Universiẗat, Diss.--Gießen, 1999.

Le sujet de ma thèse était de décrire sur le plan moléculaire le processus d'embryogenèse somatique chez la vigne. Pour cela, les étapes-clés d'entrée et de sortie du cycle d'embryogenèse secondaire ont été caractérisées par l'analyse de l'expression de quelques gènes impliqués dans le développement ou la défense, en particulier les gènes PR10.Grâce à l'exploitation de la séquence complète du génome de Vitis vinifèra disponible sur le site du Genoscope, j'ai pu caractériser exhaustivement la famille multigènique des PR10. Celle-ci est composée de 17 séquences disposées en tandem et formant un cluster compact sur le chromosome 5, dont 3 pseudogènes et au moins 13 séquences transcrites. L'expression de 10 de ces gènes a d'abord été analysée par RT-PCR semi-quantitative dans différents organes de la plante et dans des tissus traités au 2,4-D. Elle suggère une diversification fonctionnelle marquée. De plus, le niveau d'expression de plusieurs gènes PR10 est élevé dans les cals embryogènes, suggérant qu'ils pourraient jouer un rôle lors de l'embryogenèse somatique. L'étude de l'expression des gènes PR10 par RT-PCR quantitative en temps réel dans différents tissus ayant montré une capacité embryogénique variable lorsqu'ils sont soumis à un traitement par le 2,4-D met en évidence que le niveau d'expression varie entre les gènes et selon les tissus. L'expression de certains gènes est fortement induite par le 2,4-D dans les tissus à capacité embryogénique et seulement faiblement dans les tissus ne donnant jamais d'embryons somatiques, ce qui suggère fortement que ceux-ci pourraient être des marqueurs de la capacité embryogénique chez la vigne. / The objective of my work was to analyse the somatic embryogenesis process of Vitis vinifera at a molecular scale. Thus, the expression of genes implied in development or defence, especially PR10 genes, was monitored during the key-steps of entrance and exit of secondary somatic embryogenesis. The complete sequence of the Vitis vinifera genome available on the Genoscope website allowed the exhaustive characterization of the PR10 multigene family, which is constituted by 17 sequences localised on a tandem array on the chromosome 5. Among these 17 sequences, 3 are pseudogenesand at !east 13 are transcribed sequences. The expression of 10 PR10 genes was first monitored in various grapevine tissues and in tissues after 2,4-D treatment using semi-quantitative RT-PCR. The results suggest a strong functional diversification. Moreover, the expression of several PR10 genes is high in embryogenic calli, suggesting that these genes could intervene in somatic embryogenesis. The expression of PR10 genes was also monitored in tissues showing different somatic embryogenic capabilities under 2,4-D treatment using quantitative RT-PCR. The results show that regulation of PR10 genes is dependent of the gene and tissue considered. Moreover, the expression of some genes is highly induced by 2,4-D treatment in tissues having embryogenic capability, white it is only weakly induced in tissues having no embryogenic capability, suggesting that these gene could be markers of embryogenic capability in grapevine.

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In C. elegans bietet die frühe Embryogenese ein attraktives Modellsystem, um Wechselwirkungen von Proteinen in vivo zu entschlüsseln. Zur präzisen Identifizierung von spezifischen Interaktionen im C. elegans Embryo wurde ein neuer quantitativer Ansatz entwickelt, welcher die Expression von Fusionsproteinen an grün fluoreszierendes Protein in vivo mit markierungsfreier Interaktionsproteomik kombiniert. Diese Strategie wurde angewandt, um die Interaktionspartner von acht Proteinen zu untersuchen, die in essentiellen biologischen Prozessen während der frühen Embryogenese involviert sind. Diese Studie liefert als Ergebnis ein erstes embryonales in vivo Interaktionsnetzwerk bestehend aus 559 Interaktionen zwischen 472 Proteinen. Dieses Netzwerk erfasst nicht nur bekannte Bindungen, sondern auch neue Interaktionen von hoher funktioneller Relevanz. Die Netzwerkinformationen wurden mit Experimenten auf Basis der Ribonukleinsäuren-Interferenz kombiniert um neue Regulatoren der sogenannten „P granules” ausfindig zu machen. Infolgedessen wurde das fadenwurmspezifische Protein GEI-12 als neuer Interaktionspartner der DYRK-Kinase MBK-2 und als wichtiger Regler für die Dynamik der „P granules“ und für die Aufrechterhaltung der Keimbahn identifiziert. Dies führt zu einem hypothetischen Modell in welchem der Phosphorylierungszustand von GEI-12 den Auf- und Abbau der „P granules“ während der frühen Embryogenese vermittelt. Darüber hinaus veranlasst GEI-12 auch die Entstehung von „P granules“ in Säugetierzellen und bindet an PP2A-Phosphatasen, was darauf hindeutet, dass die grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften die zur Entstehung der Ribonukleoprotein-Körperchen notwendig sind, im Laufe der Evolution zwischen Spezies konserviert geblieben sind. Zusammenfassend stellt die in vivo Interaktionskartierung ein vielseitiges Werkzeug dar, welches nicht nur die funktionelle Organisation des Proteoms aufdeckt, sondern auch Einsichten in die tierische Entwicklungsbiologie liefert. / In C. elegans, early embryogenesis provides an attractive model system for mapping in vivo protein interactions. In order to accurately identify specific interactions in C. elegans embryos, a new quantitative approach was developed combining in vivo expressed GFP fusion proteins with label-free interaction proteomics. This strategy was applied to studying the interaction partners of eight bait proteins involved in essential biological processes during early embryogenesis. As a result, this study generated a pilot embryo in vivo interaction network composed of 559 interactions among 472 proteins. Importantly, this network captures not only well-characterized bindings but also new interactions of high functional relevance. Further utility of the network is demonstrated by combining it with RNAi perturbation to search for new regulators of P granule formation in early embryos. Consequently, a worm-specific protein GEI-12 was discovered as a novel interaction partner of the DYRK kinase MBK-2 and as an important regulator of P granule dynamics and germline maintenance. This leads to a hypothetical model in which the phosphorylation state of GEI-12 mediates P granule assembly and disassembly during early embryogenesis. In addition, GEI-12 also induces granule formation in mammalian cells and interacts with PP2A phosphatases, indicating that the fundamental biophysical properties required for ribonucleoprotein granule formation are conserved across species during evolution. In summary, in vivo interactome mapping is a versatile approach that not only unravels the functional organization of the proteome but also can reveal insights into animal development.

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Chez les végétaux supérieurs, lembryogenèse est une phase clé du développement au cours de laquelle lembryon établit les principales structures de la future plante. La compréhension des processus moléculaires et physiologiques menant à la formation de la graine est donc dun intérêt agronomique majeur. Chez Phaseolus la caractérisation moléculaire de lembryogenèse permet de mieux comprendre les mécanismes du développement embryonnaire et de son dysfonctionnement observé chez les hybrides interspécifiques. Cette thèse sinscrit dans ce cadre et vise à identifier et caractériser des gènes clés impliqués dans le développement de l'embryon chez Phaseolus. Des hybridations interspécifiques ont été réalisées entre lespèce P.vulgaris L. (cultivar NI637) utilisée comme parent mâle et lespèce P. coccineus L. (cultivar NI16) utilisée comme parent femelle. Des analyses ont aussi été effectuées sur un mutant obtenu par mutagenèse chimique à l'EMS (Ethyl Méthyl Sulfonate) de graines de la variété BAT93 de P.vulgaris. Une étude histologique comparative a permis de suivre la dynamique de lembryogenèse du haricot commun à partir dembryons prélevés 3 à 12 jours après la pollinisation et provenant de plantes normales et déficients dans la production de graines. Les embryons de P. vulgaris se développent plus rapidement par rapport à ceux issus du mutant EMS. Ces derniers présentent des anomalies au niveau de lembryon et du suspenseur. La caractérisation fonctionnelle de deux gènes candidats MIPS (myo-inositol phosphate synthase) et Sus (sucrose synthase) a été réalisée par RT-PCR quantitative et hybridation in situ suite à une étude spatio-temporelle dexpression de ces deux gènes candidats au cours de développement embryonnaire chez Phaseolus. Lanalyse du profil dexpression de ces deux gènes montre quils sont exprimés différemment au niveau des tissus de lembryon et du suspenseur. Lanalyse in silico nous a permis de sélectionner 22 gènes candidats dont nous avons vérifié l'expression au cours de développement de la graine chez Phaseolus. Des variations au niveau de la méthylation de lADN ont été déterminées chez les hybrides interspécifiques comparativement à leurs parents. La technique de lHSS a permis disoler des fragments dADNs complémentaires différemment exprimés au cours de développement de la graine chez Phaseolus. Lanalyse des séquences de ces ADNs complémentaires montre quils codent pour plusieurs protéines intervenant dans le développement cellulaire et embryonnaire, en particulier le "storage protein activator" (SPA), le "pentatricopeptide repeat-containing protein" (PPR) et lacetyl-CoA carboxylase (ACCase). La caractérisation de ces différents gènes exprimés au cours du développement de la graine, fournit de nouveaux outils susceptibles de mettre en évidence des mécanismes de dysfonctionnement embryonnaire chez le genre Phaseolus.

The term "pattern formation" refers to the process by which order unfolds in development. The present thesis deals with a particular aspect of molecular pattern formation during vertebrate embryogenesis. The model system in the focus of this study is the zebrafish, Danio rerio. In the early developmental phases of the zebrafish, Fibroblast growth factors (Fgfs) are involved in the molecular patterning of various tissues, including two regions of the brain, the forebrain and the midbrain-hindbrain region, affecting cellular processes as diverse as cell proliferation, differentiation, and axonal targeting. The goal of this study was to better understand the mechanisms by which Fgf signaling regulates pattern formation and embryogenesis. I addressed this question on several levels, investigating the extent of intracellular signaling (MAPK activation) relative to sources of Fgf expression, and the transcriptional responses of cells to Fgf signaling during embryogenesis. By a macroarray analysis, I identified putative transcriptional targets of Fgf signaling in late gastrulation, providing a set of molecules that are likely to act as functional players in relaying the patterning information encoded by Fgf signals. Among those are the secreted signaling molecules Chordin and Wnt8, as well as Isthmin, a novel secreted molecule that I found capable to interfere with anterior embryonic patterning. In addition, I identified two ETS domain transcription factors, Erm and Pea3, which constitute bona fide integrators of FgfR signaling. By gain- and loss-of-function studies, I demonstrate that transcript levels of erm and pea3 are tightly regulated by Fgf signaling. Detailed analysis of the expression patterns of erm and pea3 along with other Fgf target genes also provides evidence for a differential read-out of Fgf concentration in the embryo, consistent with a role of Fgf as a vertebrate morphogen. The discovery of novel molecular components downstream of Fgf receptor activity paves a way to characterize previously unknown or underestimated developmental roles of Fgfs in the molecular patterning of the forebrain, the eye and parts of the neural crest.

The term "pattern formation" refers to the process by which order unfolds in development. The present thesis deals with a particular aspect of molecular pattern formation during vertebrate embryogenesis. The model system in the focus of this study is the zebrafish, Danio rerio. In the early developmental phases of the zebrafish, Fibroblast growth factors (Fgfs) are involved in the molecular patterning of various tissues, including two regions of the brain, the forebrain and the midbrain-hindbrain region, affecting cellular processes as diverse as cell proliferation, differentiation, and axonal targeting. The goal of this study was to better understand the mechanisms by which Fgf signaling regulates pattern formation and embryogenesis. I addressed this question on several levels, investigating the extent of intracellular signaling (MAPK activation) relative to sources of Fgf expression, and the transcriptional responses of cells to Fgf signaling during embryogenesis. By a macroarray analysis, I identified putative transcriptional targets of Fgf signaling in late gastrulation, providing a set of molecules that are likely to act as functional players in relaying the patterning information encoded by Fgf signals. Among those are the secreted signaling molecules Chordin and Wnt8, as well as Isthmin, a novel secreted molecule that I found capable to interfere with anterior embryonic patterning. In addition, I identified two ETS domain transcription factors, Erm and Pea3, which constitute bona fide integrators of FgfR signaling. By gain- and loss-of-function studies, I demonstrate that transcript levels of erm and pea3 are tightly regulated by Fgf signaling. Detailed analysis of the expression patterns of erm and pea3 along with other Fgf target genes also provides evidence for a differential read-out of Fgf concentration in the embryo, consistent with a role of Fgf as a vertebrate morphogen. The discovery of novel molecular components downstream of Fgf receptor activity paves a way to characterize previously unknown or underestimated developmental roles of Fgfs in the molecular patterning of the forebrain, the eye and parts of the neural crest.