O coronavírus felino (FCoV) ocorre sob uma grande diversidade gênica de amostras e é classificado em dois patotipos: o coronavírus felino entérico (FECoV) e o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV). O patotipo FIPV é altamente virulento e responsável pelo desenvolvimento de uma doença altamente fatal, denominada de peritonite infecciosa felina (PIF). Já o FECoV apresenta-se amplamente disseminado na população felina e é responsável na maioria das vezes por infecção assintomática. Atualmente, nenhum marcador gênico conhecido é capaz de diferenciar os patotipos FECoV de FIPV. O presente estudo foi dividido em dois capítulos. No primeiro capítulo, objetivou-se avaliar a diversidade molecular do gene da membrana (M) em 190 amostras provenientes de 5 gatos sem manifestações de PIF (PIF-) e de 10 gatos com manifestações clínicas e histopatológicas de PIF (PIF+). Com esse estudo, conclui-se que tanto a hipótese de mutação in vivo do FECoV para FIPV, quanto a hipótese de transmissão entre gatos do patotipo FIPV são plausíveis. No segundo capítulo, com o objetivo de avaliar a diversidade dos genes 3a-c, E e M foram sequenciados clones de amplicons para estes genes obtidos, de 6 gatos PIF+ e 2 gatos PIF-. Os genes 3a-c, E e M apresentaram diversidade gênica que confere a constituição das quasiespécies de coronavírus felino com probabilidade de emergência do patotipo de alta virulência, mas de um modo hospedeiro-específico. Com o segundo estudo, conclui-se que as linhagens FIPV de coronavírus felino apresentaram a proteína 3c truncada, sendo o gene 3c o único marcador de patotipo dos FCoVs observado dentre os genes estudados. / Feline coronavirus (FCoV) occurs as a large genic diversity of strains and is classified as two pathotypes: feline enteric coronavirus (FECoV) and feline infectious peritonitis virus (FIPV). The FIPV pathotype is highly virulent and responsible for the onset of a highly fatal disease named feline infectious peritonitis (FIP), while the FECoV pathotype is widely disseminated in feline populations leading mostly to asymptomatic infections. No genic marker is currently known to differentiate the FECoV and FIPV pathotypes. This study has been divided in two chapters. In the first chapter, the aim was to evaluate the molecular diversity of the membrane (M) gene in 190 samples from 5 cats without FIP (FIP-) and 10 cats with clinical and histopathological evidence of FIP (FIP+). The conclusion of this study is that both the in vivo mutation hypothesis in the FECoV-to-FIP direction and the hypothesis of FIPV transmission amongst cats are plausible. In the second chapter, aimed to evaluate the diversity of genes 3a-c, E and M, clones of amplicons for these genes were obtained and sequenced from samples from six FIP+ and 2 FIP- cats. Genes 3a-c, E and M show a genic diversity that results in a quasispecies constitution of FCoV that leads to the probability of the emergence of the highly virulent pathotype in a host-specific way. The conclusion of this second study is that FIPV lineages show a truncated form of the 3C protein, making the 3c gene the only pathotype marker for FCoV observed amongst the genes studied herein.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A forma digestiva decorrente da doença de Chagas é uma das principais causas de morbidade e mortalidade na fase crônica da doença. Pacientes portadores da forma digestiva apresentam uma série de sintomas relacionados à obstrução do órgão. No megacólon, os órgãos exibem grande aumento do lúmen e hipertrofia da camada muscular. Análises histológicas dos órgãos afetados têm demonstrado lesões inflamatórias do sistema nervoso entérico (SNE), associadas com uma grande redução no número de neurônios. Embora o mecanismo de lesão neuronal continue obscuro, a frequente observação de ganglionite e periganglionite em pacientes com megacólon aponta para a participação de células do sistema imune nesse processo. Indivíduos não portadores de megacólon também apresentaram processos de denervação e inflamação, porém menos intensas em relação aos portadores de megacólon. Conhecendo que a inter-relação entre o SNE e o sistema imune é muito rica, é de extrema importância compreender os mecanismos que atuam em comum entre estes dois sistemas, o que pode elucidar e mostrar novos caminhos para o controle efetivo de doenças que afligem o trato gastrintestinal. Dados preliminares de nossos estudos utilizando a proteína GAP-43, marcador de regeneração neuronal, sugerem que esse processo de plasticidade neuronal esteja ocorrendo no cólon de pacientes portadores da infecção crônica. A hipótese é que o desenvolvimento do megacólon chagásico esteja intimamente relacionado com a expressão de neurotrofinas, substâncias capazes de estimular o processo de regeneração neuronal. A partir desses dados uma nova linha investigativa abriu-se no estudo da patologia do megacólon chagásico. Para a compreensão do desenvolvimento dessa patologia, avaliamos o grau de destruição das diferentes classes neuronais, a taxa de regeneração e as substâncias envolvidas com as mesmas, sendo essa a hipótese norteadora da dissertação aqui apresentada. / Patients with the digestive form of Chagas' disease exhibit a number of symptoms related to obstruction of the organ. Histological analysis of affected organs have demonstrated inflammatory lesions of the enteric nervous system (ENS), associated with a large reduction in the number of neurons caused, mainly, by inflammatory process. However, previous studies presented that some substances, like neurotrophins, may restrict neuronal destruction levels. The objective of this study is to characterize the neurotrophins expression in tissues from chagasic patients with chagasic megacolon and verify its involvement in megacolon development. For this, we used samples from chagasic patients with megacolon (n=8) and non-infected individuals (n=8) that, after preparation, were submitted to confocal fluorescence immunohistochemistry. To identify the sources and expression level of neurotrophins (NGF, GDNF and NT3), we performed a co-localization with Peripherin (neuronal marker) and S-100 (glial cell marker). Our results presented that, in the colon, the glial cells are the main sources of neurotrophins in all analyzed groups. Besides, chagasic patients with megacolon presented high expression of all investigated neurotrophins when compared with non-infected individuals. Our data point that neurotrophins might perform a protective role in the enteric nervous system and that prevent the megacolon installation. By the other side, chagasic patients that do not express an adequate level of neurotrophins may progress to megacolon form. We believe that this data can suggest new treatment protocols, like drugs administration qualified to elevate neurotrophins levels, what could prevent the megacolon installation and maintain the normal function of the gastrointestinal tract. / Dissertação (Mestrado)

O trato gastrointestinal (TGI) é a principal rota de exposição ao fluoreto (F) e o seu mais importante sítio de absorção. Acredita-se que a toxicidade do F comprometa a fisiologia do intestino, devido à relevante sintomatologia gastrointestinal relatada em consequência da exposição excessiva ao F. A função intestinal é controlada por uma complexa rede neuronal interligada e incorporada à parede deste órgão, denominada Sistema Nervoso Entérico (SNE). Embora os efeitos tóxicos do F sobre o Sistema Nervoso Central sejam descritos na literatura, não há estudos relacionados à sua toxicidade sobre o SNE. Neste estudo realizado em ratos, foi avaliado o efeito da exposição aguda ou crônica ao F, sobre a população geral de neurônios entéricos e sobre as subpopulações que expressam os principais neurotransmissores entéricos: Acetilcolina (ACh), Óxido Nítrico (NO), Peptídeo Vasoativo Intestinal (VIP), Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP) e Substância P (SP). Os animais foram divididos em 5 grupos: 3 destinados à exposição crônica (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F na água de beber) e 2 à exposição aguda (0 ou 25 mgF/Kg por gavagem gástrica). Foram coletados os 3 segmentos do intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) e processados para a detecção da HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP e SP, através de técnicas de imunofluorescência, no plexo mioentérico. Foram obtidas imagens para a realização da análise quantitativa dos neurônios da população geral (HuC/D) e nitrérgicos (imunorreativos à nNOS); e morfométrica dos neurônios imunorreativos à HuC/D ou nNOS; e das varicosidades imunorreativas à ChAT, VIP, CGRP ou SP. Amostras dos 3 segmentos intestinais foram preparadas e coradas em Hematoxilina e Eosina para análise histológica da morfologia básica. O segmento intestinal considerado mais afetado na análise morfométrica da população geral de neurônios, o duodeno, foi selecionado para a realização da análise proteômica, com o objetivo de oferecer o seu perfil proteico e determinar diferenças na expressão proteica em decorrência da exposição crônica ou aguda ao F. A análise da concentração de F no plasma sanguíneo foi realizada para a confirmação da exposição. Na análise quantitativa, o grupo de 50 ppm F, apresentou uma diminuição significativa na densidade da população geral de neurônios do jejuno e do íleo e na densidade dos neurônios imunorreativos à nNOS no duodeno e no jejuno. Quanto à análise morfométrica, a população geral e as subpopulações neuronais entéricas avaliadas apresentaram alterações morfológicas significativas, tanto após a exposição crônica quanto a aguda. Para a análise proteômica do duodeno, verificou-se que da associação de seus genes a um termo, e assim classificadas de acordo com diferentes processos biológicos. No caso do grupo da dose aguda, o processo biológico com a maior porcentagem de genes associados foi a geração de metabólitos precursores e energia (27% das proteínas); enquanto para os grupos de 10 e 50 ppm F foram o processo metabólico da piridina (41%) e a polimerização proteica (33%), respectivamente. / The gastrointestinal tract (GIT) is the main route of fluoride (F) exposure, and the most important site of its absorption. It is believed that F toxicity compromises the intestine physiology, due to the relevant gastrointestinal symptomatology reported in consequence to excessive exposure. The intestinal function is controlled by a complex neuronal net, which is interconnected and embedded in the wall of this organ, named Enteric Nervous System (ENS). Although the toxic effects of F on the Central Nervous system are described in the literature, there are no studies related to its toxicity on the ENS. Therefore, in this study performed in rats, the effects of chronic and acute F exposure were evaluated, on the general population of enteric neurons and on the subpopulations that express the main enteric neurotransmitters: Acetylcholine (Ach), Nitric Oxide (NO), Vasoactive Intestinal Peptide (VIP), Calcitonin gene related peptide (CGRP), and Substance P (SP). The animals were divided into 5 groups: 3 designed to the chronic exposure (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F in the drinking water) and 2 to the acute exposure (0 ou 25 mgF/Kg - gastric gavage). Three intestinal segments were collected (duodenum, jejunum, and ileum) and processed for the immunofluorescence techniques to detect HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP and SP, on the myenteric plexus. Images were obtained for the quantitative analysis of the general population of neurons (HuC/D immunoreactive) and the nitrergic neurons (nNOS immunoreactive), for the morphometric analysis of the general population and nitrergic neurons and also for the immunoreactive varicosities to ChAT, VIP, CGRP or SP. Samples of the 3 intestinal segments were prepared and stained with hematoxylin and eosin for histological analysis of the basic morphology. Duodenum, the intestinal segment considered the most affected in the morphological analysis of the general population of neurons, was selected for the proteomic analysis, with the objective to offer the entire protein profile and to determine differences in the protein expression due to chronic or acute F exposure. Plasma F concentration was analyzed to confirm the exposure. In the quantitative analysis, the 50 ppm F group presented a significant decrease in the density of the general population of neurons in the jejunum and ileum, and in the density of the nitrergic neurons in the duodenum and jejunum. Regarding the morphometric analysis, the general population of neurons and all the neuronal subpopulations evaluated presented significant morphological alterations, for both exposures, chronic and acute. In the proteomic analysis of the duodenum, it was verified that both exposures caused alterations in the expression of intestinal proteins. These proteins identified with differential expression were distributed according the association of their genes to a specific term, and by this term classified in different biological process. In the group that received the acute dose the biological process with the highest percentage of associated genes was the generation of precursor metabolites and energy (27% of proteins), and for the 10 and 50 ppm F groups, they were pyridine nucleotide metabolic process (41%) and protein polymerization (33%), respectively.

Foi descrita a presença do receptor P2X2 no sistema nervoso entérico e foi constatado que a desnutrição afeta os neurônios mioentéricos. Este projeto analisou os neurônios dos plexos mioentérico (PM) e submucoso (PS) imunorreativos ao receptor P2X2(ir), calbindina (Calb-ir), calretinina (Calr-ir), colina acetil transferase (ChAT-ir) e ao óxido nítrico sintase (NOS-ir) do íleo de ratos submetidos à desnutrição protéica pré e pós-natal e a renutrição pós-natal. Foram utilizados íleos de animais nutridos (N42), desnutridos (D42) e renutridos (RN42). Os resultados do PM e PS demonstraram 100% de neurônios Calb-ir, Calr-ir, ChAt-ir e NOS-ir expressavam o receptor P2X2-ir nos grupos. As densidades neuronais do PM e PS demonstraram aumento de 30% e 25% respectivamente, dos neurônios receptor P2X2-ir, Calr-ir, ChAT-ir e NOS-ir no grupo D42 e, recuperação no grupo RN42, os neurônios Calb-ir aumentaram 60% no PS. O perfil neuronal do PM mostrou diminuição de 26% nos neurônios receptor P2X2-ir e Calr-ir no grupo D42 e, no PS houve diminuição nos neurônios receptor P2X2-ir. Concluiu que a desnutrição afetou os neurônios entéricos e houve recuperação na renutrição, isto pode influenciar as funções do trato gastrintestinal. / It is showed the expression of the P2X2 receptor in the enteric nervous system; it was observed that undernutrition affect the myenteric neurons. This project analyzed the ileum myenteric (MN) and submucous (SN) neurons immunoreactive to P2X2 receptor, calbindin (Calb-ir), calretinin (Calr-ir), coline acetil transferase (ChAT) and nitric oxide sintase (NOS) of the animals submitted to pre- and postnatal protein deprivation and postnatal refeeding. Ileum was used from nourished (N42), undernourished (D42) and Refeeding (RN42) animals. The results showed 100% coexpression myenteric and submucous Calb-ir, Calr-ir, ChAt-ir e NOS-ir neurons with P2X2-ir receptor. The myenteric and submucos neuronal density showed increase of the 30% and 25% respectively, of the P2X2-ir, Calr-ir, ChAT-ir e NOS-ir neurons of the D42 group, the Calb-ir neurons increase 60% in the SN. It was observed in the MN neuronal profile decrease of the 26% of the P2X2-ir and Calr-ir in the RN42 group and recover in the RN42, there was decrease of the P2X2-ir receptor neurons in the submucous plexus. The conclusion demonstrated that undernutrition affects the enteric neurons and there was recuperation in the refeeding, this can influence the gastrointestinal functions.

A diabetes mellitus (DM) pode levar a distúrbios da motilidade gastrointestinal que podem se tornar clinicamente relevantes em alguns pacientes. Modelos de Dm em roedores indicam anormalidades morfofuncionais do sistema nervoso entérico nessa doença. Neste trabalho, avaliamos se o DM experimental pode levar a alterações na eferência colinérgica excitatória, densidade neuronal e expressão dos canais de sódio voltagemdependente (Nav) no plexo mioentérico do íleo. Hiperglicemia induzida por estreptozotocina em ratas foi desenvolvida durante oito semanas. Experimentos de imunofluorescência de tripla marcação revelaram que a densidade de neurônios por área do íleo no DM foi significativamente reduzida quando comparada ao controle. Foram observadas reduções médias de 52,2% do total de neurônios (p=0,0001); 50,0% dos neurônios colinérgicos (p=0,0068) e 54,8% dos neurônios nitrérgicos (p=0,0042). Também foram observadas reduções significativas de neurônios por área de gânglio (28,2% do total, p=0,0002; 27,7% de colinérgicos, p= 0,0002 e 32,1% de neurônios nitrérgicos, p=0,0016). A densidade de fibras colinérgicas na superfície do músculo longitudinal também foi significativamente reduzida (controle: 41 ± 2, DM: 24 ± 3%; p=0,003), embora a análise western-blot não indicasse redução na expressão de ChAT no DM. grupo. A isoforma Nav1.6 foi detectada em diferentes neurônios mioentéricos e a DM tendeu a mudar o padrão de imunomarcação para neurônios de tamanho maior (297,4 ± 10 vs. 372,5 ± 8,4 µm2), mas esse efeito não foi significativo (p=0,3). Os dados de RT-qPCR não sugeriram uma alteração dos transcritos para ChAT, nNOS, Nav1.3, Nav1.6 ou Nav1.7. Nossos dados confirmam a visão de que o DM crônico leva à redução das fibras colinérgicas excitatórias e da densidade neuronal. No entanto, mudanças no perfil de expressão do canal de sódio, que poderiam levar à disfunção neuronal, não foram detectadas. / Diabetes mellitus (DM) may lead to gastrointestinal motility disorders that may become clinically relevant in some patients. Rodent models of DM indicate morpho-functional abnormalities of the enteric nervous system in this disease. In this work, we have evaluated whether experimental DM can lead to changes in excitatory cholinergic efference, neuronal density and voltage-gate sodium channels (Nav) expression in the myenteric plexus of ileum. Streptozotocin-induced hiperglycemia in female rats was allowed to develop during eight weeks. Triple immunofluorescence labeling experiments revealed that the density of neurons per area of ileum in DM was significantly reduced when compared to the control. It were observed average reductions of 52.2% of total neurons (p=0.0001); 50.0% of cholinergic (p=0.0068) and 54.8% of nitrergic neurons (p=0.0042). Significant reductions of neurons per area of ganglion were also observed (28.2% of total, p=0.0002; 27.7% of cholinergic, p=0,0002 and 32.1% of nitrergic neurons, p=0.0016). The cholinergic fibers density at the surface of longitudinal muscle was also significantly reduced (control: 41 ± 2, DM: 24 ± 3%; p=0.003), although western-blot analysis did not indicate a reduction in the expression of ChAT in DM group. The Nav1.6 isoform was detected in different myenteric neurons and DM tended to shift the immunolabeling pattern towards neurons of bigger size (297.4 ± 10 vs. 372.5 ± 8.4 m2), but this effect was not significant (p=0.3). RT-qPCR data did not suggest an alteration of transcripts for ChAT, nNOS, Nav1.3, Nav1.6 or Nav1.7. Our data support the view that chronic DM leads to reduction in excitatory cholinergic fibers and neuronal density. However, changes in sodium channel expression profiling, which could lead to neuronal dysfunction, were not detected. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

Com o objetivo de estudar a interação do HAdV-41 com células permissivas, primeiramente foi observada a cinética de infecção do HAdV-41 em células HEK-293, durante 7 dias. A seguir, as culturas foram analisadas por MCVL e por MET. O HAdV-41 apresentou um ciclo replicativo lento com liberação da progênie viral por mecanismo não lítico. A seguir, com o intuíto de verificar a participação da proteina FC do HAdV-41 nas etapas de entrada nas células HEK-293 e CaCo2, obteve-se os dodecaedros recombinantes (DR) em células High five (base-Ad3, base-Ad3+FC-Ad41, base-Ad3+FL-Ad41, baseRGEHS-Ad3+FCAd41 e base-Ad3+FAd3). Esses dodecaedros foram inoculados em células HEK-293 e CaCo2. Após a análise por MCVL, observou-se que a proteína FC talvez não desempenhe função na entrada do DR nas células estudadas. A seguir, uma alíquota do DR base-Ad3+FC-Ad41 foi digerida com a enzima pepsina e analisada por WB. Notou-se que a FC sofreu proteólise. Acredita-se que essa proteólise seja necessária para o reconhecimento de receptores no trato gastro-intestinal. Esses resultados fornecerão subsídeos para o desenvolvimento de vetores de terapia gênica direcionada para o epitélio intestinal e vetores vacinais administrados por via oral. / Our objective was study the interaction between HAdV-41 and permissive cells. First, it was observed the kinetic of infection between HAdV-41 and HEK-293 cells, for 7 days. Second, the cultures were analyzed by CLSM and by TEM. The HAdV-41 showed a slower replicative cycle with release of viral progeny by non-lytic mechanisms. In order to verify the participation of SF protein of the HAdV-41 during the phases of entry in HEK-293 and CaCo2 cells, we producted recombinant dodecahedrons (DR) in high five cells (base-Ad3, base-Ad3+SF-Ad41, base-Ad3+SF-Ad41, baseRGEHS-Ad3+SFAd41 and base-Ad3+FAd3). These decahedrons were inoculated in HEK-293 and CaCo2 cells. After analysis with CLSM, observed that SF protein may not have a role in dodecahedron entry in the cells studied. Next, recombinant dodecahedrons base-Ad3+SF-Ad41 and base-Ad3 were digested with pepsin and analyzed by WB. We observed proteolysis of the SF. We believe that this proteolysis may be necessary for the recognition of receptors in intestinal cells. The results obtained will be the base for the development of gene-therapy vectors directed to intestinal epithelium, as well as orally administered vaccine vectors.

Admite-se que mais de 40% das crianças são acometidas pela desnutrição crônica em Moçambique (África Oriental). A doença pode estar relacionada, entre outros fatores, à qualidade da dieta que é oferecida à população, já que é bastante precária, pois exibe sérias deficiências de ferro, gordura e, principalmente, proteína animal em sua composição. Essa insuficiência proteica poderia acarretar em prejuízo ao desenvolvimento do organismo, pois a proteína animal é considerada uma boa fonte de aminoácidos essenciais, em decorrência de sua maior digestibilidade e absorção no intestino delgado, quando comparadas às fontes de origem vegetal. Na presente pesquisa foi reproduzida em laboratório, a dieta básica da população de Moçambique (DM), com o objetivo de avaliar seus efeitos nos componentes do plexo mioentérico e na mucosa dos segmentos do intestino delgado de ratos Wistar. Para isso, os animais foram divididos nos grupos Controle, com dieta AIN-93G com adição de 20% de caseína (NN21 e NN42); Dieta de Moçambique (DM21 e DM42) e Dieta Moçambique suplementada, acrescida de 20% de caseína (NM21 e NM42); e grupo Renutrido (RM42), composto por animais do grupo DM21 que, a partir do 22º dia, receberam a dieta NM até atingirem 42 dias de vida. Os segmentos foram coletados e submetidos às técnicas histoquímicas da NADH-diaforase e da NADPH-diaforase para evidenciação de neurônios do plexo mioentérico; histológicas (HE, Picro-sírius, Weigert) para avaliação da parede intestinal, mucosa, gânglios e seu tecido conjuntivo associado; de microscopia eletrônica de varredura (MEV) para observação da estrutura da mucosa; e de microscopia eletrônica de transmissão (MET) para a ultraestrutura dos componentes ganglionares. Estatisticamente, o peso corporal e o comprimento dos animais submetidos à dieta de Moçambique estavam abaixo dos valores encontrados para os animais controle. Na análise qualitativa, observou-se a presença de fibras elásticas, elaunínicas e oxitalânicas, assim como predominância de fibras colágenas do tipo I nos grupos NN42 e DM42, e do tipo III nos grupos NM42 e RM42 ao redor dos gânglios. A mucosa apresentou uma menor área no grupo DM21 com recuperação em DM42, com diminuição da altura das vilosidades nos dois grupos. Foram observadas alterações na organização do retículo endoplasmático rugoso e disposição dos materiais fibrilares e granulares do nucléolo dos animais DM. Sob MEV as vilosidades do grupo DM42 apresentaram superfície mais lisa, com poucas delimitações entre elas. A densidade dos neurônios reativos à NADH diminuiu de 21 para 42 dias em todos os grupos; porém, o DM21 e DM42 apresentou uma maior densidade. Os neurônios reativos à NADPH apresentaram a diminuição da densidade de 21 para 42 dias nos grupos DM e NM, quando comparados ao controle. Assim, conclui-se que a dieta vegetal de Moçambique levou à alterações na morfologia da mucosa, parede intestinal e neurônios entéricos, como uma forma de adaptação à dieta imposta / It is assumed that more than 40% of children are affected by chronic malnutrition in Mozambique (East Africa). The disease may be related, among other factors, the quality of diet that is offered to the population, since it is quite precarious, because it displays serious deficiencies of iron, fat and especially animal protein in their composition. This protein failure could result in damage to the development of the organism, as animal protein is considered a good source of essential amino acids, due to its higher digestibility and absorption in the small intestine when compared to vegetable sources. In this research has been reproduced in the laboratory, the staple diet of the population of Mozambique (DM), in order to evaluate its effects on components of the myenteric plexus and the mucosa of the small intestine segments of Wistar rats. For this, the animals were divided into control groups with AIN-93G diet with the addition of 20% casein (NN21 and NN42); Diet Mozambique (DM21 and DM42) and diet supplemented Mozambique, plus 20% casein (NM21 and NM42); and Refeeding group (RM42), consisting of the animals DM21 group, from the 22th day, given NM diet until they reached 42 days of life. The segments were collected and submitted to histochemical techniques of NADH-diaphorase and NADPH-diaphorase for disclosure of neurons of the myenteric plexus; histologic (HE, Sirius red, Weigert) for evaluation of the intestinal wall, mucosa, lymph nodes and its associated connective tissue; scanning electron microscopy (SEM) for observation of mucosal structure; and Transmission electron microscopy (TEM) ultrastructure to ganglion components. Statistically, body weight and length of the animals submitted to Mozambique diet were below the values found for control animals. Qualitative analysis showed the presence of elastic fibers, and elauninic oxytalan, and predominance of type I collagen fibers in the NN42 and DM42 groups, and type III in the NM42 and RM42 groups around the ganglia. The mucosa showed a smaller area in DM21 group recovery DM42, with a decrease in villus height in both groups. There have been changes in the organization of the rough endoplasmic reticulum and arrangement of fibrillar and granular materials nucleolus of DM animals. Under SEM the villi of the DM42 group showed smoother surface, with few boundaries between them. The density of reactive NADH decreased from 21 to 42 days in all groups; however, the DM21 and DM42 had a higher density. Reactive neurons to NADPH had decreased from 21 to 42 days density in DM and NM groups when compared to the control. Thus, it is concluded that vegetable diet Mozambique led to changes in the morphology of the mucosa, the intestinal wall and enteric neurons, as a way to adapt to the imposed diet

O coronavírus felino (FCoV) ocorre sob uma grande diversidade gênica de amostras e é classificado em dois patotipos: o coronavírus felino entérico (FECoV) e o vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV). O patotipo FIPV é altamente virulento e responsável pelo desenvolvimento de uma doença altamente fatal, denominada de peritonite infecciosa felina (PIF). Já o FECoV apresenta-se amplamente disseminado na população felina e é responsável na maioria das vezes por infecção assintomática. Atualmente, nenhum marcador gênico conhecido é capaz de diferenciar os patotipos FECoV de FIPV. O presente estudo foi dividido em dois capítulos. No primeiro capítulo, objetivou-se avaliar a diversidade molecular do gene da membrana (M) em 190 amostras provenientes de 5 gatos sem manifestações de PIF (PIF-) e de 10 gatos com manifestações clínicas e histopatológicas de PIF (PIF+). Com esse estudo, conclui-se que tanto a hipótese de mutação in vivo do FECoV para FIPV, quanto a hipótese de transmissão entre gatos do patotipo FIPV são plausíveis. No segundo capítulo, com o objetivo de avaliar a diversidade dos genes 3a-c, E e M foram sequenciados clones de amplicons para estes genes obtidos, de 6 gatos PIF+ e 2 gatos PIF-. Os genes 3a-c, E e M apresentaram diversidade gênica que confere a constituição das quasiespécies de coronavírus felino com probabilidade de emergência do patotipo de alta virulência, mas de um modo hospedeiro-específico. Com o segundo estudo, conclui-se que as linhagens FIPV de coronavírus felino apresentaram a proteína 3c truncada, sendo o gene 3c o único marcador de patotipo dos FCoVs observado dentre os genes estudados. / Feline coronavirus (FCoV) occurs as a large genic diversity of strains and is classified as two pathotypes: feline enteric coronavirus (FECoV) and feline infectious peritonitis virus (FIPV). The FIPV pathotype is highly virulent and responsible for the onset of a highly fatal disease named feline infectious peritonitis (FIP), while the FECoV pathotype is widely disseminated in feline populations leading mostly to asymptomatic infections. No genic marker is currently known to differentiate the FECoV and FIPV pathotypes. This study has been divided in two chapters. In the first chapter, the aim was to evaluate the molecular diversity of the membrane (M) gene in 190 samples from 5 cats without FIP (FIP-) and 10 cats with clinical and histopathological evidence of FIP (FIP+). The conclusion of this study is that both the in vivo mutation hypothesis in the FECoV-to-FIP direction and the hypothesis of FIPV transmission amongst cats are plausible. In the second chapter, aimed to evaluate the diversity of genes 3a-c, E and M, clones of amplicons for these genes were obtained and sequenced from samples from six FIP+ and 2 FIP- cats. Genes 3a-c, E and M show a genic diversity that results in a quasispecies constitution of FCoV that leads to the probability of the emergence of the highly virulent pathotype in a host-specific way. The conclusion of this second study is that FIPV lineages show a truncated form of the 3C protein, making the 3c gene the only pathotype marker for FCoV observed amongst the genes studied herein.

As atividades intestinais são coordenadas pelo sistema nervoso entérico e, disfunções na motilidade intestinal são observadas em indivíduos obesos. O ATP é um co-transmissor e seus receptores estão distribuídos nos neurônios entéricos constituindo a família P2X e P2Y. O presente estudo tem como objetivo analisar a expressão do receptor P2X2 e o código químico nos neurônios mioentéricos na obesidade. Foram utilizados íleo de camundongos obesos machos (OBM) e fêmeas (OBF) (C57BL/6J ob/ob), e controles (CF; CM) (+/+), que foram submetidos à técnica imuno-histoquímica de duplas marcações em neurônios imunomarcados ao receptor P2X2 com NOS (inibitórios), ChAT (excitatórios) ou Calr (excitatórios e sensoriais). Resultados dos grupos CF e OBF: Foi verificado a imunomarcação ao receptor P2X2, NOS, ChAT e Calr no citoplasma e nas membranas celular e nuclear dos neurônios mioentéricos de ambos os grupos. As duplas marcações dos neurônios imunorreativos (-ir) ao receptor P2X2 com NOS, ChAT ou Calr em CF foram 24±4%, 24±2% e 24±4%, e em OBF foram 19±4%, 25±4% e 22±1%, respectivamente. As duplas marcações dos neurônios NOS-ir, ChAT-ir ou Calr-ir com os neurônios receptor P2X2-ir foram 100% nos dois grupos. A densidade dos neurônios P2X2-ir aumentou em 62%, enquanto que a dos neurônios NOS-ir e ChAT-ir reduziram em 49% e 57%. A morfometria demonstrou aumento na área dos neurônios NOS-ir (CF 234±63, OBF 312±67); ChAT-ir (CF 210±24, OBF 253±14) e Calr-ir (CF 203±41, OBF 315±47), no entanto, neurônios P2X2-ir não apresentaram alterações (CF 325±23, OBF 336±67). A histoquímica demonstrou não haver diferença estatística entre os grupos quanto á densidade e a morfometria dos neurônios NADH-diaforase positivos. Resultados dos grupos CM e OBM: A expressão do receptor P2X2 foi identificada somente em CM e a imunomarcação a NOS, ChAT e Calr nos dois grupos. Em CM as duplas marcações dos neurônios P2X2-ir com NOS-ir, ChAT-ir ou Calr-ir foram 23±3%, 34±5% e 32±6%, respectivamente, e nos neurônios NOS-ir, ChAT-ir e Calr-ir com o receptor P2X2 foram 100%. A densidade dos neurônios NOS-ir e Calr-ir reduziram em 31% e 16%, enquanto que a densidade da população ChAT-ir aumentou 31%. A morfometria demonstrou que neurônios NOS-ir (CM 390±49, OBM 350±22); ChAT-ir (289±18, OBM 312±44), Calr-ir (CM 375±49, OBM 360±38) e P2X2-ir (CM 437±190) não apresentaram diferenças entre os grupos. A expressão protéica pela técnica do Western Blotting mostrou que houve uma redução de 36,5% no grupo OBM. Concluímos que neste modelo experimental tanto a obesidade (C57BL/6J ob/ob) como os gêneros podem contribuir com alterações: na expressão do receptor P2X2, na densidade e na morfologia dos neurônios NOS-ir, ChAT-ir e Calr-ir, promovendo mudanças nas atividades intestinais. / The intestinal activities are coordinated by enteric nervous system, and dysfunctions in intestinal motility were observed in obese individuals. The enteric neurons have been demonstrated to express different purinergics receptors. This study aims to analyze the expression of P2X2 receptor and the chemical code in the myenteric neurons in obesity. Sample from ileum of obese male (OBM) and females (OBF) (C57BL/6J ob/ob) and controls mice (CF, CM) (+/+) were used. Immunohistochemistry for double labelling in neurons P2X2 receptor immunostained with NOS (inhibitory), ChAT (excitatory) or Calr (excitatory and sensory) was performed. Results of CF and OBF groups: immunostaining was verified for P2X2 receptor, NOS, ChAT and Calr in the cytoplasm and in cell and nuclear membranes of myenteric neurons of both groups. The double-labelling for P2X2 receptor/NOS, ChAT or Calr in CF were 24 ±4%, 24 ±2% and 24 ±4%, respectively, and in OBF were 19 ±4%, 25 ±4% and 22±1%. Inversely, NOS, ChAT or Calr/P2X2 receptor immunoreactives neurons were 100% in both groups. The density of P2X2 neurons showed an increase of 62%, whereas NOS and ChAT neurons decreased by 49% and 57%. In morphometric analysis showed an increase in NOS (CF 234 ± 63, 312 ± 67 OBF), ChAT (CF 210 ± 24, 253 ± 14 OBF) and Calr (CF 203 ± 41, 315 ± 47 OBF) neuronal area, however, P2X2 neurons no changed in this feature (FC 325 ± 23, 336 ± 67 OBF). The histochemistry for NADH-diaphorase showed no statistical difference to density and morphometry of neurons between the groups. Results of CM and OBM groups: The P2X2 receptor expression was identified only in CM. Immunostaining for NOS, ChAT and Calr were observed in both groups. The double-labelling observed in CM for P2X2 receptor and NOS, ChAT or Calr were 23±3%, 34 ±5% and 32 ±6%, and inversely, NOS, ChAT or Calr/P2X2 receptor immunoreactives neurons were 100%. The NOS and Calr neuronal density were reduced about 31% and 16%, while population ChAT neuronal density increased about 31%. The morphometry showed that NOS (CM 390 ± 49, 350 ± 22 OBM), ChAT (289 ± 18, 312 ± 44 OBM), Calr (CM 375 ± 49, 360 ± 38 OBM) and P2X2 (CM 437 ± 190) neurons no differ between groups. The P2X2 receptor protein expression by Western blotting showed that there was a reduction in 36.5% in OBM. We concluded that in this experimental model, both obesity (C57BL/6J ob/ob) and genders may contribute to changes in P2X2 receptor expression, density and morphology of neurons NOS, ChAT and Calr, promoting alterations in intestinal activities.

Dor abdominal pode ser consequente a inúmeras causas, entre as várias possibilidades precisamos ficar atentos aos quadros de isquemia intestinal. No trato digestório a isquemia/reperfusão intestinal (I/R-i) acarreta alterações morfológicas nos neurônios entéricos. Este trabalho tem como objetivo analisar o comportamento das diferentes classes neuronais e do receptor P2X7 no plexo mioentérico do íleo de ratos Wistar submetidos à I/R-i. A isquemia intestinal foi obtida pela obstrução do fluxo sanguíneo das artérias ileais no período de 35 minutos, seguida pelos períodos de reperfusão de 6, 24, 72 horas e 1 semana. No grupo sham não houve a oclusão das artérias ileais. Os tecidos foram preparados por métodos imunohistoquímicos de duplas marcações do receptor P2X7 com a Óxido Nítrico Sintase neuronal (NOSn), calbindina (Calb), calretinina (Calr) e Acetilcolina Transferase (ChAT) e do receptor P2X7, da NOSn e da ChAT com o pan-neuronal anti-HuC/D. As análises qualitativas e quantitativas das contagens das duplas marcações, das densidades neuronais e da área dos perfis foram obtidas dos microscópios de fluorescência e de Confocal de Varredura à Laser. Os resultados qualitativos demonstraram diminuição da expressão do receptor P2X7 no grupo I/R-i de 24 horas e retorno da expressão nos grupos I/R-i de 72 horas e 1 semana. Os dados quantitativos demonstraram: a) os neurônios do plexo mioentérico foram imunorreativos ao receptor P2X7; b) não houve alterações significativas nas duplas marcações do receptor P2X7 com os neurônios NOSn-ir, Calr-ir, Calb-ir e ChAT-ir nos grupos sham e I/R-i; c) não houve alterações significativas nas duplas marcações do receptor P2X7, e dos neurônios NOSn-ir e ChAT-ir com o pan-neuronal anti-HuC/D nos grupos sham e I/R-i; d) houve diminuição nas densidades nos grupos I/R-i com 6, 24, 72 horas e 1 semana dos neurônios P2X7-ir, NOSn-ir, Calr-ir, Calb-ir, ChAT-ir e anti-HuC/D-ir quando comparados aos grupos sham; e) houve um aumento na área do perfil dos neurônios NOSn-ir nos grupos I/R-i de 6 e 24 horas, nos neurônios ChAT-ir houve um aumento no grupo I/R-i de 1 semana e nos neurônios Calr-ir houve uma diminuição no grupo I/R-i de 6 horas e um aumento no grupo I/R-i de 24 horas quando comparados aos grupos sham. O presente estudo demonstrou que a I/R-i está associada com a perda significativa de diferentes subpopulações de neurônios do plexo mioentérico acompanhada por diversas alterações morfológicas, o que pode acarretar problemas na motilidade intestinal. / Abdominal pain may be consequent to numerous causes, among the various possibilities need to be attentive to intestinal ischemia. In the digestive tract the intestinal ischemia-reperfusion (I/R-i) causes morphological changes in enteric neurons. The aim of the work was to analyze the behavior of different neurons and P2X7 receptor in the myenteric plexus of the ileum of rats subjected to I/R-i. Intestinal ischemia was obtained by the obstruction of blood flow in the ileal arteries period of 35 minutes followed by reperfusion periods of 6, 24, 72 hours and 1 week. In the sham group there was no occlusion of the ileal arteries. The tissues were prepared by immunohistochemical methods for double staining of P2X7 receptor with neuronal nitric oxide synthase (nNOS), calbindin, calretinin and acetylcholine transferase (ChAT) and P2X7 receptor, the nNOS and ChAT with pan-neuronal marker anti-HuC/D The qualitative and quantitative analysis of the counting of double staining, the neuronal density and the area of the cell body profile were obtained from fluorescence microscopy and confocal scanning laser. The qualitative results showed decreased expression of the P2X7 receptor in I/R-i for 24 hours group and return the expression in I/R-i for 72 hours and 1 week groups. The quantitative data showed: a) neurons in the myenteric plexus were immunoreactive for P2X7 receptor; b) no significant changes in the double staining of P2X7 receptor with nNOS, calretinin, calbindin and ChAT neurons in the sham and I/R-i groups; c) does not significant changes in the double staining of the P2X7 receptor, the nNOS and ChAT neurons with the pan-neuronal marker anti-HuC/D in sham and I/R-i groups; d) the densities of the P2X7 receptor, nNOS-IR, calretinin-IR, calbindin-IR, ChAT-IR and anti-HuC/D-IR neurons were decreased in I/R-i 6, 24, 72 hours and 1 week groups, when compared to sham group; e) the profile area was increased in nNOS-IR neurons in the I/R-i for 6 and 24 hours groups, ChAT-IR neurons in I/R-i 1 week group and in the calretinin-IR neurons there was a decrease in I/R-i 6 hours group and an increase in I/R-i for 24 hours group when compared to sham group. The present study demonstrated that I/R-i is associated with significant loss of different subpopulations of neurons in the myenteric plexus accompanied by several morphological changes, which can cause intestinal motility disorder.