Existe uma complexa cascata envolvendo proteínas durante o desenvolvimento embrionário inicial e reconhecimento materno, o que é muito importante para a manutenção do concepto. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteômico do líquido uterino após ovulação em éguas prenhes e cíclicas. No primeiro ciclo, amostras de líquido uterino de 30 éguas cíclicas foram coletadas nos dias 7 (n=10), 10 (n=10) e 13 (n=10), constituíram o grupo Cíclica. No segundo ciclo as mesmas éguas foram cobertas por um garanhão fértil. Nos dias 7, 10 e 13 foram coletadas amostras do líquido intrauterino. Imediatamente após a coleta das amostras, o útero das éguas foi lavado, e aquelas que tiveram o embrião recuperado constituíram o grupo Prenhe. Dos 30 lavados uterinos realizados foram recuperados 6 embriões no dia 7, 6 embriões no dia 10 e 6 embriões no dia 13. Amostras das éguas que não tiveram recuperação embrionária foram descartadas de ambos os grupos. As amostras de líquido uterino foram processadas por eletroforese bidimensional seguida de matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) espectrometria de massa para a identificação de relevantes spots proteicos. De um total de 677 spots detectados, 19 foram identificados, sendo 13 mais abundantes no grupo Prenhe e 6 no grupo Cíclica. Em conclusão éguas prenhes e cíclicas demonstraram diferenças na abundancia de proteínas. Foram identificadas proteínas relacionadas com os eventos essenciais para manutenção embrionária como: transporte de lipídios através da cápsula embrionária, mobilidade uterina, formação de ATP, angiogênese, tolerância imunológica materna, proliferação celular, processos celulares e metabolismo. As mudanças no perfil de proteínas do fluido uterino durante o desenvolvimento inicial em éguas foram relacionadas com a presença embrionária, sugerindo que estas alterações podem ser importantes para o desenvolvimento embrionário e reconhecimento materno da prenhez. / There is a complex cascade involving proteins during early embryo development and maternal recognition, which is very important for maintenance of a concept. The aim of this study was to compare proteomic profile of uterine fluid after ovulation in pregnant and cyclic mares. In the first cycle, samples of uterine fluid of 30 cyclic mares were collected on days 7 (n = 10), 10 (n = 10) and 13 (n = 10) and constituted the Cyclic group. In the second cycle, the same mares were bred to a fertile stallion. At days 7, 10 and 13 intrauterine samples were collected. Immediately after sample collection, the mares uterus were flushed, and those with embryo recovery were assigned to the Pregnant group. Of the 30 mares flushed, embryos were recovered in 6 mares from the 7th day, 6 from the 10th day and 6 from the 13th day. Samples from the mares without embryo recovery were excluded from both groups. The uterine fluid samples were processed by two-dimensional electrophoresis technique followed by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry for the identification of relevant protein spots. From a total of 677 detected spots 19 were identified, 13 more abundant in Pregnant group and 6 in Cyclic group. In summary, pregnant and cyclic mares showed proteins with different abundance. Identified proteins were related to the transport of lipids through the embryo capsule, uterine motility, ATP generation, maternal immunological tolerance, cell proliferation, differentiation, metabolism and angiogenesis. Changes in the proteomic profile of uterine fluid during early embryo development in mares were related with the embryonic presence, suggesting that these alterations may be important for embryonic development and maternal recognition of pregnancy.

There is a growing appreciation that eukaryotic genomes are transcribed into numerous, previously undetected - and thus uncharacterized regulatory long non-coding RNAs (lncRNAs). Recent studies are primarily focused on lncRNAs transcribed from intergenic regions and enhancers, leaving antisense lncRNAs the least studied group of lncRNAs. At the same time, antisense transcription occurs in up to 74 % of human gene loci, frequently - from the opposite strand of genes encoding proteins involved in regulation of transcription. Here, we identified HIPSTAR (Heterogeneously expressed from the Intronic Plus Strand of the TFAP2A-locus RNA), a novel conserved lncRNA that is transcribed antisense to the TFAP2A gene. Unlike previously reported antisense lncRNAs, HIPSTR expression does not correlate with the expression of its antisense counterpart. Although HIPSTAR and TFAP2A are co-expressed in in vitro derived neural crest and trophoblast cells, only HIPSTAR and not TFAP2A is specifically expressed in a subset of cells within 8-cell- and morula-stage human embryos. We show that, similar to HIPSTAR, in the individual cells of developing human embryos or of stable cell lines the expression of lncRNAs is more highly heterogeneous than the expression of mRNAs. Finally, we demonstrate that HIPSTAR depletion in HEK293 and H1BP, a human embryonic stem cell line, predominantly affects the expression levels of genes involved in early organismal development and cell differentiation. Together, we show that expression of HIPSTAR and hundreds other lncRNAs is highly heterogeneous in human embryos and cell lines. We use HIPSTAR to exemplify the functional relevance of lncRNAs with heterogeneous and developmental stage-specific expression patterns. / Tem sido cada vez mais reconhecido que a transcrição dos genomas eucarióticos produz múltiplos transcritos novos, anteriormente não detectados e ainda não caracterizados, sendo que a maioria é constituida de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs) regulatórios. Estudos recentes estão focados principalmente nos lncRNAs transcritos de regiões intergênicas e enhancers; assim, o grupo dos lncRNAs antisenso permanece o menos estudado de todos. Ao mesmo tempo, a transcrição antisenso ocorre em até 74% dos loci de genes humanos, frequentemente - a partir da fita oposta de genes que codificam proteínas envolvidas na regulação da transcrição. No presente trabalho, nós identificamos HIPSTR (Heterogeneously expressed from the Intronic Plus Strand of the TFAP2A-locus RNA), um lncRNA novo conservado que é transcrito a partir da fita antisenso do gene TFAP2A. Ao contrário do anteriormente relatado para os lncRNAs antisenso, a expressão de HIPSTR não está correlacionada com a expressão do gene da fita oposta. HIPSTR e TFAP2A são co-expressos em células da crista neural e em trofoblastos derivadas in vitro, mas somente HIPSTR e não TFAP2A está especificamente expresso num subconjunto de células de embriões humanos nos estágios de 8-células e mórula. Mostramos que, semelhante a HIPSTR, a expressão de lncRNAs é mais altamente heterogênea que a expressão de mRNAs em células individuais de embriões humanos em desenvolvimento ou em linhagens estáveis de células. Finalmente, nós demonstramos que a depleção de HIPSTAR em células HEK293 e H1BP, uma linhagem de células tronco embrionárias humanas, afeta predominantemente os níveis de genes envolvidos no início do desenvolvimento do organismo e na diferenciação de células. No conjunto, nós mostramos que a expressão de HIPSTR e de centenas de outros lncRNAs é altamente heterogênea em embriões humanos e linhagens celulares. Usamos HIPSTR para exemplificar a relevância funcional de lncRNAs com padrões de expressão heterogêneos e estágio-de-desenvolvimento específicos.

Resumo não disponível

Orientadores: Aníbal Eugênio Vercesi, Flávio Vieira Meirelles / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:18:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chiaratti_MarcosRoberto_D.pdf: 26150066 bytes, checksum: 12cccf5f865b2ef08f186cad0c922cb6 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O DNA mitocondrial (mtDNA) dos mamíferos é composto por cerca de 16.500 pares de bases, tem herança exclusivamente materna, e codifica 13 polipeptídios essenciais para a função mitocondrial. Centenas a milhares de cópias de mtDNA estão presentes nas células somáticas dependendo da necessidade energética do tecido. No entanto, oócitos contêm mais de 150.000 cópias, no mínimo uma ordem de magnitude maior que a quantidade presente na maioria das células somáticas. Além disso, uma vez que o mtDNA não é replicado durante o desenvolvimento inicial, a quantidade de mtDNA por célula diminui a cada ciclo celular. Portanto, o número de cópias presentes no oócito deve ser suficiente para atender às necessidade energéticas das células embrionárias até que a replicação do mtDNA seja restabelecida. Considerando que há uma grande variabilidade da quantidade de mtDNA entre oócitos e que alguns trabalhos têm relacionado infertilidade e cópias de mtDNA no oócito, a quantidade de mtDNA poderia ser utilizada para selecionar embriões mais competentes a se desenvolverem. Para testar esta hipótese utilizou-se como modelo experimental o bovino uma vez que o desenvolvimento embrionário desta espécie é muito mais similar ao do humano que o de camundongo. Para tanto, em um primeiro experimento foram utilizados oócitos bovinos provenientes de folículos de diferentes tamanhos. Oócitos oriundos de folículos pequenos, os quais são sabidamente menos competentes a se desenvolverem a blastocisto, continham menos mtDNA comparado com oócitos oriundos de folículos maiores. No entanto, devido a grande variabilidade do número de cópias, num segundo experimento embriões partenogenéticos no estádio de uma célula sofreram biópsia para se determinar o conteúdo de mtDNA antes de serem cultivados para acessar a capacidade de desenvolvimento. Em contraste com achados prévios, o número de cópias de mtDNA nas biópsias não diferiu entre embriões competentes e incompetentes, indicando que o conteúdo de mtDNA não está relacionado com a competência de desenvolvimento a blastocisto. Para confirmar este achado, embriões no estádio de uma célula foram depletados em mais de 60% do seu conteúdo de mtDNA por centrifugação seguido da remoção de parte da fração citoplasmática rica em mitocôndrias. Surpreendentemente, os embriões depletados desenvolveram-se normalmente a blastocisto, os quais continham número de cópias de mtDNA similar a controles não manipulados. O desenvolvimento dos embriões depletados foi acompanhado por um aumento na expressão de genes (TFAM e NRF1) que controlam a replicação e transcrição do mtDNA, indicando uma habilidade intrínseca do embrião bovino em restaurar o conteúdo de mtDNA no estádio de blastocisto. Em conclusão, embriões bovinos competentes são capazes de regular o conteúdo de mtDNA no estádio de blastocisto independentemente do número de cópias presente no oócito. Estes achados contrariam o que foi descrito em camundongos, ressaltando a necessidade de estudos com espécies mais semelhantes ao homem antes do uso clínico do mtDNA como ferramenta para o diagnóstico de fertilidade em mulheres. Além disso, este trabalho tem implicação na manipulação da herança mitocondrial e, portanto, na prevenção da transmissão de sérias patologias causadas por mutações no mtDNA / Abstract: The mammalian mitochondrial DNA (mtDNA) is composed by only about 16,500 base pairs, is exclusively inherited from the mother, and encodes 13 polypeptides essential for mitochondrial function. Hundreds to thousands mtDNA copies are found in somatic cells depending on the energetic requirement of the tissue. However, oocytes contain more than 150,000 copies, at least an order of magnitude greater than most somatic cells. Moreover, since replication of mtDNA is downregulated during early development, the mtDNA content per cell decreases after each cell cycle. Therefore, mtDNA copy number in oocytes should be enough to support the energetic requirement of embryonic cells until mtDNA replication to be restablished. Considering there is a wide variability of mtDNA copy number among oocytes and there are reports showing a link between infertility and oocyte mtDNA copy number, the content of mtDNA could be used to select embryos more competent to develop. To test this hypothesis we used the bovine as an experimental model since its embryonic development is more similar to human than the murine is. Therefore, in a first experiment bovine oocytes derived from follicles of different sizes were used. Oocytes obtained from small follicles, known to be less competent to develop into blastocysts, contained less mtDNA than those originated from larger follicles. However, due to the high variability in copy number, in a second experiment a more accurate approach was examined in which parthenogenetic one-cell embryos were biopsied to measure their mtDNA content and then cultured to assess development capacity. Contrasting with previous findings, mtDNA copy number in biopsies was not different between competent and incompetent embryos, indicating that mtDNA content is not related to early developmental competence. To further examine the importance of mtDNA on development, one-cell embryos were partially depleted of over than 60% of their mtDNA by centrifugation followed by the removal of the mitochondrial-enriched cytoplasmic fraction. Surprisingly, depleted embryos developed normally into blastocysts, which contained mtDNA copy numbers similar to non-manipulated controls. Development in depleted embryos was accompanied by an increase in the expression of genes (TFAM and NRF1) controlling mtDNA replication and transcription, indicating an intrinsic ability to restore the content of mtDNA at the blastocyst stage. In conclusion, competent bovine embryos are able to regulate their mtDNA content at the blastocyst stage regardless of the copy numbers present in oocytes. These findings are in disagreement with that reported for mice, highlighting the need for studies using species more similar to human before the clinical use of mtDNA as a diagnostic tool in woman fertility. Moreover, these findings are important to manipulate mitochondrial inheritance and, therefore, to prevent transmission of important disorders caused by mtDNA mutations / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-10-16T10:47:22Z No. of bitstreams: 2 Tese - Poliana Carneiro Martins - 2017.pdf: 2303821 bytes, checksum: 3e74a5fc40c60b212e0c79f9270d5b43 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-10-16T10:47:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Poliana Carneiro Martins - 2017.pdf: 2303821 bytes, checksum: 3e74a5fc40c60b212e0c79f9270d5b43 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-16T10:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Poliana Carneiro Martins - 2017.pdf: 2303821 bytes, checksum: 3e74a5fc40c60b212e0c79f9270d5b43 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / Two experiments were carried on to evaluate the effects of the inclusion of conjugated linoleic acid (CLA) on the diets of breeders and broilers, and the alterations caused by post-hatch fasting. In the first experiment, two commercial flocks of breeders aged 58 weeks old were used, and one of them was supplemented for 26 days with 0.025% CLA. At the end of the supplementation, a completely randomized design was applied, composed by two treatments (0 and 0.025% CLA), to evaluate the physical quality and composition of the eggs. Subsequently, 270 eggs per treatment were distributed in two hatcheries, in a randomized block design, determined according to the hatchery used. The incubation parameters were evaluated and the fatty acid profile of the feed, yolk and yolk sac were determined. After hatching, post-hatching diets (0 or 0.025% CLA) were provided for 12 hours, and 320 chicks were housed in a completely randomized design, in a 2x2 scheme (maternal CLA x post-hatching CLA), totalizing four treatments and eight replicates of 10 birds each. The organs relative weight, intestinal development and humoral and cellular immunity were evaluated in embryos, newly hatched chicks, 12 hours after hatching, and at seven days old, as the pre-starter performance. The inclusion of CLA in the diet was able to alter the physical and bromatological characteristics of the eggs and yolk sacs of the progeny from supplemented breeders, also changing the fatty acid profile, but without causing embryonic mortality. The intestine was also influenced by CLA, both macroscopically and histologically. The CLA offered to the breeders influenced the intestinal development of the chicks from the embryonic phase and continued to exert effect after hatching, associated with the progeny supplementation. Breeder supplementation led to a better pre-starter performance of the progeny. In the second experiment, 320 male and female chicks were distributed in a completely randomized design, in a 2x2 factorial scheme, considering post-hatch fasting (access to water for 12 hours; access to water and food for 12 hours) and post-hatch diet (0; 0.025% CLA). The birds were vaccinated at 15 days old against Newcastle disease virus. The metabolizability of diets from four to seven days old, intestinal and organs development, and cellular and humoral immunity were evaluated weekly up to 35 days old. Post-hatch fasting affected performance, and CLA was not able to minimize the negative effects of fasting. However, birds were able to recover up to 35 days old. Post-hatch fasting decreased the immune response of birds. In both assays, CLA generally positively influenced humoral and cellular immunity. Among the evaluated organs, the liver was the main one to have its relative weight altered due to the use of CLA. Supplementing only progeny did not provide as much benefit as compared to supplementation of the breeder or both. The obtained results demonstrate the inclusion level of 0.025% of CLA is safe for use in breeders and may bring benefits to their progeny. / Foram conduzidos dois experimentos para avaliar os efeitos da inclusão de ácido linoleico conjugado (CLA) na dieta de matrizes e frangos de corte, e as alterações causadas pelo jejum pós-eclosão. No primeiro experimento, foram acompanhados dois lotes de matrizes com 58 semanas de idade, sendo um suplementado 26 dias com 0,025% de CLA. Ao final da suplementação, adotou-se o delineamento inteiramente casualizado, composto por dois tratamentos (0 e 0,025% CLA), para avaliação da qualidade física e da composição dos ovos. Posteriormente, 270 ovos por tratamento foram distribuídos em duas incubadoras, aplicando-se o delineamento em blocos casualizados, determinados pela incubadora utilizada. Avaliaram-se os parâmetros de incubação e determinou-se o perfil de ácidos graxos da ração, gema e saco vitelínico. Após a eclosão, dietas pós-eclosão (0 ou 0,025% de CLA) foram fornecidas por 12 horas, e 320 pintos foram alojados em delineamento inteiramente casualizado e esquema 2x2 (CLA materno x CLA pós-eclosão), totalizando quatro tratamentos e oito repetições de 10 aves cada. Avaliou-se o peso relativo de órgãos, o desenvolvimento intestinal e a imunidade humoral e celular em embriões, neonatos, após 12 horas, e aos sete dias de idade, e o desempenho pré-inicial. A inclusão de CLA na dieta foi capaz de alterar características físicas e bromatológicas dos ovos e sacos vitelínicos da progênie de matrizes suplementadas, causando também alteração do perfil de ácidos graxos, porém sem provocar a morte dos embriões. O intestino também foi influenciado pelo CLA, tanto macroscopicamente, quanto a nível histológico. O CLA oferecido às matrizes influenciou o desenvolvimento intestinal dos pintos desde a fase embrionária e continuou a exercer efeito após a eclosão, aliado à suplementação conjunta da progênie. A suplementação da matriz garantiu melhor desempenho pré-inicial da progênie. No segundo experimento, 320 pintos machos e fêmeas foram distribuídos em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2x2, considerando os fatores jejum alimentar pós-eclosão (acesso à água por 12 horas; acesso à água e alimento por 12 horas) e a dieta pré-inicial (0; 0,025% de CLA). As aves foram vacinadas aos 15 dias de idade contra o vírus da doença de Newcastle. Avaliou-se a metabolizabilidade das dietas de quatro a sete dias de idade, e o desenvolvimento intestinal e dos órgãos, e a imunidade celular e humoral, semanalmente até os 35 dias de idade. O jejum pós-eclosão afetou o desempenho, e o CLA não foi capaz de minimizar os efeitos negativos do jejum. No entanto, as aves conseguiram se recuperar até os 35 dias de idade. O jejum pós-eclosão prejudicou a resposta imune das aves. Nos dois ensaios, de modo geral, o CLA influenciou positivamente a imunidade humoral e celular. Entre os órgãos avaliados, o fígado foi o principal a sofrer alterações em seu peso relativo em decorrência da utilização de CLA. A prática de suplementar apenas a progênie não trouxe tantos benefícios quando comparada à suplementação da matriz ou de ambos. Os resultados aqui obtidos demonstraram que o nível de inclusão de 0,025% de CLA é seguro para utilização em matrizes e pode trazer benefícios à progênie.

Nausithoe aurea Silveira & Morandini, 1997 é uma espécie metagenética e dióica com fecundação externa. Os oócitos são liberados continuamente (55 dias em laboratório), porém com grandes variações no número a cada dia. No desenvolvimento embrionário a clivagem, após o estágio de 8 células, passa de holoblástica e igual para pseudoespiral. A gastrulação ocorre por ingressão multipolar e inicia-se aproximadamente 24 horas após a fecundação. A estrutura histológica geral das gônadas assemelha-se a outros Scyphozoa, onde os gonócitos proliferam a partir da gastroderme, migram e diferenciam-se na mesogléia. Na gônada masculina as células germinativas formam camadas razoavelmente distintas e constituem folículos testiculares. Na gônada feminina os oócitos surgem da zona germinativa na gastroderme e apresentam um gradiente de maturação a partir deste ponto (cortes no sentido oral-aboral). Os oócitos encontram-se livres na mesogléia da gônada, sem associação com outras células. A relação espacial entre a musculatura circular, as gônadas e o sulco coronal, é uma característica a ser usada na sistemática do gênero Nausithoe Kölliker, 1853. / Nausithoe aurea Silveira & Morandini, 1997 is a metagenetic and dioecious species with external fertilization. The oocytes are released continuously (55 days in laboratory), but with great variations in the daily number. In the embryonic development the cleavage, after the 8 cells stage, changes from holoblastic and adequal to pseudospiral. The gastrulation occurs through multipolar ingression and begin 24 hours after fertilization. The general histological structure of the gonads resembles other Scyphozoa, in which the gonocytes proliferate from the gastrodermis, migrate and differentiate in the mesoglea. In the male gonad the germ cells are arranged in distinctive layers and form follicles (cysts). In the female gonad the oocytes develop from the germinative zone in the gastrodermis and present a maturing gradient from this point on (oral-aboral sections). The oocytes are free in the gonad mesoglea, without association to any cell. The spatial relation of the coronal musculature, gonads and coronal groove, is a character to be used in the systematics of the genus Nausithoe Kölliker, 1853.

Os microRNAs (miRs) desempenham um papel importante na biologia das células-tronco por meio da interação com seus mRNAs alvos, induzindo inibição da tradução e/ou degradação destes transcritos. Durante a diferenciação de células pluripotentes, os miRs podem ser induzidos ou reprimidos, no entanto, suas funções específicas são amplamente inexploradas. Nós investigamos os papéis funcionais de um conjunto selecionado de miRs na pluripotência e diferenciação celular, usando microscopia de fluorescência quantitativa (High Content Analysis). Para isso, foram empregadas a NTera-2 (células de carcinoma embrionário humano, CCE) e a H1 (células-tronco embrionárias humanas, CTEh) como modelos. Essas células foram transfectadas reversamente com trinta moléculas de miRs distintas (individualmente) ou moléculas controles. Após 3-4 dias de cultura, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com Hoechst / CellMask Blue (núcleo/citoplasma), anti-OCT4, anti-Ciclina B1 e imageadas com um sistema ImageXpress Micro HCA. O CellProfiler foi utilizado para quantificar vários parâmetros morfométricos e medidas de intensidade de OCT4 e Ciclina B1 em compartimentos nucleares e citoplasmáticos. Esses dados foram usados para gerar perfis fenotípicos multiparamétricos específicos de cada miR (usando KNIME) e o agrupamento desses dados levou à identificação de vias e processos envolvidos na indução de características de pluripotência ou diferenciação celular causadas por miRs com efeitos fenotípicos similares. Como exemplo, as vias de PI3K-AKT, WNT, TGF? e DICER foram encontradas como moduladas por alguns clusters fenotípicos e os transcritos de alguns alvos foram avaliados por qPCR para validar os achados. Parte do trabalho foi focada na regulação da via Notch por miRNAs em células pluripotentes, o que levou à observação de que o miR- 363-3p inibe a sinalização de Notch e promove pluripotência nessas células. A transfecção de miR-363-3p não apenas elevou as características de pluripotência em NTera-2 e H1, mas também protegeu as CCE da diferenciação induzida por cocultivo com OP9 expressando DLL1 e causou a diminuição no nível de transcritos de PSEN1. Em conclusão, o ensaio desenvolvido aqui provou ser uma ferramenta robusta na detecção de mecanismos moleculares, baseando-se na combinação de análises fenotípicas funcionais e bioinformáticas. / microRNAs (miRs) play an important role in stem cell\'s biology by binding to target mRNAs transcripts, inducing translation blockage and/or transcripts degradation. Upon differentiation of pluripotent cells, miRNAs can be induced or repressed, however, their specific roles are largely unexplored. We investigated the functional roles of a selected set of miRs in pluripotency and differentiation, using quantitative automated fluorescence microscopy (High Content Analysis). For this, we used NTera-2 (human embryonal carcinoma cells, ECC) and H1 (embryonic stem cells; ESC) as models. These cells were reverse-transfected with thirty distinct miRs mimics (individually) or control molecules. Following 3-4 days of culture, cells were fixed, permeabilized and stained with Hoechst/CellMask Blue (nucleus/cytoplasm), antiOCT4, anti-Cyclin B1 and imaged using an ImageXpress Micro HCA System. CellProfiler was used to quantify several morphometric parameters and intensity measurements of OCT4 and CYCB1 in nuclear and cytoplasmic compartments. Quantified parameters were used to generate miR-specific multiparametric phenotypic profiles (using KNIME) and clustering these data led to identification of pathways and processes involved in the induction of pluripotency or cell diferention features caused by miRs with similar phenotypic effects. As an example, PI3K-AKT, WNT, TGF? and DICER pathways were found to be regulated by some phenotypic clusters and transcripts level of some of miR targets were evaluated by qPCR to validate de findings. Part of the work was focused in the regulation of Notch pathway by miRNAs in pluripotent cells, which led the observation that miR-363-3p inhibits Notch signaling and promotes pluripotency feature, as the transfection with miR-363-3p mimic not only enhanced pluripotent phenotype in NTera-2 and H1, but also protected de ECCs from differentiation induced by coculture with OP9 expressing DLL1 and decreased PSEN1 transcripts level.In conclusion, The assay developed here proved to be a robust tool in the detection of molecular mechanisms based on combined functional phenotypic and bioinformatic analyzes.

Até o momento a literatura não determinou qual o melhor estadio de maturação (imaturo ou maduro) para que o oocito mantenha sua competência para o desenvolvimento reprodutivo após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar em qual estadio meiótico (imaturo -VG (vesícula germinativa) ou maduro- MII (metáfase II)) o oócito é menos susceptível ao dano na criopreservação, utilizando modelo experimental bovino. Foram utilizados ovários de vacas abatidas em matadouro, após a aspiração dos folículos, os oócitos imaturos (VG) foram selecionados para a maturação in vitro e vitrificação, e foram divididos em três grupos: 1) oócitos maturados in vitro e não submetidos à vitrificação (CONTROLE); 2) oócitos vitrificados imaturos (VG), descongelados e submetidos à maturação in vitro (CRIO-MIV); 3) oócitos maturados in vitro (MII), vitrificados e descongelados (MIV-CRIO). Os oócitos foram avaliados quanto a: a)maturação nuclear pela técnica de orceína acética; b) integridade da zona pelúcida (ZP) através de microscopia de polarização; c) viabilidade oocitária pela técnica de DEAD-LIVE; d) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, produção e eclosão de blastocistos) através da fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AT). Não houve diferença na capacidade de maturação nuclear entre os oócitos frescos e descongelados no grupo CRIO-MIV (p=0,23). Em relação à zona pelúcida a totalidade dos oócitos (100%) nos três grupos apresentou leitura de zona pelúcida positiva, não havendo correlação com evolução embrionária posterior. Na análise de viabilidade celular pelo DEAD-LIVE verificou-se que houve redução da viabilidade do grupo MIV-CRIO (27%) quando comparado com controle (84%) (p<0,0001). Na análise do potencial de desenvolvimento embrionário o grupo controle apresentou melhores taxas de clivagem após FIV (80%) e AT (58%), do que os grupos CRIO-MIV (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectivamente) e MIV-CRIO (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectivamente). As taxas de formação de blastocisto e eclosão após FIV nos grupos CRIO-MIV, MIV-CRIO e após AT no grupo MIV-CRIO foram nulas. Houve a produção e eclosão de apenas um blastocisto no grupo CRIO-MIV após AT. No modelo experimental utilizado, o procedimento de vitrificação comprometeu parcialmente a viabilidade dos oócitos medida pela técnica de DEAD- LIVE e completamente o desenvolvimento embrionário subseqüente, independente do estadio de maturação meiótica (VG ou MII) durante a criopreservação. No entanto, oócitos vitrificados em estadio de VG e submetidos à MIV foram meioticamente competentes e progrediram até o estadio de MII, sugerindo que o dano não compromete a capacidade de maturação nuclear do oócito. Este estudo não conseguiu determinar qual o melhor estadio meiótico oocitário para criopreservação, já que os dois estadios meióticos (VG e MII) se mostraram igualmente prejudicados pela criopreservação em relação à capacidade reprodutiva. / Until the present literature has not achieved a consensus regarding the best maturation stage for oocyte to maintain their reproductive capacity after cryopreservation. The aim of this study was to determine, using an experimental bovine model, in which stage of development (VG stage, immature, or MII stage, post-maturation in vitro) the oocyte is less susceptible to damage during cryopreservation. Immature oocytes (VG) from the ovaries of slaughtered cows were selected for in vitro maturation or vitrification and divided into three groups. The first group (CONTROL) consisted of immature oocytes, matured in vitro without vitrification; the second group (CRYO-IVM) consisted of vitrified immature oocytes thawed and submitted to in vitro maturation; and the third group (IVM-CRYO) consisted of matured in vitro oocytes submitted to vitrification and thawing. The oocytes were evaluated for: nuclear maturation by acetic orcein staining; integrity of the zona pellucida using a polarized microscope; cell viability by the Dead-Live technique; and embryo development (cleavage, production and hatching rate) by in vitro fertilization and parthenogenetic activation. There was no difference in capacity of nuclear maturation between fresh and thawed oocytes (p=0.23). Regarding the zona pellucida (ZP), all oocytes (100%) of all three groups (control, CRYO-IVM and IVMCRYO) presented a positive ZP reading, with no correlation with later embryo evolution. DEAD-LIVE analysis of cell viability revealed reduction of viability in the IVM-CRYO group (27%) compared to control (84%) (p<0.0001) and to the CRYO-IVM group (56%) (p=0.017), with no difference between the last two groups (p=0.055). Analysis of the potential for embryo development by means of in vitro fertilization showed that the control group presented better cleavage and blastocyst formation rates than the CRYO-IVM (p<0.0001 and p<0.0001, respectively) and the IVM-CRYO (p<0.0001 and p=0.0004, respectively) groups. Analyzing the potential for embryo development the control group presented better cleavage by means of in vitro fertilization (80%) and parthenogenetic activation (58%) than the CRYOIVM (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectively) and the IVM-CRYO groups (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectively) Analysis of blastocyst formation rates and hatching after FIV and AT in CRYO-IVM and IVM-CRYO groups were null. Vitrification of bovine oocytes causes great impairment of their reproductive capacity regardless of the stage of maturation at the time of freezing. However the vitrified immature oocytes submitted to IVM maintained their capacity of nuclear maturation, as they achieved MII stage. This study was not able to determine which stage was better in reducing crio damage, as both stages (VG and MII) presented equally impaired by the process.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-06-21T13:16:18Z No. of bitstreams: 1 tatiannerosadossantos.pdf: 1621406 bytes, checksum: f0b584fe0eb00e34bedd8d5ca9965291 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-07T19:05:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tatiannerosadossantos.pdf: 1621406 bytes, checksum: f0b584fe0eb00e34bedd8d5ca9965291 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:05:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tatiannerosadossantos.pdf: 1621406 bytes, checksum: f0b584fe0eb00e34bedd8d5ca9965291 (MD5) Previous issue date: 2016-03-29 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O uso de telefones móveis suscita preocupações sobre as possíveis implicações para a saúde humana. Desde a introdução desta tecnologia a utilização de telefones celulares aumentou e estamos cada vez mais expostos à radiação eletromagnética. Devido à susceptibilidade do embrião, neonatos e crianças a qualquer efeito embriotóxico e subsequentes consequências para neonatos e crianças causado por campos eletromagnéticos, a Organização Mundial da Saúde tem recomendado que se dê alta prioridade a investigações experimentais sobre os efeitos de radiação eletromagnética em mulheres grávidas e crianças. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito de ondas eletromagnéticas irradiadas por aparelhos celulares sobre o desenvolvimento embrionário e neonatal, e seu possível efeito programador na prole de ratas Wistar submetidas. Para isso ratas prenhes foram expostas à radiofrequência emitida por telefones celulares (1,8 GHz) por diferentes períodos gestacionais. Foram analisadas a possível toxicologia materna, parâmetros reprodutivos, marcadores bioquímicos de toxicidade materna e peróxido de hidrogênio, além da concentração de hormônios sexuais (progesterona e 17 β-estradiol) e morfologia do ovário. No estudo da prole foi feito o acompanhamento neonatal do desenvolvimento físico e reflexológico. Atingindo a idade adulta, os machos foram submetidos a testes comportamentais e avaliação de conteúdo total e secreção de catecolaminas adrenais, corticosterona e glicose sérica. Aos 90 dias foi feito estudo da capacidade reprodutiva da prole (machos e fêmeas). Foi observado que a radiação emitida por aparelhos celulares foi capaz de aumentar a concentração sérica de 17 β-estradiol e peróxido de hidrogênio em ratas prenhes com 15 dias de gestação, além de levar a alterações no diâmetro de folículos ovarianos, porém não interferindo nos parâmetros reprodutivos analisados. Durante a exposição no período de fetogênese observou-se uma possível toxicidade hepática. E quando foi feita exposição durante toda a gestação foi observado que a radiação leva a alterações no tempo gestacional. Na prole adulta (machos) os resultados mostram um aumento no conteúdo total de catecolaminas acompanhado de uma diminuição da glicose no grupo exposto, mas sem alterações nos testes comportamentais. Alterações reprodutivas nos machos expostos à radiação durante a vida embrionária não foram observadas. Nas fêmeas expostas à radiação na vida intra-uterina foram observadas alterações na concentração sérica de 17 β-estradiol, porém, sem comprometimento das suas funções reprodutivas. Diante dos resultados do presente estudo, especulamos que a radiação emitida por telefones móveis possui efeito sobre os processos reprodutivos além de um efeito programador da prole. / The use of mobile phones raises concerns about the possible implications for human health. Since the introduction of this technology the use of mobile phones has increased tremendously and we are increasingly exposed to electromagnetic radiation. Because of the susceptibility of the embryo, neonates and children at any embryotoxic effect caused by electromagnetic fields, the World Health Organization has recommended to give high priority to experimental investigations of radiation effects on pregnant women and children. This study aimed to evaluate the effect of electromagnetic waves radiated by cell phones on the embryonic and neonatal development, and its possible programmer effect in exposed Wistar rat’s offspring. For that, pregnant rats were exposed to radio frequency emitted by mobile phones (1.8 GHz) for different gestational periods. The possible maternal toxicology, reproductive parameters, biochemical markers of maternal toxicity and hydrogen peroxide in addition to the concentration of sex hormones (progesterone and 17 β-estradiol) and ovarian histology, were analyzed. The evaluattion of the offspring was conducted monitoring neonatal physical and reflexological development. Reaching adulthood, the rats were subjected to behavioral testing and evaluation of total content and adrenal catecholamine secretion, corticosterone and serum glucose. It was also evaluated the reproductive capacity of offspring (male and female) at 90 days of age. The radiation emitted by cell phones was able to increase the serum concentration of 17 β-estradiol and hydrogen peroxide in pregnant rats with 15 days of gestation also leading to changes in the diameter of ovarian follicles, but not interfering with reproductive parameters analyzed. A possible liver toxicity was observed during the period of fetogenesis. And when the exposure was taken throughout pregnancy it was observed that the radiation causes changes in gestational length. In the adult offspring (males) results show an increase in total content of catecholamine associated with by a glucose decrease in exposed group, but no change in the behavioral tests. No reproductive changes in males exposed to radiation during embryonic life were observed. In females exposed to radiation during intrauterine life changes were observed in serum concentration of 17 β-estradiol, but without compromising its reproductive functions. Given the results of this study, we speculate that the radiation emitted by mobile phones has effect on the reproductive processes as well as a programmer effect of offspring.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gissele_rambo.pdf: 235931 bytes, checksum: a4e2ca4dc38eed3295f04e66a374e019 (MD5) Previous issue date: 2008-11-24 / The evaluation of the efficiency of semen cryopreservation is critical to make the use of frozen semen feasible in artificial insemination programs in swine. This study compared the efficiency of two non-penetrating cryoprotectants (dimetilacetamide-DMA or glycerol) on parameters of post-thawing semen quality and in vitro fertility with frozen swine semen. The sperm-rich fractions of 28 ejaculates from four boars were frozen with either DMA or glycerol. The efficiency of semen freezing was evaluated through parameters of post-thawing semen quality and in vitro penetration (IVP) of swine oocytes and embryo production. For samples frozen with DMA, sperm motility (38.1%) and membrane integrity (39.9%) were greater (P < 0.05) than those for glycerol (21.9% and 13.0%, respectively). Both the IVP rate and the number of spermatozoa per oocyte were greater (P < 0.05) for DMA (27.9% and 29.2, respectively) than for glycerol (13.6% and 20.7, respectively). The cleavage rate with DMA and glycerol samples (13.0% and 15.6%, respectively) were similar (P > 0.05). The embryo development rate did not differ (P < 0.05) for DMA (15.8%) and glycerol (22.0%). Therefore, when compared to glycerol, DMA was associated with improved post-thawing semen quality and in vitro fertility. / A avaliação da eficiência da criopreservação do sêmen é uma importante ferramenta para viabilizar o uso de sêmen congelado na inseminação artificial em suínos. Um experimento foi realizado a fim de identificar qual crioprotetor interno (dimetilacetamida-DMA ou glicerol) seria associado com melhores indicadores de qualidade seminal pós-descongelamento e fertilidade in vitro com sêmen suíno congelado. A fração espermática rica em espermatozóides de 28 ejaculados provenientes de quatro machos foi congelada com DMA ou glicerol. Para estimar o sucesso da criopreservação do sêmen foram utilizados parâmetros de qualidade seminal pós-descongelamento, teste de penetração in vitro (TPIV) de ovócitos suínos e produção in vitro de embriões. Para amostras congeladas com DMA, a motilidade (38,1%) e a integridade da membrana espermática (39,9%) foram superiores (P < 0,05) às observadas com glicerol (21,9% e 13,0%, respectivamente). A taxa de TPIV e o número de espermatozóides por ovócito também foram superiores (P < 0,05) para a DMA (27,9% e 29,2, respectivamente) do que para o glicerol (13,6% e 20,7, respectivamente). A taxa de clivagem alcançada com a DMA (13,0%) foi similar (P > 0,05) à obtida com glicerol (15,6%). A taxa de desenvolvimento embrionário não diferiu (P > 0,05) entre DMA e glicerol (15,8% e 22,0%, respectivamente). Portanto, considerando o conjunto de todos os testes, em comparação com o glicerol, a DMA foi associada com melhores indicadores de qualidade seminal e fertilidade in vitro.