observado maior concentração de colesterol total para as dietas SL, GS e SC em relação a dieta C no pós-parto. Não foi observadas diferenças nas concentrações de ácidos graxos não esterificados e β-hidroxibutirato no pré e pós-parto. Foi observado menor número total de folículos e folículos de classe1 para a dieta C em relação as dietas SL, GS e SC. Foi observado maior número de oócitos viáveis na aspiração dos 65±7 dias em relação a dos 35±7 dias de lactação. Foi obtido maior número e porcentagem de embriões viáveis para a dieta SL em relação às dietas GS e SC. Foi observada maior porcentagem de leucócitos e monócitos positivos a fagocitose para as dietas SL, GS e SC em relação à dieta C, no pré e pós-parto, para os neutrófilos no pré e pós-parto e monócitos no pós-parto foi observado maior porcentagem de células positivas para a dieta SL em relação às dietas SC e GS. Foi observado maior expressão das células de adesão CD4+, CD8+, CD25+ e CD62L para as dietas SL, GS e SC em relação as dieta C, para o CD14+ foi observado maior expressão para as dietas GS e SC em relação à dieta SL. A suplementação de ácidos graxos ω3 e ω6 melhorou o balanço energético, e não influenciou negativamente os parâmetros produtivos, melhorou a qualidade oocitária e embrionária, bem como a função imune de imune de vacas leiteiras em período de transição e inicio de lactação. / The objective was to evaluate the influence of ω3 and ω6 fatty acid supplementation, on productive performance, metabolic profile, oocyte and embryo quality, immune system function in dairy cows during the transition period and early lactation. Were selected forty-two Holstein cows, and multiparous pregnant with calving provided for 35 days after the beginning of the evaluation and supply of experimental diets. The cows were housed in stable type \"free-stall\", provided with individual stalls. The animals were randomly assigned to one of four experimental treatments provided from 35 before the expected date of calving up to 84 days postpartum: control (n = 11) (C) diet without added fat; flaxseed whole (n = 10) (FW): inclusion of 60 to 80 g / kg DM (source of omega 3); whole raw soybean raw (n = 11) (WS) including 120-160 g / kg MS (source of omega 6), calcium salts of insatured fatty acids (n = 11) (CS): inclusion 24-32 g / kg DM (source of omega 6). The experimental diets had the same concentration of unsaturated fatty acids, but the fatty acid profile of the sources was different. The animals were fed according to the dry matter intake the day before, so as to be maintained orts a percentage of the diet every day, between 5 and 10%. Samples of feeds and orts were collected daily and stored at -20 º C. Weekly samples were collected daily mixed and a sample was taken corresponding to a period of a week in order to measure the intake of dry matter and nutrients. Feces samples were collected on days -28, -14, 21, 42 and 84 days in relation at calving, in order to measure the digestibility of dry matter and nutrients. Milk yield was measured daily and the composition of fat, protein and lactose samples were collected weekly and analyzed fresh. For the fatty acid profile of milk samples were collected weekly and were grouped for analysis of the week 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, totaling 4 points of analysis. The measurement of body weight and body condition score were measured weekly. Blood samples were collected on days -21, -14, -7, calving (+24 hours), 7, 14, 21, 42 and 84 days in relation at calving in order to measure the concentration of plasma metabolites and immune function. The scanning of ovarian structures by ultrasonography was performed from 14th to 72nd day of lactation in order to analyze the dynamics of follicular animals. Follicular aspirations were performed on day 35 ± 7 and 65 ± 7, in order to assess the quantity and quality oocyte and embryo by fertilization \"in vitro\". It was observed higher DMI for the diet FW in relation to CS and WS diets pre-partum. Postpartum was not observed differences in DMI. It was observed higher intake of fat to the FW, WS and CS in the pre and postpartum compared to C diet. There was no difference in dry matter digestibility in pre-and postpartum. It was obtain the highest digestibility of fat to the diet FW in relation to WS and CS diets postpartum. There was no difference in the balance of energy in prepartum. Postpartum was observed better energy balance for diets FW, WS and CS in relation to the C diet. No differences were observed for nitrogen balance in the pre-and postpartum between diets evaluated. It was observed a higher content and yield of milk fat for diet WS in relation to FW and CS, but no difference was observed for milk yield. In the fatty acid profile of milk was obtained higher concentration of C18: 1 trans and CLA cis-9 trans-11 for diet CS in relation the others and higher concentration of C18: 2 for diet WS and CS in relation FW and and C18: 3 for FW diet in relation diets WS and CS. There was no difference in body condition score and body weight in pre-and postpartum. Higher value was observed of glucose in the pre and postpartum diet for FW in relation to CS and WS. It was observed higher concentrations of total cholesterol to the diets FW, WS and CS in relation to Cl diet in postpartum. There was no difference in concentrations of nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate in pre and postpartum. It was observed a shorter total number of follicles and follicles class1 to the C diet compared with diets FW, WS and CS. It was observed a higher number of viable oocytes in aspiration of 65 ± 7 days compared to the 35 ± 7 days of lactation. Obtained the highest number and percentage of viable embryos for FW diet compared to diets CS and WS. There was a higher percentage of leukocytes and monocytes positive for phagocytosis for diets FW, WS and CS compared to the C diet, in pre and postpartum, for neutrophils in pre and postpartum and postpartum monocytes was observed higher percentage of positive cells for FW diet compared to diets CS and WS. It was observed increased expression of cell adhesion CD4 +, CD8 +, CD25 + and CD62L for diets FW, WS and CS in relation to the C diet. For CD14 + was observed increased expression for diets WS and CS in relation to diet FW. The fatty acid supplementation ω3 and ω6 improved energy balance, and did not influence the performance, improved oocyte and embryo quality and immune function of dairy cows in the transition period and early lactation

O presente estudo buscou averiguar a relação de manejos nutricionais diferenciados no terço final de gestação associados ou não ao emprego de gonadotrofinas exógenas no pós-desmame com a manifestação da redução da segunda leitegada em fêmeas suínas. O experimento foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Suínos (VNP-FMVZ-USP) Pirassununga/SP. Foram utilizadas 23 marrãs prenhes, sendo empregado o delineamento experimental inteiramente casualizado em arranjo fatorial de tratamentos, sendo um fator o manejo nutricional a partir de 75 &plusmn; 1,74 dias de gestação, fornecendo-se 2,9 kg/dia de ração de pré-lactação (P; 3.203 kcal EM/kg, 17,25% PB) ou 2,5 kg/dia de ração de gestação (G; 2.930 kcal EM/kg, 16,43% PB) e o segundo a aplicação hormonal - 600UI de eCG e, após 72 horas, 2,5mg de LH porcino - no dia do desmame (H) ou não (C). Semanalmente, entre o 82º dia de gestação e o dia do desmame, se averiguou o peso vivo dos animais e colheram-se amostras de sangue para avaliação de parâmetros de bioquímica sanguínea, sendo as fêmeas abatidas 4,55 ± 0,92 dias após a inseminação artificial pós-desmame para colheita e avaliação de embriões. Fêmeas do tratamento P apresentaram maior ganho de peso diário (p<0,050) em três das cinco semanas do terço final de gestação avaliadas, obtendo maior ganho de peso geral entre o 75º dia de gestação e a avaliação pré parto (p<0,001). Na fase de lactação, o tratamento P apresentou maior perda de peso na 1ª (p=0,038) e 3ª (p=0,061) semanas. Não foram observadas diferenças no tocante ao consumo de ração na lactação, desempenho da leitegada ou retorno a atividade reprodutiva pós-desmame. Na avaliação dos embriões, foi observada interação entre os fatores para a variável porcentagem de estruturas fecundadas (p=0,051), obtendo-se valores de 98,55%, 78,97%, 96,88% e 99,09% para GC, GH, PC e PH, respectivamente. Tal resultado sugere uma participação do estado metabólico sobre a resposta à hormonioterapia, devendo estes mecanismos serem objeto de estudos mais específicos. Animais submetidos ao protocolo hormonal apresentaram maior porcentagem de embriões na fase de mórula (p=0,050). As alterações de qualidade embrionária associadas à utilização de gonadotrofinas exógenas podem estar ligadas a mudanças no desenvolvimento folicular, levando a ovulação de oócitos de qualidade inferior e desenvolvimento alterado dos futuros embriões. Animais alimentados com ração de pré-lactação apresentaram maiores níveis de colesterol total e suas frações (HDL, LDL e VLDL) na fase de gestação, ligados à maior ingestão de nutrientes e substratos energéticos, e maiores concentrações de ácidos graxos não esterificados (AGNE) no momento do parto e durante a lactação, associados à maior mobilização de reservas corporais. No contexto experimental apresentado, pode-se inferir que o catabolismo na fase de lactação, quando moderado e acompanhado de maiores reservas no momento do parto, não interferiu significativamente no desempenho reprodutivo pós-desmame. A indução de quadros mais severos de catabolismo lactacional pode contribuir para o esclarecimento dos reflexos deste estado metabólico sobre a atividade reprodutiva de fêmeas suínas. / The present study evaluated the relationship between different nutritional managements in the last third of gestation associated or not with exogenous gonadotropins hormonal protocol at weaning and the manifestation of second litter reduction in female swine. The experiment was carried out in the Laboratory of Swine Research (VNP-FMVZ-USP) Pirassununga/SP. Twenty three (23) pregnant gilts were used in a completely random factorial design, with one factor being the nutritional management from 75 &plusmn; 1,74 days of gestation onward, feeding animals with 2,9 kg/day of a pre-lactation diet (P; 3.203 kcal ME/kg, 17,25% CP) or 2,5 kg/day of a gestation diet (G; 2.930 kcal ME/kg, 16,43% CP), and the second factor being the hormonal protocol 600IU of eCG and, after 72 hours, 2,5mg of porcine LH administration (H) or not (C) at weaning. Weekly, from day 82 of gestation until weaning, body weight were measured and blood samples were collected for determinations of serum bioquimical parameters. Females were slaughtered 4,55 ± 0,92 days after artificial insemination for embryo collection and evaluation. Animals in the P treatment showed higher body weight gains (p<0,050) un three of the five weeks evaluated in the late gestation, obtaining higher overall weight gain between days 75 of gestation and the pre partum evaluation (p<0,001). In the lactation period, treatment P showed higher weight losses in the 1st(p=0,038) and 3rd(p=0,061) weeks. No differences in feed consumption during lactation, litter performance and post weaning return to reproductive activity were observed. In the embryo evaluation, an interaction between factors was observed for the percentage of fecundated structures (p=0,051), with values of 98,55%, 78,97%, 96,88% e 99,09% for GC, GH, PC e PH, respectively. Such result indicates a effect of the metabolic state on the response to the hormonal therapy, with the need of further studying the mechanisms involved. Animals submitted to the hormonal protocol showed a higher percentage of embryos in the morula stage (p=0,050). Changes in embryo quality associated with the administration of exogenous gonadotropins might be linked to shifts in follicular growth, leading to the ovulation of oocites of lower quality and altered future embryo development. Females fed the pre-lactation diet had higher total cholesterol and fractions (HDL, LDL, VLDL) in the gestation period, which is linked to the higher consumption of energy yielding substances, and higher concentrations of non-sterified fatty acids (NEFA) during farrowing and lactation, which are related to more severe fat mobilization. In the context of the present experiment, the catabolism during lactation, when moderate and accompanied by higher body reserves at farrowing, did not significantly interfere with the post-weaning reproductive performance. The induction of more severe catabolic states might contribute to enhance our knowledge on the effects of this metabolic state on the reproductive outcome of sows.

A hematopoese tem sido bem descrita em modelos murinos nas últimas décadas, contudo, trabalhos demonstrando os mecanismos da hematopoese em humanos ainda são escassos. A derivação da primeira linhagem de células-tronco embrionárias humanas (CTEhs) em 1998, gerou novas perspectivas tanto para o estudo da hematopoese na tentativa de mimetizar o que ocorre naturalmente durante o desenvolvimento embrionário, quanto para a aplicação clínica das células hematopoéticas obtidas a partir da diferenciação dessas células. Contudo, apesar de inúmeros trabalhos terem demonstradoa obtenção de células hematopoéticas a partir de CTEhs, os protocolos têm gerado quantidades variáveis de células, com baixa eficiência e com propriedades funcionais de células primitivas. Desse modo, este trabalho procurou estabelecer um modelo próprio de diferenciação de CTEhs-H1 em células progenitoras hematopoéticas para que estas pudessem ser melhor caracterizadas e obtidas de forma mais eficiente. Para isto, foi desenvolvido um sistema de diferenciação baseado no co-cultivo da linhagem de CTEh-H1 com fibroblastos de embrião de camundongo (MEFs), em meio de diferenciação suplementado soro fetal bovino (SFB) e citocinas e fatores de crescimento hematopoéticos em baixas concentrações. Como resultado, o desenvolvimento do presente trabalho permitiu o estabelecimento de um método para geração de populações mistas de células enriquecidas em CPHs positivas para o marcador CD45, o qual mostrou ser coexpresso com outros marcadores hematopoéticos (CD31, CD43, CD71 e CD38), e células hematopoéticas maduras positivas para marcadores mielóide-específicos (235a, CD14, CD15, CD16) e com características morfológicas típicas. Foi demonstrado que as células obtidas expressavam genes relativos ao sistema hematopoético (CD45, CD31, runx1, tal1, lmo2, prom1, CD34 e notch1), e possuíam potencial clonogênico in vitro da ordem de 1/574 células plaqueadas. Em adição, corroboramos os achados de que as células hematopoéticas apresentam duas origens distintas: a partir do endotelio hemogênico e a partir de células com propriedades hemangioblásticas independentes do endotélio hemogênico. / Hematopoiesis has been well described in murine models in recent decades, however, studies demonstrating the mechanisms of hematopoiesis in humans are still scarce. The first human embryonic stem cells line (hESCs) derived in 1998, has generated new perspectives about the study of hematopoiesis as in attempting to mimic what naturally occurs during embryonic development, as for clinical application of hematopoietic cells obtained from the differentiation of these cells. However, although numerous studies have shown the production of hematopoietic cells derived from hESCs, the protocols have generated varying quantities of cells with low efficiency and functional properties of primitive stem cells. Thus, this study sought to establish our own model for hESC-H1 differentiation in hematopoietic progenitor cells so that they could be better characterized and obtained more efficiently. For this way, we developed a differentiation system based on co-culture of hESC-H1 line with inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFs) in differentiation medium supplemented with fetal calf serum (FCS) and cytokines and hematopoietic growth factors in low concentrations. As a result, the development of this study allowed the establishment of a method for generation of mixed population of cells enriched in hematopoietic progenitor cells positive for the marker CD45, which proved to be co-expressed with other hematopoietic markers (CD31, CD43, CD71 and CD38), and mature hematopoietic cells positive for myeloid-specific markers (235a, CD14, CD15, CD16) and morphological characteristics typical. It was shown that these cells expressed genes related to the hematopoietic system (CD45, CD31, runx1, TAL1, LMO2, prom1, CD34 and NOTCH1), and had clonogenic potential in vitro of 1/574 plated cells. In addition, we corroborate the findings that hematopoietic cells have two distinct origins: they can arise as from an hemogenic endothelium as from cells with hemangioblastic properties by an hemogenic endothelium-independent way.

O transplante de células-tronco hematopoéticas (CTHs) é o tipo mais bem-sucedido de terapia celular realizado até os dias atuais. No entanto, apesar do sucesso e da relevância clínica das CTHs isoladas a partir de fontes adultas, o uso destas células tem algumas limitações em relação à sua disponibilidade, compatibilidade imunológica e risco de contaminação. Desse modo, busca-se o desenvolvimento de soluções para as dificuldades apontadas para suprir a demanda de transplantes. Uma abordagem emergente para superar este problema é baseada na cultura e diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (CTEhs). Estas são célulastronco pluripotentes e indiferenciadas com elevada capacidade de auto-renovação e diferenciação em todas as células derivadas dos três folhetos germinativos. No entanto, os métodos de diferenciação utilizados para a produção de CTHs a partir de células pluripotentes ainda não são eficientes. Os protocolos descritos até o momento têm gerado números variados e populações de células heterogêneas, e produz apenas CTHs muito primitivas e imaturas com baixa capacidade funcional in vivo. Parte desta dificuldade pode decorrer da ineficiência do microambiente de cultura para a diferenciação. Neste trabalho, nós demonstramos um eficiente protocolo de diferenciação hematopoética baseado em cocultivo de CTEhs com fibroblastos embrionários murinos com alto rendimento na geração de célulastronco/progenitoras hematopoéticas (CTPHs) que expressam os antígenos CD45, CD43, CD31 e CD34, e apresentam potencial clonogênico in vitro equivalente ao de células mononucleares isoladas de sangue de cordão umbilical. Nós fomos capazes de produzir todas as células das linhagens eritróide e mielóide em diferentes estágios de maturação, como também células positivas para marcadores linfóides. Demonstramos ainda que as células hematopoéticas surgem no sistema de cultura a partir de um endotélio-hemogênico constituído por células CD34+CD31+. No entanto, apesar das características maduras das CTPHs obtidas por tal método, os ensaios de reconstituição hematopoiética mostraram que estas células ainda possuem limitada capacidade funcional de enxertamento em camundongos imunocomprometidos quando transplantadas por via retro-orbital. / Hematopoietic stem cells (HSC) transplant is the most successful type of cell therapy carried out to date. However, despite the success and the clinical relevance of HSC isolated from adult sources, these cells have some limitations regarding its availability, immunological compatibility and risk of contamination. Thus, we seek to develop solutions to overcome these difficulties to supply the demand for transplants. An emerging approach to overcome this problem is based on human embryonic stem cells (hESCs) culture and differentiation. These are pluripotent and undifferentiated stem cells with high capacity for self-renewal and differentiation in all cells derived from the three embryonic germ layers. However, differentiation methods used for HSC production from pluripotent cells are not efficient yet. Protocols described so far have generated varying numbers and heterogeneous cell populations, and produce only very primitive and immature HSC with low in vivo functional capacity. Part of this difficulty may result from the inefficiency of the microenvironment of culture for differentiation. Here, we demonstrate an efficient protocol based on co-culture of hESCs with mouse embryonic fibroblasts for hematopoietic differentiation with high performance to generate in vitro hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) that express CD45, CD43, CD31 and CD34 antigens with high purity of positive cells. We were able to produce all cells of erythroid and myeloid lineages at different stages of maturation. Lymphoid potential of hematopoietic cells was also evidenced. We demonstrated the primitive origin of hematopoietic cells through capillary-like structures constituted by hemogenic CD34+CD31+ cells. However, despite mature features of HSPCs obtained by our protocol, hematopoietic reconstitution assays showed that these cells have yet limited functional capacity for grafting into immunocompromised mice when exogenously transplanted by retro-orbital route.

Dentre as variações morfológicas possivelmente associadas ao potencial fisiológico das sementes está o tamanho do embrião. Uma das abordagens atuais da pesquisa sobre análise de imagens de sementes radiografadas é verificar até que ponto a relação entre o grau de desenvolvimento embrionário e o espaço disponível na cavidade interna da semente está associada ao desempenho da semente. Os objetivos deste trabalho foram verificar a eficiência de diferentes testes na avaliação do vigor de sementes de algodão ao longo do armazenamento, verificar a possível relação entre o espaço livre na cavidade interna e o potencial fisiológico das sementes durante o armazenamento e verificar se há relação entre o espaço livre e o desempenho de sementes de algodão. Diferentes lotes de sementes de algodão, cultivares BRS 293 e FMT 709, foram armazenados em câmara fria e seca (10 °C e 30% de UR do ar) e em ambiente natural, durante oito meses. As avaliações da germinação e do vigor (primeira contagem de germinação, germinação a baixa temperatura, envelhecimento acelerado tradicional e com solução saturada de NaCl, emergência de plântulas em campo e análise computadorizada de imagens de plântulas - SVIS®) foram realizadas a cada dois meses de armazenamento. Para avaliação do espaço livre, as sementes de cada lote foram radiografadas e analisadas por meio dos softwares Tomato Analyzer e Image-Pro® Plus. Os resultados indicaram que os testes de envelhecimento acelerado (tradicional e com solução saturada de NaCl), emergência de plântulas em campo e SVIS® (comprimento de plântulas) são adequados para avaliação do vigor de sementes de algodão, sendo o envelhecimento acelerado tradicional e as análises SVIS® (comprimento de plântulas) sensíveis para detectar redução no potencial fisiológico das sementes durante o armazenamento. No entanto, a queda do vigor das sementes de algodão não está associada ao espaço livre na cavidade interna das sementes. Contudo, há indícios de uma relação inversamente proporcional entre o espaço livre e a germinação de sementes de algodão. / One of the morphological variations usually referred as associated to seed physiological potential is the embryo size. A primary interest of image analysis of Xrayed seeds is to identify whether the ratio between the degree of embryo development and the available space in the internal seed cavity is related to seed performance. The objectives of this research were to verify the accuracy of different tests to assess the vigor of cotton seeds during storage, to check the possible relationship between the free space and cotton seed physiological potential during storage and to verify if the relationship between the free space and cotton seed performance exist. Cotton seed lots of BRS 293 and FMT 709 cultivars were stored during eight months under two environments: cold and dry chamber (10 °C and 30% relative air humidity) and laboratory non-controlled condition. Evaluations of seed germination and vigor (germination first count, cool germination, traditional and saturated salt accelerated aging, field seedling emergence and seedling imaging automated analysis - SVIS®) were performed at two months intervals during storage. Free space was evaluated in radiographed seeds from each lot using Tomato Analyzer and Image-Pro® Plus softwares. Results showed that the accelerated aging tests (traditional and with saturated NaCl), field seedling emergence and SVIS® (seedling length) are suitable for evaluate the cotton seed vigor and the traditional accelerated aging and SVIS® (seedling length) are sensitive to detect reductions in seed physiological potential during storage. However, the reduction of cotton seed vigor is not associated with the free space in the internal cavity of the seed. Nevertheless, there is evidence of an inverse relationship between the free space and germination of cotton seed.

As proteína quinases C (PKC) pertencem à família das serina/treonina quinases, que vem sendo apontadas como importantes enzimas para os processos de proliferação e diferenciação das células tronco embrionárias (CTE), todavia, a função exata de cada isoforma dessa família ainda não está clara. Dados anteriores do nosso laboratório indicam que dentre as PKCs expressas em CTE, formas cataliticamente ativas da PKC&#946;I são altamente expressas no núcleo das CTE murinas. Estas ao se diferenciarem expressam essa quinase no seu citoplasma ou deixam de expressar a mesma, e que a maioria dos alvos da PKC&#946;I em CTE indiferenciada estão envolvidos em processos de regulação da transcrição de proteínas envolvidas em processos de proliferação/ diferenciação. Dando continuidade aos resultados anteriores do laboratório, no presente trabalho, com técnicas de proteômica e fosfoproteômica identificamos outros alvos nucleares da PKC&#946;I em CTE indiferenciadas. Vimos que de fato inibindo-se a PKC&#946;I diminuiu-se a fostorilação de fatores envolvidos com a indiferenciação das CTE. Dentre os alvos da PKC&#946;I encontramos a proteína adaptadora, TIF1 que recruta proteínas remodeladoras de cromatina. Essa proteína é essencial para a manutenção do estado indiferenciado das CTE. In vitro a PKC&#946;I foi capaz de fosforilar a TIF1&#946; e inibindo-se a PKC&#946;I por RNAi vimos uma diminuição na expressão da TIF1&#946; e no fator de indiferenciação Nanog cuja expressão já foi demonstrada ser regulada pela TIF1&#946;. Além disso vimos que inibindo-se a PKC&#946;I com o peptídeo inibidor da PKC&#946;I aumentou a expressão de proteínas reguladas pelo c-Myc. E que o RNAi para a PKC&#946;I aumentou a expressão de proteínas que regulam a expressão do c-Myc. Não vimos nenhum efeito na fosforilação ou expressão do c-Myc após a inibição da PKC&#946;I o que sugere que a PKC&#946;I ative proteínas repressoras do c-Myc. Nossos estudos sugerem que a PKC&#946;I regula a manutenção do estado indiferenciado das CTE regulando a expressão e atividade da Tif1&#946; um possível alvo direto da PKC&#946;I. Levando a modificações da cromatina e regulação da expressão de genes que mantém as CTE indiferenciadas. Outro ponto de regulação da PKC&#946;I parece ser a nibição da atividade de c-Myc o que seria importante para a manutenção do estado indiferenciado visto que o c-Myc é um amplificador das vias de sinalização que mantém as células proliferando. Desta forma a PKC&#946;I parece ter um papel central na regulação da expressão gênica de CTE à nível de modificações epigenéticas e a nível transcricional mantendo as CTE indiferenciadas. / The Protein kinase C (PKC) family of serine/treonine kinases, are being described as important enzymes for proliferation and diferentiation of embryonic stem cells (ESC), however, the exact function of the different isoenzymes of this family still is unclear. Previous data from our laboratory indicates that amongst the PKCs expressed in ESC, catalytically active forms of PKC&#946;I are highly expressed in nucleus of murine ESC. When these cells differentiate this kinase can be found in the cytoplasm or not expressed at all, and that the majority of PKC&#946;I targets in undifferentiated ESC are involved in the regulation of proteins involved in transcription of proteins involved in proliferation/ diferentiation. Continuing our previous work herewith using proteomics and phosphoproteomics techniques we identified other nuclear PKC&#946;I targets in undifferentiated ESC. We indeed saw that inhibiting PKC&#946;I decreased the phosphorylation of factors involved with maintainance of the undifferentiated state of ESC. Amongst the targets of PKC&#946;I we found the adaptor protein, TIF1&#946;I, that recruits cromatin remodeling proteins. This protein is essential for the maintenance of the undifferentiated state of ESC. In vitro PKC&#946;I phosphorylated TIF1&#946; and inhibiting PKC&#946;I with RNAi decreased the expression of TIF1&#946; and of the undifferentiation factor Nanog whose expression has been shown to be regulated by TIF1&#946;. We also saw that inhibiting PKC&#946;I with a peptide inhibitor increased the expression of proteins regulated by c-Myc, and that RNAi for PKC&#946;I increased the expression of proteins that regulate the expression of c-Myc. We did not see any effect on the phosphorylation or expression of c-Myc after inhibition of PKC&#946;I suggesting that PKC&#946;I activates c-Myc repressor proteins. Our studies sugest that PKC&#946;I regulates the maintenance of the undiferentiated state of ESC regulating the expression and activity of Tif1&#946; a possibly a direct target of PKC&#946;I, leading to chromatin modifications and regulation of genes that maintain ESC undiferentiated. Another form of regulation of PKC&#946;I seems to be by inhibiting the activity of c-Myc which is importante to maintain ESC undifferentiated since c-Myc is na an amplifyer of signaling patheways that maintain ESC proliferating. Together PKC&#946;I has a central role in the regulation of the gene expression of ESC at the level of epigenetic modifications and transcriptional regulation

Introdução. A criopreservação de oócitos é importante, tanto para a tentativa de preservação da fertilidade feminina, como nos tratamentos de reprodução assistida. Hipotetizamos que novas formulações de meios crioprotetores, contendo biomoléculas que participam da estrutura e funcionalidade celular, em particular da função mitocondrial e da dinâmica do sistema de membranas, poderiam melhorar a criotolerância e segurança da vitrificação. Objetivos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do meio padrão de vitrificação (T4) e T4 suplementado com L-carnitina (LC), LC-ácidos graxos (T4-AG) e LC-AGfosfatidilcolina (T4-PC) sobre a sobrevida e qualidade de oócitos criopreservados, mensurada por parâmetros do desenvolvimento in vitro de embriões, como número de núcleos totais (NT), de células na massa celular interna (MCI) e trofectoderma (TE) dos blastocistos oriundos de oócitos vitrificados nestes meios, assim como sobre os padrões de atividade mitocondrial oocitária. Materiais e métodos. Estudo experimental usando o camundongo da cepa C57BL/6 como modelo. Oócitos maturados in vivo, foram distribuídos em 5 grupos: controle a fresco (CT) e 4 grupos vitrificados: T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC. Após a desvitrificação, foi analisada a sobrevida oocitária e os oócitos viáveis foram submetidos a fertilização in vitro ou utilizados para análise da atividade mitocondrial, por meio da análise de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular por Intensidade de Fluorescência emitida pelo diacetato de 2,7- diclorodihidrofluoresceína, metabolismo oxidativo pela autofluorescência de dois fluoróforos endógenos [dinucleótideo de flavina adenina oxidado e o dinucleotideo reduzido de nicotinamida adenina (fosfato)] e potencial de membrana mitocondrial por Intensidade de Fluorescência (IF) emitida pelo JC1. Os oócitos dos 5 grupos submetidos a FIV foram cultivados por 96 horas, sendo comparados entre os grupos: taxa de fertilização e formação de blastocisto, assim como o número de NT, células MCI e TE e tamanho dos blastocistos. Resultados. A taxa de sobrevivência dos oócitos vitrificados em T4 foi superior a dos demais grupos T4-LC, T4-AG e T4-PC (respectivamente 100%, 97,07%, 96,75% e 97,95%). A taxa de fertilização do grupo CT (77,5%) foi superior a dos grupos T4, T4-LC e T4-PC, não diferindo do grupo T4-AG. Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas nas taxas de formação de blastocistos entre os grupos CT, T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC (58,07%, 48,05%, 47,44%, 57,89% e 51,06%,respectivamente). Comparando-se o número NT e de células do TE dos blastocistos, observou-se que o os valores do grupo controle foram maiores do que o dos outros 4 grupos, que não apresentaram diferenças entre si. O número de células da MCI dos blastocistos do grupo controle foi superior ao dos grupos T4 e T4-LC e similar ao dos grupos T4-AG e T4- PC. Para o perfil de atividade mitocondrial, foram analisados 15 oócitos/grupo. Os níveis de EROs foram maiores no grupo CT comparado ao grupo T4 e menor quando comparado aos grupos T4-LC e T4-AG, mas sem diferença significativa em relação ao grupo T4-PC. Para Resumo analise do estado redox, o grupo CT teve maiores valores do que a dos grupos T4, T4-LC e T4- AG e o grupo T4-PC foi maior do que a dos outros quatro grupos. Para o potencial de membrana mitocondrial, o grupo CT teve maiores valores do que a do grupo T4-LC, menor do que a do grupo T4 e sem diferença estatisticamente significativa com a dos grupos T4-AG e T4-PC. Conclusão. O número de NT, células do TE e tamanho do blastocistos foram inferiores nos grupos vitrificados/desvitrificados em meio padrão e suplementados comparados ao controle. Porém, o número de células da MCI não foi diferente entre o grupo controle e os vitrificados T4- AG e T4-PC, sugerindo que a suplementação dos meios padrão com LC, AG e PC possa melhorar a competência do oócito e a subsequente qualidade embrionária, o que precisa ser melhor investigado antes da aplicação clínica dos novos meios. Apesar dos oócitos vitrificados no meio T4 terem apresentado taxa de sobrevivência estatisticamente superior a dos demais grupos, sugerimos que estas diferenças não apresentariam potencial relevância clínica. Os resultados de atividade mitocondrial revelam que há uma diferença importante entre oócitos controle e vitrificados com ou sem suplementos na eficiência da função mitocondrial, regulação do estado redox e controle intracelular das EROs, demonstrando que mais trabalhos são necessários para entender esta via metabólica e os diferentes efeitos dos meios de vitrificação. / Introduction. Cryopreservation of oocytes is important, both for the attempt to preserve female fertility and for assisted reproduction treatments. We hypothesize that novel cryoprotective formulations containing biomolecules that participate in cellular structure and functionality, particularly mitochondrial function and membrane system dynamics, could improve cryotolerance and safety of vitrification. Objeticve. The objective of this study was to investigate the effects of the standard vitrification medium (T4) and T4 supplemented with L-carnitine (LC), LC-fatty acids (T4-AG) and LC-AGphosphatidylcholine (T4-PC) on survival and quality of cryopreserved oocytes, measured by in vitro embryo development parameters, such as number of total nuclei (NT), cells in the internal cell mass (ICM) and trophoectoderma (TE) of the blastocysts derived from vitrified oocytes in these media, as well as on the patterns of oocyte mitochondrial activity. Materials and methods. Experimental study using the C57BL/6 mouse as a model. Matured in vivo oocytes were distributed into 5 groups: fresh (CT) control and four vitrified groups: T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC. After devitrification, oocyte survival was analyzed and viable oocytes were submitted to in vitro fertilization or used for analysis of mitochondrial activity, through the analysis of intracellular reactive oxygen species (ROS) by Fluorescence Intensity emitted by diacetate of 2, 7-dichlorodihydrofluorescein, oxidative metabolism by the autofluorescence of two endogenous fluorophores [oxidized flavin adenine dinucleotide and the reduced dinucleotide of nicotinamide adenine (phosphate)] and mitochondrial membrane potential by Fluorescence Intensity (FI) emitted by JC1. The oocytes of the 5 groups submitted to IVF were cultured for 96 hours, being compared between the groups: fertilization rate and blastocyst formation, as well as number of NT, MCI and TE cells and size of blastocysts. Results. The survival rate of vitrified oocytes in T4 was higher than in the other groups T4-LC, T4-AG and T4-PC (respectively 100%, 97.07%, 96.75% and 97.95%). The fertilization rate of the CT group (77.5%) was higher than that of the T4, T4-LC and T4-PC groups, not differing from the T4-AG group. There were no statistically significant differences in the rates of blastocyst formation between the groups CT, T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC (58.07%, 48.05%, 47.44%, 57.89% and 51.06%, respectively). Comparing the NT and TE cells of the blastocysts, it was observed that the values of the control group were higher than that of the other 4 groups, which did not present differences between them. The number of MCI cells from the blastocysts of the control group was higher than that of the T4 and T4-LC groups and similar to that of the T4-AG and T4-PC groups. For the mitochondrial activity profile, 15 oocytes/group were analysed. The levels of EROs were higher in the CT group compared to the T4 group and lower when compared to the T4-LC and T4-AG groups, but without significant difference in relation to the T4-PC group. For the analysis of the redox state, the CT group had higher values than the T4, T4-LC and T4-AG groups and the T4-PC group was higher than the other four groups. For the mitochondrial membrane potential, the CT group had higher values than the T4-LC group, lower than the T4 group and without a statistically significant difference with the T4-AG and T4-PC groups. Conclusion. The number of NT, TE cells and blastocyst size were lower in the vitrified/devitrified groups in standard medium and supplemented compared to control. However, the MCI cell number was not different between the control group and the vitrified T4-AG and T4-PC, suggesting that the supplementation of the standard media with LC, GA and CP could improve oocyte competence and subsequent embryo quality, which needs to be better investigated before the clinical application of the new media. Although vitrified oocytes in the T4 medium had a statistically higher survival rate than the other groups, we suggested that these differences would not present potential clinical relevance. The results of mitochondrial activity reveal that there is an important difference between control and vitrified oocytes with or without supplements in the efficiency of mitochondrial function, regulation of the redox state and intracellular control of ROS, demonstrating that more work is needed to understand this metabolic pathway and the different effects of the vitrification media.

As proteína quinases C (PKC) pertencem à família das serina/treonina quinases, que vem sendo apontadas como importantes enzimas para os processos de proliferação e diferenciação das células tronco embrionárias (CTE), todavia, a função exata de cada isoforma dessa família ainda não está clara. Dados anteriores do nosso laboratório indicam que dentre as PKCs expressas em CTE, formas cataliticamente ativas da PKC&#946;I são altamente expressas no núcleo das CTE murinas. Estas ao se diferenciarem expressam essa quinase no seu citoplasma ou deixam de expressar a mesma, e que a maioria dos alvos da PKC&#946;I em CTE indiferenciada estão envolvidos em processos de regulação da transcrição de proteínas envolvidas em processos de proliferação/ diferenciação. Dando continuidade aos resultados anteriores do laboratório, no presente trabalho, com técnicas de proteômica e fosfoproteômica identificamos outros alvos nucleares da PKC&#946;I em CTE indiferenciadas. Vimos que de fato inibindo-se a PKC&#946;I diminuiu-se a fostorilação de fatores envolvidos com a indiferenciação das CTE. Dentre os alvos da PKC&#946;I encontramos a proteína adaptadora, TIF1 que recruta proteínas remodeladoras de cromatina. Essa proteína é essencial para a manutenção do estado indiferenciado das CTE. In vitro a PKC&#946;I foi capaz de fosforilar a TIF1&#946; e inibindo-se a PKC&#946;I por RNAi vimos uma diminuição na expressão da TIF1&#946; e no fator de indiferenciação Nanog cuja expressão já foi demonstrada ser regulada pela TIF1&#946;. Além disso vimos que inibindo-se a PKC&#946;I com o peptídeo inibidor da PKC&#946;I aumentou a expressão de proteínas reguladas pelo c-Myc. E que o RNAi para a PKC&#946;I aumentou a expressão de proteínas que regulam a expressão do c-Myc. Não vimos nenhum efeito na fosforilação ou expressão do c-Myc após a inibição da PKC&#946;I o que sugere que a PKC&#946;I ative proteínas repressoras do c-Myc. Nossos estudos sugerem que a PKC&#946;I regula a manutenção do estado indiferenciado das CTE regulando a expressão e atividade da Tif1&#946; um possível alvo direto da PKC&#946;I. Levando a modificações da cromatina e regulação da expressão de genes que mantém as CTE indiferenciadas. Outro ponto de regulação da PKC&#946;I parece ser a nibição da atividade de c-Myc o que seria importante para a manutenção do estado indiferenciado visto que o c-Myc é um amplificador das vias de sinalização que mantém as células proliferando. Desta forma a PKC&#946;I parece ter um papel central na regulação da expressão gênica de CTE à nível de modificações epigenéticas e a nível transcricional mantendo as CTE indiferenciadas. / The Protein kinase C (PKC) family of serine/treonine kinases, are being described as important enzymes for proliferation and diferentiation of embryonic stem cells (ESC), however, the exact function of the different isoenzymes of this family still is unclear. Previous data from our laboratory indicates that amongst the PKCs expressed in ESC, catalytically active forms of PKC&#946;I are highly expressed in nucleus of murine ESC. When these cells differentiate this kinase can be found in the cytoplasm or not expressed at all, and that the majority of PKC&#946;I targets in undifferentiated ESC are involved in the regulation of proteins involved in transcription of proteins involved in proliferation/ diferentiation. Continuing our previous work herewith using proteomics and phosphoproteomics techniques we identified other nuclear PKC&#946;I targets in undifferentiated ESC. We indeed saw that inhibiting PKC&#946;I decreased the phosphorylation of factors involved with maintainance of the undifferentiated state of ESC. Amongst the targets of PKC&#946;I we found the adaptor protein, TIF1&#946;I, that recruits cromatin remodeling proteins. This protein is essential for the maintenance of the undifferentiated state of ESC. In vitro PKC&#946;I phosphorylated TIF1&#946; and inhibiting PKC&#946;I with RNAi decreased the expression of TIF1&#946; and of the undifferentiation factor Nanog whose expression has been shown to be regulated by TIF1&#946;. We also saw that inhibiting PKC&#946;I with a peptide inhibitor increased the expression of proteins regulated by c-Myc, and that RNAi for PKC&#946;I increased the expression of proteins that regulate the expression of c-Myc. We did not see any effect on the phosphorylation or expression of c-Myc after inhibition of PKC&#946;I suggesting that PKC&#946;I activates c-Myc repressor proteins. Our studies sugest that PKC&#946;I regulates the maintenance of the undiferentiated state of ESC regulating the expression and activity of Tif1&#946; a possibly a direct target of PKC&#946;I, leading to chromatin modifications and regulation of genes that maintain ESC undiferentiated. Another form of regulation of PKC&#946;I seems to be by inhibiting the activity of c-Myc which is importante to maintain ESC undifferentiated since c-Myc is na an amplifyer of signaling patheways that maintain ESC proliferating. Together PKC&#946;I has a central role in the regulation of the gene expression of ESC at the level of epigenetic modifications and transcriptional regulation

As células-tronco são capazes de se diferenciarem em praticamente todos os tipos celulares, podendo ser utilizadas em terapias de substituição em várias doenças. Células de linhagens hepáticas embrionárias e fetais pode ser uma fonte importante para a terapia celular em indivíduos com doenças hepáticas, pois possuem um alto índice de diferenciação em hepatócitos e células do ducto biliar. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial e o controle da resposta proliferativa de células do broto hepático de ratos Fischer 344 em cultura. A obtenção das células do broto hepático foi realizada nos períodos 12,5; 14,5 e 16,5 dias de gestação e os fragmentos foram cultivados em meio DMEM-F12. A caracterização morfológica foi realizada em microscopia invertida de luz e eletrônica de varredura. A caracterização dos marcadores de células mesenquimais, do citoesqueleto, progressão e fases do ciclo celular, morte celular, e do potencial elétrico mitocondrial foram realizadas por citometria de fluxo. A função bioquímica foi realizada pela análise das transaminases hepáticas e pela produção de radicais livres lipoperoxidados. Os resultados encontrados no acasalamento dos ratos isogênicos da linhagem Fischer 344 seguiu o protocolo de 12 h de luz, alcançando o índice reprodutivo satisfatório e reprodutível. O isolamento e separação do broto hepático desta linhagem de ratos permitiu a obtenção, expansão e caracterização de uma cultura primária nos diferentes dias de gestação 12,5; 14,5 e 16,5. Os aspectos morfológicos encontrados foram de células fusiformes do tipo fibroblast-like para todos os períodos de gestação em cultura. As análises das transaminases hepáticas TGO e TGP, mostraram se em concentrações menores no período 12,5 dias de gestação. A expressão dos marcadores de células-tronco de origem mesenquimais (CD90, Nanog, Oct ¾ e STRO1), marcadores do citoesqueleto (CK8, CK18 e Desmina), marcadores envolvidos na checagem e progressão do ciclo celular (P53, P21, P27 e Ciclina D1) e marcadores envolvidos na morte celular (Anexina V/PI, Caspase 3, Bax, Bad e Bcl2) mostraram diferencialmente expressos, nos diferentes períodos gestacionais. A análise do potencial elétrico mitocondrial nos períodos de gestação de 14,5 e 16,5 dias, foi maior na proporção de células inativas com menor capacidade funcional ou metabólica, quando comparada ao período de 12,5 dias ou mesmo em relação ao hepatócito normal de um rato adulto. Análise das fases do ciclo celular observou-se uma concentração de célula na fase G0/G1, repercutindo na modulação da capacidade de proliferação e aumento na proporção de células com DNA fragmentado, nas CBH no período de 16,5 dias em comparação aos demais períodos e ao hepatócito normal. O aumento da fragmentação do DNA em média de 3,5 e 2,3 vezes, respectivamente nos períodos de 12,5 e 14,5 dias de gestação. A capacidade de síntese e de divisão celular das CBH foi mantida em todos os períodos de gestação. Os radicais livres lipoperoxidados mostraram quantidades insignificantes em CBH nos diferentes dias de gestação. / Stem cells are able to differentiate into virtually all cell types and can be used in replacement therapies in various diseases. Cells of embryonic and fetal liver lines can be an important source for cell therapy in patients with liver disease because they have a high rate of differentiation into hepatocytes and biliary duct cells. The aim of this study was to evaluate the potential and control of the proliferative response of liver bud cells during the maturation of hepatocytes in culture. The acquirement of liver bud cells was performed for 12.5, 14.5 and 16.5 days of gestation and the fragments were cultured in DMEM-F12. Morphological characterization was performed on inverted light microscopy and scanning electron microscopy. The characterization of mesenchymal cell markers, cytoskeleton, and progression stages of the cell cycle, cell death and mitochondrial electric potential were performed by flow cytometry. The biochemical function was performed by analysis of liver transaminases and the production of free radicals lipoperoxidados. The results found in rats\' mating isogenic Fischer 344 followed the protocol of 12 hours of light reaching the reproductive rate satisfactory. The isolation and separation of the liver bud of this strain of mice allowed the isolation, expansion and characterization of a primary culture at different days of gestation, 12.5, 14.5 and 16.5 days. The morphological features were found of spindle cell type to fibroblast-like cells of the liver bud in culture. Analyses of hepatic transaminases GOT and GPT showed lower concentrations in the period 12.5 days of gestation. The expression of stem cell markers of mesenchymal origin (CD90, Nanog, Oct STRO1 and ¾), cytoskeletal markers (CK8, CK18 and desmin) markers involved in checking and cell cycle progression (P53, P21, P27 and Cyclin D1) and markers involved in apoptosis (Annexin V / PI, caspase 3, Bax, Bad and Bcl2) showed differentially expressed in different gestational periods. In the analysis of mitochondrial electrical potential in the gestation periods of 14.5 and 16.5 days, it was observed the higher proportion of quiescent cells with lower metabolic of functional capacity when compared to the periodo of 12.5 days or even compared to a normal hepatocyte adult rat. In the analysis of cell cycle phases it was observed the concentration of cell in the G0/G1 phase, resulting in modulation of proliferation capacity and the increase in the proportion of cells with fragmented DNA, CBH in the period 16.5 days compared to other periods and the normal hepatocyte. The increase of DNA fragmentation on average 3.5 and 2.3 times respectively in the periods of 12.5 and 14.5 days of gestation. The synthesis and cellular division of CBH was maintained in all stages of pregnancy. The free radicals lipoperoxidados showed insignificant amounts of CBH in the days of gestation.