Este estudo analisou a expressão gênica e o conteúdo protéico do fator Cripto 1 (Cr1) na interface materno-placentária ao longo da gestação através de RT-PCR e Western blotting. Nossos resultados mostraram que a proteína Cr1 está presente ao longo do desenvolvimento placentário nos dois compartimentos da interface materno-placentária. Houve aumento progressivo da proteína no compartimento fetal e, na decídua um decréscimo após o dia 13,5 de gestação, mas ainda com valores mais altos do que os da porção fetal da placenta. As avaliações semi-quantitativas de Cr1 por PCR indicaram uma baixa expressão nas fases de pós-implantação e final da gestação nos dois compartimentos estudados, com um aumento significativo nos dias 10,5 e principalmente no dia 13,5 de gestação. A presença de Cr1 na interface materno-placentária indica um papel relevante para este fator, possivelmente no desenvolvimento placentário ou ainda nos muitos processos que se desenvolvem neste sítio e que são essenciais para sua manutenção e sucesso gestacional. / This study analyzed the gene expression and protein content of Cripto 1 (Cr1) at the maternal-placental interface during gestation, through RT-PCR and Western Blotting. Our results showed that the protein Cr1 is present during placental development in both compartments of the maternal-placental interface. The content gradually increased at the fetal compartment, decreased at the decidua after day 13.5 of gestation, but nevertheless, as high values in comparison with those at the fetal compartment. The semi-quantitative evaluations of Cr1 through PCR indicated low expression at the post-implantation and final gestational periods in both compartments, showing a significant increase on day 10.5 and mainly 13.5 of gestation (p<0,05). The presence of Cr1 at the maternal-placental interface indicates a relevant role played by this factor, possibly during placental development or, yet, in the processes developed in this particular site and that are essential for gestational maintenance and success.

This retrospective study compared rates of fertilization, cleavage and quality of human embryos obtained by intracytoplasmic sperm injection (ICSI), with sperm from ejaculate, epididymis and testis. A total of 398 cycles of patients with some kind of male infertility were included and 3991 oocytes were inseminated. The spermatozoa from epididymis and testis were surgically obtained. Fertilization and cleavage rates with sperm from ejaculate (75% and 73%, respectively) were higher (P<0,0001) than those with sperm from the testis (59,7% e 56,8%, respectively) and from epididymis (61,9% e 59,3%). The production of viable embryos (grade I and II) was higher (P=0,0135) when the oocytes where inseminated with ejaculate sperm (89,4%) in relation to sperm from epididymis (82,9%) and testis (85,7%).The percentages of pregnancy were not different among groups (37,8% EJAC group, 27,6% EPID and 36,8% TEST group). In conclusion, sperm from ejaculate have a higher production of viable embryos. However, when sperm from the testis and epididymis are used for ICSI, the production of viable embryos is also considerable and can be seen as success in the assisted reproduction techniques. / Este estudo retrospectivo avaliou as taxas de fertilização, clivagem e qualidade de embriões humanos obtidos através da injeção intracitoplasmática (ICSI) de espermatozóides provenientes do ejaculado, epidídimo ou testículo. Foram incluídos 398 ciclos de pacientes que apresentaram algum tipo de infertilidade masculina, sendo inseminados 3991 oócitos. Os espermatozóides do epidídimo e do testículo foram recuperados cirurgicamente. As taxas de fertilização e de clivagem com espermatozóides do ejaculado (74,5% e 73%, respectivamente) foram maiores (P<0,0001) do que as do testículo (59,7% e 56,8%, respectivamente) e do epidídimo (61,9% e 59,3%). A produção de embriões viáveis (grau I e II) foi maior (P = 0,0135) quando os oócitos foram inseminados com espermatozóides do ejaculado (89,4%), em relação ao epidídimo (82,9%) e testículo (85,7%). As taxas de gestação não foram diferentes entre os grupos (37,8% no grupo EJAC, 27,6% EPID e 36,8% no grupo TEST). Em conclusão, espermatozóides do ejaculado produzem um maior número de embriões viáveis, com maiores taxas de fertilização e de clivagem. Entretanto, quando utilizados espermatozóides do epidídimo e do testículo na ICSI, a produção de embriões viáveis é considerável, obtendo êxito nas técnicas de reprodução assistida.

Algumas das estratégias utilizadas para entender a biologia de células tronco embrionária (CTE) são baseadas na identificação de cascatas de sinalização que induzem a diferenciação e auto-renovação das CTE através da interferência seletiva de processos específicos. A família das proteínas quinase C (PKC) é conhecida por participar dos processos de auto-renovação e diferenciação celular em CTE, entretanto, o papel específico das diferentes isoenzimas das PKCs ainda precisa ser elucidado. Desta forma investigamos. o papel das PKCs atípicas (aPKCs) em CTE indiferenciadas utilizando um inibidor específico para estas serina/ treonina quinases, o peptídeo pseudossubstrato das aPKCs, e fosfoproteômica. A maioria das proteinas identificadas cuja fosforilação reduziu após o tratamento com o inibidor das aPKC, são proteínas envolvidas com o metabolismo principalmente com a via glicolítica. Além disso, a inibição das aPKCs levou a redução do consumo de glicose, secreção de lactato, acompanhada da redução da atividade da lactato desidrogenase, e aumento da fosforilação oxidativa, sendo analisada através do consumo de oxigênio após o tratamento com oligomicina e FCCP. Verificamos também que as aPKCs são capazes de fosforilar diretamente a piruvato quinase. A glicólise aeróbica parece ser fundamental para a manutenção da indiferenciação das CTE, e demonstramos que as aPKCs participam deste processo auxiliando na auto-renovação das CTE indiferenciadas. Também observamos que as aPKCs assim como a PKC&#946;I modulam a fosforilação da &#945;-tubulina, porém ao passo que as aPKCs interagem com a &#945;-tubulina durante a interfase, a PKC&#946;I interage com a mesma apenas durate a mitose. Estes resultados motivaram a segunda parte da tese, na qual o papel da fosforilação da &#945;-tubulina pela PKC&#946;I foi investigado. O resíduo de treonina 253, conservado em diversas espécies de vertebrados e localizado na interface de polimerização entre a &#945;- e a &#946;-tubulina foi identificado, como um novo sítio de fosforilação da &#945;-tubulina pela PKC&#946;I. Este sítio não está em um consenso linear para a PKC, entretanto é um consenso formado estruturalmente, onde aminoácidos básicos distantes na sequência linear se tornam justapostos na estrutura terciária da proteína. Estudos de simulação por dinâmica molecular demonstraram que a interação entre a &#945; e &#946;-tubulina aumenta após esta fosforilação, uma vez que T253 fosforilada passa a interagir com K105, um residuo conservado na &#946;-tubulina. A fosforilação in vitro de &#945;-tubulina aumenta a taxa de polimerização da tubulina e a inibição da PKC&#946;I em células reduziu a taxa de repolimerização do microtubulo após o tratamento com nocodazol. Além disso, a importância da fosforilação deste sítio foi demonstrada pelo fato de que um mutante fosfomimético GFP-&#945;-tubulina, T253E ser mais incorporado no fuso mitótico ao passo que T253A foi menos incorporado do que a proteína selvagem. Nossos dados suportam a hipótese que os consensos estruturais formados podem ser importantes sítios de reconhecimento pelas quinases e que a fosforilação de T253 da &#945;-tubulina afeta a estabilidade do polímero. Em conclusão, utilizando métodos de fosfoproteômica e interferência seletiva de vias de sinalização, combinados a validações experimentais dos alvos identificados podemos propor a importância funcional das aPKCs e PKC&#946;I em CTE indiferenciadas. / Some of the strategies used to understand stem cell biology are based on the identification of signalling cascades that lead to differentiation and self-renewal of embryonic stem cells (ESC) by selective interference of specific signalling processes. The protein kinase C (PKC) family is known to participate in ESC self-renewal and differentiation, however, the specific role of the different PKC isoenzymes in these cells remains to be determined. Therefore, we investigated the role of atypical PKCs (aPKC) in undifferntiated ESC using a specific inhibitor for these serine/ threonine kinases, pseudo-substrate peptide of aPKCs, and phosphoproteomics. The majority of proteins whose phosphorylation decreased upon aPKC inhibition, are proteins involved in metabolism in particular with the glycolytic pathway. Besides that, inhibiton of aPKCs led to a decrease in glucose uptake and lactate secretion, followed by a decrease in lactate dehydrogenase activity, and an increase in mitochondrial activity as measured by oxygen consumption after treatment with olygomycin and a chemical uncoupler. We also verified that aPKCs are able to directly phosphorylated pyruvate kinase. Aerobic glicolysis seems to be fundamental for the maintainance of undifferentiated ESC, and we demonstrated that aPKCs participte in these processes helping to maintain self-renewal of undifferentiated ESC. We also observed that aPKCs as PKC&#946;I modulate the phosphorylation of &#945;-tubulin, however, while aPKCs interact with &#945;-tubulin during interfase PKC&#946;I interacts with &#945;-tubulin only during mitosis. These results lead to the second part of this thesis. We investigated the role of &#945;-tubulina phosphorylation by PKC&#946;I. Indentifying threonine 253, a conserved residue in several vertebrate species, of localized at the polymerization interface between &#945;- and &#946;-tubulin, as a phosphorylation site of &#945;-tubulin by PKC&#946;I. This site is not in a linear consensus for PKC, however, it is in a structuraly formed consensus, where basic aminoacids distant in the linear sequence are juxtaposed in the three dimentional protein structure. Simulation studies by molecular dynamics show that the interaction between &#945; and &#946;-tubulin increases upon this phosphorylation, once, phosphorylated T253 interacts with com K105, a conserved residue in &#946;-tubulin. The in vitro phosphorylation of &#945;-tubulin increased tubulin polymerization rate and inhibiton of PKC&#946;I in cells reduced repolimeration rate of microtubles upon treatment with nocodazole. Besides that, the importance of this phosphorylation site were demonstrated by the fact that a phosphomimetic mutant GFP-&#945;-tubulina, T253E is more incorporated in mitotic fuses while T253A is less than wild type. Our data support the hypothesis that structural consensus may be important sites recognized and that T253 phosphorylation of &#945;-tubulin afects the polymer stability. In conclusion, using phosphoproteomics methods and selective interference of signal transduction pathways combined with experimental validation studies of the identified targets we can propose roles for aPKCs and PKC&#946;I in undifferentiated ESC.

Justificativa: Falhas recorrentes de implantação (FRI) são uma fonte de grande frustração para pacientes e especialistas que, frequentemente buscam intervenções com o objetivo de atingir resultados favoráveis. A prevalência exata dessa condição é de difícil estimativa, uma vez que existem diversas definições para caracterizá-la. Diversas intervenções que visam a melhora dos resultados reprodutivos dessas pacientes já foram propostas. Entretanto, nenhuma revisão sistematizada abordou, simultaneamente, todas as potenciais estratégias para esse grupo de mulheres. Dessa forma, a eficácia e a segurança dessas intervenções não são bem definidas. Devido ao alto número de intervenções descritas para esse fim, julgamos que uma metanálise que as contemple de forma abrangente é importante para casais, especialistas e pesquisadores do assunto. Objetivos: Avaliar a eficácia e segurança das intervenções que visam a melhora do resultado reprodutivo das pacientes com FRI submetidas a um novo tratamento de reprodução assistida. Métodos de busca: As buscas por estudos randomizados e controlados, publicados e em andamento, foram realizadas nas principais bases de dados eletrônicas. Adicionalmente, as listas de referências de estudos incluídos e revisões semelhantes foram avaliadas pelos autores. A última busca eletrônica foi realizada em fevereiro de 2018. Critérios de Elegibilidade: Foram considerados elegíveis apenas os estudos verdadeiramente randomizados que comparassem quaisquer intervenções destinadas a esse grupo depacientes. No presente estudo, consideramos como FRI a história de duas ou mais falhas prévias. Extração e análise de dados: Dois autores realizaram, individualmente, a seleção de estudos, extração de dados e análise do risco de viés. Discordâncias foram resolvidas em consulta a um terceiro autor. Os pesquisadores de estudos potencialmente elegíveis foram contatados sempre que necessário para obtenção de informações adicionais. Resultados: Foram identificados 2794 registros; desses, 62 estudos foram incluídos, representando uma população de 9308 pacientes, submetidas a 26 intervenções diferentes. Informações sobre 24 intervenções e 8461 pacientes foram submetidas à análise quantitativa. Não há evidências de alta ou moderada qualidade de que alguma dessas intervenções seja realmente eficaz para a melhora dos resultados reprodutivos de pacientes com FRI. As seguintes intervenções se mostraram benéficas: assisted hatching, injúria endometrial, histeroscopia, uso de FSH urinário + recombinante para estimulação endometrial e administração intrauterina de hCG. Porém as evidências são de baixa qualidade, o que nos traz incerteza em relação aos seus reais efeitos. Todas as outras intervenções identificadas não permitiram nenhuma outra conclusão adicional, uma vez que as evidências foram avaliadas como de muito baixa qualidade ou não foram encontrados estudos randomizados que as tivessem avaliado. Conclusões: Evidências de ensaios clínicos randomizados não sustentam o uso de nenhuma intervenção para a melhora dos resultados reprodutivos de pacientes com FRI. Todos os achados foram julgados como de baixa ou muito baixa qualidade, o que nos traz incerteza quanto aos seus reais efeitos na prática clínica. Deve-se estar ciente de que o emprego de tais intervenções impõe despesas e riscos adicionais para as pacientes. Além disso, a falta de critérios universalmente aceitos para odiagnóstico de falha recorrente de implantação é uma importante limitação para o avanço do conhecimento sobre essa condição / Background: Recurrent implantation failure (RIF) is a source of deep frustration to couples and clinicians, who often look for interventions to improve the reproductive outcomes. Its exact prevalence is difficult to determine because there are several definitions used to describe the condition. Several interventions aiming to improve reproductive outcomes for such patients have been studied. However, there are no systematic reviews that focus on all potential interventions for improving reproductive outcomes in women with RIF undergoing assisted reproduction techniques. The efficacy and safety of these interventions are not clear. Because of the large number of potential interventions for this condition, it would be very difficult to be aware of the current evidence for all of them. We believe this systematic review is important for subfertile couples, clinicians and researchers. Objectives: To assess the efficacy and safety of interventions designed to improve reproductive outcomes in women with RIF undergoing ART. Search methods: We searched for randomised controlled trials (RCT) in electronic databases (Cochrane Gynaecology and Fertility Group (CGF), The Cochrane Central Register of Controlled Trials, MEDLINE Ovid, EMBASE Ovid, PsycINFO, PsycINFO Ovid, CINAHL, LILACS), trials registers (ClinicalTrials.gov, ISRCTN registry, The WHO International Clinical Trials Registry Platform, World Health Organization International Clinical Trials Registry Platform) and grey literature (OpenGrey); in addition, we handsearched the reference lists of included studies and similar reviews. We performed the last electronic search on 22 Feb 2018.Selection criteria: We considered eligible only truly randomised controlled trials comparing any intervention designed to improve outcomes in women with repeat implantation failure (RIF) compared to other intervention, placebo or no treatment. For study selection, we defined RIF as two or more previous failures Data collection and analysis: Two authors independently performed study selection, data extraction, and assessment of the risk of bias. Any disagreements were solved by consulting a third review author. Study\'s authors were contacted whenever needed to solve any queries. Results: the search retrieved 2794 records; from those, sixty-two studies were included, comprising 9308 participants, submitted to 26 different interventions. Data from 24 interventions and 8461 participants were pooled for quantitative analysis. We found no high or even moderate quality evidence that any of the tested interventions are really effective to improve reproductive outcomes of women with RIF undergoing a new IVF treatment. We observed low-quality evidence of benefit for women with RIF with the following interventions: assisted hatching, endometrial Injury, hysteroscopy, the use of human + recombinant FSH for ovarian stimulation and intrauterine hCG administration. All the other listed interventions did not allow any further conclusion: either very low-quality evidence or no evidence from RCTs. Conclusions: Evidence from RCTs does not support the use of any specific intervention for improving reproductive outcomes in women with RIF. All evidences were deemed of low to very low quality, which makes us uncertain of their real effectiveness on clinical practice. One should be aware that the employment of such interventions imposes additional expenses and risks. Additionally, the lack of universally accepted criteria for recurrent implantation failure is an important limitation for the advance of knowledge regarding this condition.More studies are needed to evaluate their real effect. Maybe even more importantly is to create universally accepted criteria for defining implantation failure; only them one will be able to test interventions for this specific group

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição pré-concepcional de curta duração às partículas de exaustão do diesel (PED) e à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana, o desenvolvimento embrionário inicial e resultado gestacional utilizando um modelo experimental e um epidemiológico. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar os efeitos de dois meios de cultura comerciais no desenvolvimento de oócitos de camundongo fertilizados in vitro até o estágio de blastocisto. Zigotos obtidos de fêmeas de camundongo de 8 semanas de idade submetidas à indução da ovulação foram cultivados in vitro até o estágio de blastocisto em meio simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) ou meio G1/G2. A porcentagem de zigotos que se desenvolveu até o estágio de blastocisto 96 e 120 horas após a inseminação e que sofreu eclosão parcial ou completa no quinto dia de cultivo foi significativamente maior no grupo KSOM. O número médio de células da massa celular interna (MCI) foi 11,7 ± 4,0 e 9,2 ± 5,2 para os zigotos cultivados nos grupos KSOM e G1/G2, respectivamente, mostrando um número significativamente maior de células MCI em blastocistos derivados da cultura no meio KSOM. Concluímos que o meio KSOM comercialmente disponível é superior ao meio seqüencial G1/G2 para o cultivo de zigotos até o estágio de blastocisto no modelo de fertilização in vitro (FIV) em camundongos. No segundo projeto que compõe esta tese, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição de curta duração às PED sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais utilizando o modelo de FIV em camundongo. A instilação intranasal de água destilada (grupo controle), de PED nativas (grupo PED-N) ou de PED ácidoextraídas (grupo PED-AE), realizada uma vez ao dia por três dias, iniciada no primeiro dia de administração de gonadotrofinas, foi realizada em fêmeas de camundongo com oito semanas de idade. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a resposta ovariana a estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e trofoectoderma (TE), e a morfologia da MCI. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariado para a exposição às PED-N e PED-AE na coloração diferencial de blastocistos e na morfologia da MCI, mas não para a FIV ou desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular da MCI e a razão MCI/TE em blastocistos produzidos no grupo controle foram significativamente maiores do que em blastocistos produzidos nos grupos PED-N e PED-AE. O número total de células dos blastocistos foi similar entre os grupos. O escore que representa a morfologia da massa celular interna foi significativamente maior no grupo controle quando comparado àquele encontrado nos grupos PED-N e PEDAE. Baseando-se nesses resultados, nosso estudo sugere que a exposição de curta duração às PED pode afetar negativamente o processo reprodutivo através do distúrbio da especificação das linhagens celulares do embrião em estágio de blastocisto. Finalmente, a exposição a toxinas ambientais pode ser inevitável durante o período pré-concepcional em grandes centros urbanos e seus efeitos são desconhecidos. Portanto, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi avaliar os potenciais efeitos da exposição de curta duração à poluição ambiental particulada durante a fase folicular sobre os resultados clínicos, laboratoriais e gestacionais de casais submetidos à fertilização in vitro e transferência de embriões (FIVETE). Trezentos e quarenta e oito mulheres submetidas ao seu primeiro ciclo de FIVETE foram avaliadas retrospectivamente neste estudo coorte, casocontrole casado. A exposição ao material particulado ambiental (MP) durante a fase folicular de cada paciente foi estimada baseando-se em dados da poluição ambiental (1997-2006) categorizados em período Q1-3 ( 56,72 g/m3) e Q4 (>56,72 g/m3). Desse grupo, 177 pacientes que engravidaram (casos) foram comparadas com 354 mulheres que conceberam espontaneamente (controles). Os principais pontos de avaliação incluíram a resposta ovariana às gonadotrofinas, o número de oócitos recuperados e as taxas de fertilização, de clivagem, de qualidade embrionária, de implantação, de gestação, de abortamento e de nascidos vivos. Nenhum efeito da exposição a níveis elevados de MP durante a fase folicular foi observado nos resultados clínico e laboratorial, na transferência embrionária ou no sucesso dos ciclos de tratamento das pacientes submetidas à FIVETE. Mulheres expostas ao período Q4 durante a fase folicular do ciclo de concepção apresentaram um risco significativamente maior de abortamento, independentemente do método de concepção (razão de chance: 2,58; intervalo de confiança de 95%: 1,63 4,07), quando comparado àquele de mulheres expostas ao período Q1-3. O risco de perda da gestação aumentou 3% por unidade de aumento do valor médio do MP na fase folicular (p= 0,000). Os resultados apresentados aqui fornecem evidências para uma relação causal entre a breve exposição a níveis elevados de MP ambiente durante o período pré-concepcional e a perda gestacional inicial, independentemente do método de concepção e está associada a um aumento de 2,6 vezes no risco de abortamento. Apesar da ausência de efeitos dessa exposição sobre os resultados clínicos e laboratoriais e sobre o sucesso do tratamento, a FIVETE foi incapaz de reduzir esse risco / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of short-term preconceptional exposure to diesel exhaust particles and particulate air pollution on ovarian function, early embryo development and pregnancy outcome using experimental and epidemiological models. The objective of the first project was to examine the effects of two commercial media on the development of mouse ova fertilized in vitro to the blastocyst stage. One-cell embryos obtained from eight-week old superovulated mice were cultured in vitro up to the blastocyst stage in potassium-enriched simplex optimized medium (KSOM) or G1/G2 media. The percentage of zygotes that developed to the blastocyst stage 96 and 120 hours after insemination and that partially or completely hatched by day five of culture was significantly higher in the KSOM group. The mean number of inner cell mass (ICM) cells was 11.7 ± 4.0 and 9.2 ± 5.2 for zygotes cultured in KSOM and G1/G2 groups respectively, revealing a significantly higher cell number in the ICM of blastocysts derived from culture in KSOM medium. I concluded that commercially available KSOM medium is superior to sequential G1/G2 media for culturing one-cell embryos up to the blastocyst stage in the mouse IVF model. In the second project the objective was to evaluate the effects of short-term exposure to diesel exhaust particles on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the mouse IVF model. Intranasal instillation of distilled water (control group), native diesel exhaust particles (N-DEP group) or acid-extracted diesel exhaust particles (AE-DEP) once a day, for three days starting on the first day of gonadotrophin administration was performed on eight-week old female mice. Reproductive endpoints evaluated included ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and trophectoderm (TE), and ICM morphology. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for exposure to NDEP and AE-DEP on blastocyst differential staining and ICM morphology but not on IVF or embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the control group were significantly higher than in blastocysts produced in N-DEP and AE-DEP groups. The total cell count was similar among groups. The score that represents ICM morphology was significantly higher in the control group when compared to that found in N-DEP and AE-DEP groups. Based on these results this study suggests that short-term exposure to DEP may negatively affect the reproductive process by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, exposure to environmental toxins may be unavoidable during the preconceptional period in large urban centers and its effects are unknown. Thus, the purpose of the third project was to assess the potential effects of short-term exposure to particulate air pollution during the follicular phase on clinical, laboratory, and pregnancy outcomes for couples undergoing IVF/ET. Three hundred forty-eight patients undergoing their first IVF/ET cycle were evaluated in this retrospective cohort-matched casecontrolled single-center study. Exposure to ambient particulate matter (PM) during the follicular phase for each patient was estimated based on air pollution data (1997-2006) categorized in Q1-3 ( 56.72 g/m3) and Q4 (>56.72 g/m3) periods. From this group 177 women who became pregnant (cases) were compared with 354 who had conceived spontaneously (controls). Main outcome measures included response to gonadotrophins, number of oocytes retrieved, fertilization, cleavage, embryo quality, implantation, pregnancy, miscarriage, and live birth rates. No effects of follicular phase exposure to high levels of PM on clinical, laboratory, embryo transfer or treatment outcome were found in women undergoing IVF/ET. Women exposed to Q4 level PM during the follicular phase of the conception cycle had significantly higher risk of miscarriage, regardless of the method of conception (odds ratio, 2.58; 95% confidence interval: 1.63-4.07) when compared to women exposed to Q1-3 level PM. The risk of miscarriage increased 3% per unit increase in follicular phase PM average level (p=0.000). The results presented here provide evidence of a causal role for brief exposure to high levels of ambient PM during the preconceptional period in early pregnancy loss, regardless of the method of conception, with a 2.6-fold increase in risk of miscarriage. Despite the absence of effects of this exposure on clinical, laboratory, and treatment outcome, IVF/ET was unable to reduce this risk

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição pré-concepcional de curta duração às partículas de exaustão do diesel (PED) e à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana, o desenvolvimento embrionário inicial e resultado gestacional utilizando um modelo experimental e um epidemiológico. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar os efeitos de dois meios de cultura comerciais no desenvolvimento de oócitos de camundongo fertilizados in vitro até o estágio de blastocisto. Zigotos obtidos de fêmeas de camundongo de 8 semanas de idade submetidas à indução da ovulação foram cultivados in vitro até o estágio de blastocisto em meio simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) ou meio G1/G2. A porcentagem de zigotos que se desenvolveu até o estágio de blastocisto 96 e 120 horas após a inseminação e que sofreu eclosão parcial ou completa no quinto dia de cultivo foi significativamente maior no grupo KSOM. O número médio de células da massa celular interna (MCI) foi 11,7 ± 4,0 e 9,2 ± 5,2 para os zigotos cultivados nos grupos KSOM e G1/G2, respectivamente, mostrando um número significativamente maior de células MCI em blastocistos derivados da cultura no meio KSOM. Concluímos que o meio KSOM comercialmente disponível é superior ao meio seqüencial G1/G2 para o cultivo de zigotos até o estágio de blastocisto no modelo de fertilização in vitro (FIV) em camundongos. No segundo projeto que compõe esta tese, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição de curta duração às PED sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais utilizando o modelo de FIV em camundongo. A instilação intranasal de água destilada (grupo controle), de PED nativas (grupo PED-N) ou de PED ácidoextraídas (grupo PED-AE), realizada uma vez ao dia por três dias, iniciada no primeiro dia de administração de gonadotrofinas, foi realizada em fêmeas de camundongo com oito semanas de idade. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a resposta ovariana a estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e trofoectoderma (TE), e a morfologia da MCI. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariado para a exposição às PED-N e PED-AE na coloração diferencial de blastocistos e na morfologia da MCI, mas não para a FIV ou desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular da MCI e a razão MCI/TE em blastocistos produzidos no grupo controle foram significativamente maiores do que em blastocistos produzidos nos grupos PED-N e PED-AE. O número total de células dos blastocistos foi similar entre os grupos. O escore que representa a morfologia da massa celular interna foi significativamente maior no grupo controle quando comparado àquele encontrado nos grupos PED-N e PEDAE. Baseando-se nesses resultados, nosso estudo sugere que a exposição de curta duração às PED pode afetar negativamente o processo reprodutivo através do distúrbio da especificação das linhagens celulares do embrião em estágio de blastocisto. Finalmente, a exposição a toxinas ambientais pode ser inevitável durante o período pré-concepcional em grandes centros urbanos e seus efeitos são desconhecidos. Portanto, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi avaliar os potenciais efeitos da exposição de curta duração à poluição ambiental particulada durante a fase folicular sobre os resultados clínicos, laboratoriais e gestacionais de casais submetidos à fertilização in vitro e transferência de embriões (FIVETE). Trezentos e quarenta e oito mulheres submetidas ao seu primeiro ciclo de FIVETE foram avaliadas retrospectivamente neste estudo coorte, casocontrole casado. A exposição ao material particulado ambiental (MP) durante a fase folicular de cada paciente foi estimada baseando-se em dados da poluição ambiental (1997-2006) categorizados em período Q1-3 ( 56,72 g/m3) e Q4 (>56,72 g/m3). Desse grupo, 177 pacientes que engravidaram (casos) foram comparadas com 354 mulheres que conceberam espontaneamente (controles). Os principais pontos de avaliação incluíram a resposta ovariana às gonadotrofinas, o número de oócitos recuperados e as taxas de fertilização, de clivagem, de qualidade embrionária, de implantação, de gestação, de abortamento e de nascidos vivos. Nenhum efeito da exposição a níveis elevados de MP durante a fase folicular foi observado nos resultados clínico e laboratorial, na transferência embrionária ou no sucesso dos ciclos de tratamento das pacientes submetidas à FIVETE. Mulheres expostas ao período Q4 durante a fase folicular do ciclo de concepção apresentaram um risco significativamente maior de abortamento, independentemente do método de concepção (razão de chance: 2,58; intervalo de confiança de 95%: 1,63 4,07), quando comparado àquele de mulheres expostas ao período Q1-3. O risco de perda da gestação aumentou 3% por unidade de aumento do valor médio do MP na fase folicular (p= 0,000). Os resultados apresentados aqui fornecem evidências para uma relação causal entre a breve exposição a níveis elevados de MP ambiente durante o período pré-concepcional e a perda gestacional inicial, independentemente do método de concepção e está associada a um aumento de 2,6 vezes no risco de abortamento. Apesar da ausência de efeitos dessa exposição sobre os resultados clínicos e laboratoriais e sobre o sucesso do tratamento, a FIVETE foi incapaz de reduzir esse risco / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of short-term preconceptional exposure to diesel exhaust particles and particulate air pollution on ovarian function, early embryo development and pregnancy outcome using experimental and epidemiological models. The objective of the first project was to examine the effects of two commercial media on the development of mouse ova fertilized in vitro to the blastocyst stage. One-cell embryos obtained from eight-week old superovulated mice were cultured in vitro up to the blastocyst stage in potassium-enriched simplex optimized medium (KSOM) or G1/G2 media. The percentage of zygotes that developed to the blastocyst stage 96 and 120 hours after insemination and that partially or completely hatched by day five of culture was significantly higher in the KSOM group. The mean number of inner cell mass (ICM) cells was 11.7 ± 4.0 and 9.2 ± 5.2 for zygotes cultured in KSOM and G1/G2 groups respectively, revealing a significantly higher cell number in the ICM of blastocysts derived from culture in KSOM medium. I concluded that commercially available KSOM medium is superior to sequential G1/G2 media for culturing one-cell embryos up to the blastocyst stage in the mouse IVF model. In the second project the objective was to evaluate the effects of short-term exposure to diesel exhaust particles on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the mouse IVF model. Intranasal instillation of distilled water (control group), native diesel exhaust particles (N-DEP group) or acid-extracted diesel exhaust particles (AE-DEP) once a day, for three days starting on the first day of gonadotrophin administration was performed on eight-week old female mice. Reproductive endpoints evaluated included ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and trophectoderm (TE), and ICM morphology. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for exposure to NDEP and AE-DEP on blastocyst differential staining and ICM morphology but not on IVF or embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the control group were significantly higher than in blastocysts produced in N-DEP and AE-DEP groups. The total cell count was similar among groups. The score that represents ICM morphology was significantly higher in the control group when compared to that found in N-DEP and AE-DEP groups. Based on these results this study suggests that short-term exposure to DEP may negatively affect the reproductive process by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, exposure to environmental toxins may be unavoidable during the preconceptional period in large urban centers and its effects are unknown. Thus, the purpose of the third project was to assess the potential effects of short-term exposure to particulate air pollution during the follicular phase on clinical, laboratory, and pregnancy outcomes for couples undergoing IVF/ET. Three hundred forty-eight patients undergoing their first IVF/ET cycle were evaluated in this retrospective cohort-matched casecontrolled single-center study. Exposure to ambient particulate matter (PM) during the follicular phase for each patient was estimated based on air pollution data (1997-2006) categorized in Q1-3 ( 56.72 g/m3) and Q4 (>56.72 g/m3) periods. From this group 177 women who became pregnant (cases) were compared with 354 who had conceived spontaneously (controls). Main outcome measures included response to gonadotrophins, number of oocytes retrieved, fertilization, cleavage, embryo quality, implantation, pregnancy, miscarriage, and live birth rates. No effects of follicular phase exposure to high levels of PM on clinical, laboratory, embryo transfer or treatment outcome were found in women undergoing IVF/ET. Women exposed to Q4 level PM during the follicular phase of the conception cycle had significantly higher risk of miscarriage, regardless of the method of conception (odds ratio, 2.58; 95% confidence interval: 1.63-4.07) when compared to women exposed to Q1-3 level PM. The risk of miscarriage increased 3% per unit increase in follicular phase PM average level (p=0.000). The results presented here provide evidence of a causal role for brief exposure to high levels of ambient PM during the preconceptional period in early pregnancy loss, regardless of the method of conception, with a 2.6-fold increase in risk of miscarriage. Despite the absence of effects of this exposure on clinical, laboratory, and treatment outcome, IVF/ET was unable to reduce this risk

O avanço da ciência, em especial na área da reprodução humana, permitiu a ocorrência de concepção humana de forma extracorpórea através do processo de fecundação in vitro a ser feita em laboratório especializado em reprodução humana assistida. Os embriões não implantados em útero materno são criopreservados. Este trabalho busca trazer os questionamentos da bioética, do biodireito, a cerca deste tema e das questões nele envolvidas. Também examina o enquadramento destes embriões sob a ótica da proteção Constitucional do patrimônio genético, da inviolabilidade da vida e da dignidade da pessoa humana. Trata também do Meio Ambiente quando aborda a Constituição Federal Brasileira de 1988, que em seu artigo 225 § 1º, inciso I, legisla sobre a preservação e restauração dos processos ecológicos e, no inciso II, determina que incumbe ao poder público preservar a diversidade e a integridade do patrimônio genético do País ficando demonstrado que tratar de embriões é tratar de patrimônio genético e de Meio Ambiente.Trata ainda da Nova Lei de Biossegurança/2005, a qual veio permitir pesquisas com célulastronco de embriões criopreservados, bem como a regulamentação desta Lei, tratando ainda sobre a Ação Direta de Inconstitucionalidade (ADIN) 3.510-0 que fora proposta junto ao Supremo Tribunal Federal (STF), questionando a constitucionalidade da permissão legal destas pesquisas. Dessa forma, é feita uma análise sobre a legislação existente com vistas a obter uma visão sobre eventuais direitos e proteção dos embriões criopreservados. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-04T19:54:25Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Denise Kempf.pdf: 1443498 bytes, checksum: 1586cffbe1630fc158628d51f0cd295a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-04T19:54:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Denise Kempf.pdf: 1443498 bytes, checksum: 1586cffbe1630fc158628d51f0cd295a (MD5) / The advancement of science, particularly in the area of human reproduction, allowed the occurrence of human conception in a bypass through the process of in vitro fertilization to be made in a laboratory specializing in assisted human reproduction. The embryos not implanted in the uterus are cryopreserved. This work seeks to bring the questions of bioethics, the biolaw, about this issue and the issues involved. It also examines the framework of these embryos from the perspective of Constitutional protection of genetic heritage, the sanctity of life and human dignity. It also deals with the Environment when addresses the Brazilian Constitution of 1988, which in article 225 § 1, section I, legislation on the preservation and restoration of ecological processes and, in section II, provides that "it is for the government to preserve the diversity and integrity of the genetic heritage being shown that treating embryos is to address genetic heritage and also the Middle Ambiente.Trata Biossegurança/2005 New Law, which has allowed research on stem cells from cryopreserved embryos, as well as regulation this Act, still dealing with on the direct action of unconstitutionality (ADIN) 3510-0 which was proposed to the Supreme Court (STF), questioning the constitutionality of the legal permission of this research. Thus, an analysis is made on the existing legislation in order to get an insight into possible rights and protection of cryopreserved embryos.

O avanço da ciência, em especial na área da reprodução humana, permitiu a ocorrência de concepção humana de forma extracorpórea através do processo de fecundação in vitro a ser feita em laboratório especializado em reprodução humana assistida. Os embriões não implantados em útero materno são criopreservados. Este trabalho busca trazer os questionamentos da bioética, do biodireito, a cerca deste tema e das questões nele envolvidas. Também examina o enquadramento destes embriões sob a ótica da proteção Constitucional do patrimônio genético, da inviolabilidade da vida e da dignidade da pessoa humana. Trata também do Meio Ambiente quando aborda a Constituição Federal Brasileira de 1988, que em seu artigo 225 § 1º, inciso I, legisla sobre a preservação e restauração dos processos ecológicos e, no inciso II, determina que incumbe ao poder público preservar a diversidade e a integridade do patrimônio genético do País ficando demonstrado que tratar de embriões é tratar de patrimônio genético e de Meio Ambiente.Trata ainda da Nova Lei de Biossegurança/2005, a qual veio permitir pesquisas com célulastronco de embriões criopreservados, bem como a regulamentação desta Lei, tratando ainda sobre a Ação Direta de Inconstitucionalidade (ADIN) 3.510-0 que fora proposta junto ao Supremo Tribunal Federal (STF), questionando a constitucionalidade da permissão legal destas pesquisas. Dessa forma, é feita uma análise sobre a legislação existente com vistas a obter uma visão sobre eventuais direitos e proteção dos embriões criopreservados. / The advancement of science, particularly in the area of human reproduction, allowed the occurrence of human conception in a bypass through the process of in vitro fertilization to be made in a laboratory specializing in assisted human reproduction. The embryos not implanted in the uterus are cryopreserved. This work seeks to bring the questions of bioethics, the biolaw, about this issue and the issues involved. It also examines the framework of these embryos from the perspective of Constitutional protection of genetic heritage, the sanctity of life and human dignity. It also deals with the Environment when addresses the Brazilian Constitution of 1988, which in article 225 § 1, section I, legislation on the preservation and restoration of ecological processes and, in section II, provides that "it is for the government to preserve the diversity and integrity of the genetic heritage being shown that treating embryos is to address genetic heritage and also the Middle Ambiente.Trata Biossegurança/2005 New Law, which has allowed research on stem cells from cryopreserved embryos, as well as regulation this Act, still dealing with on the direct action of unconstitutionality (ADIN) 3510-0 which was proposed to the Supreme Court (STF), questioning the constitutionality of the legal permission of this research. Thus, an analysis is made on the existing legislation in order to get an insight into possible rights and protection of cryopreserved embryos.