A pesquisa de Staphylococcus spp. coagulase negativa (CNS) em alimentos não é prevista na legislação, entretanto, estas bactérias têm emergido como patógenos oportunistas e sua capacidade enterotoxigênica já foi documentada. O queijo destaca-se entre os principais derivados lácteos associados a intoxicações alimentares e a presença de cepas enterotoxigênicas do gênero Staphylococcus neste alimento representa um risco ao consumidor. O queijo colonial, tradicionalmente consumido pelos gaúchos, não possui regulamento técnico específico e poucos são os estudos relacionados ao risco do consumo desse alimento, bem como, à identificação de micro-organismos presentes nessa matriz. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) identificar as espécies de Staphylococcus spp. coagulase negativa, presentes em queijo colonial inspecionado; (ii) pesquisar a presença de genes codificadores de enterotoxinas clássicas (SE), bem como de resistência à penicilina e à meticilina nas cepas isoladas desta matriz. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijos coloniais inspecionados, sendo 121 adquiridas em Feiras Modelo e 84 em bancas do Mercado Público de Porto Alegre, compreendendo 17 marcas distintas. O isolamento inicial de Staphylococcus spp. foi realizado de acordo com o protocolo ISO 6888-1:1999, adicionado da triagem fenotípica para CNS. A identificação genotípica dos isolados foi realizada pela amplificação da região V1-V2 do gene 16S rRNA, seguida de sequenciamento e comparação das sequências obtidas no GenBank. A pesquisa de genes de enterotoxinas clássicas foi realizada por amplificação dos genes sea, seb, sec, sed e see. A determinação de resistência à penicilina foi avaliada a partir da amplificação do gene blaZ. Para resistência à meticilina, foi realizado teste de triagem frente à cefoxitina, e confirmação pela pesquisa do gene mecA. O armazenamento sob refrigeração foi observado em quase 90% das amostras coletadas. Entre as 179 colônias retiradas do ágar Baird-Parker, 59 apresentaram-se fenotipicamente compatíveis com CNS e foram identificadas genotipicamente. Treze espécies foram identificadas, sendo Macrococcus caseolyticus (40%) a mais frequente. Das 35 cepas confirmadas como CNS, S. equorum e S. vitulinus foram as espécies predominantes seguidas de S. hyicus, S. saprophyticus e S. epidermidis. O gene blaZ foi detectado em cinco cepas de CNS e em uma cepa de M. caseolyticus, sendo relativamente mais frequente em S. hyicus e S. epidermidis. O gene mecA não foi detectado. Oito cepas de CNS amplificaram algum gene para SE, sendo seb o mais frequente, seguido por sed, sea e see. O gene para enterotoxina C não foi detectado. Onze cepas apresentaram pelo menos um dos genes investigados, das quais, seis cepas apresentaram genes para SE e blaZ, concomitantemente. Os perfis seb/blaZ (n=4) e blaZ (n=3) foram os mais frequentes. Foi possível confirmar a diversidade de Staphylococcus spp. coagulase negativa em queijos coloniais inspecionados, além da baixa frequência de cepas carreadoras de genes para enterotoxinas clássicas e resistência à penicilina e à meticilina. / The investigation of coagulase-negative Staphylococcus spp. (CNS) is not included in food monitoring; although these bacteria have emerged as significant opportunistic pathogens and their toxigenic capacity has been documented. Among the dairy products, cheese features as one of the most involved in food poisoning outbreaks. The presence of enterotoxigenic strains of Staphylococcus in this food therefore represents a hazard for the consumers. Colonial cheese, which is a traditionally consumed cheese type in Rio Grande do Sul, does not have a specific technical regulation, and there are few studies targeting the risk for consumers, or aiming to identify its typical microbiota. Thus, the objectives of this study were: (i) to identify coagulase-negative Staphylococcus spp. species in inspected colonial cheese (ii) to investigate the presence of genes encoding classical enterotoxins (SE), and resistance to penicillin and methicillin in strains obtained from this food. For this purpose, from November 2014 to May 2015, 205 cheese samples were analyzed, 121 of which were acquired in street fairs and 84 in Central Market. The samples belonged to 17 different brands. The isolation of Staphylococcus spp. was performed according to the ISO 6888-1: 1999 protocol, followed by the phenotypic screening of CNS. The genotype identification of the isolates was performed by amplification of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene, followed by sequencing and the sequences comparison with the GenBank database. Classical enterotoxin genes were investigated by amplification of sea, seb, sec, sed and see genes. The determination of penicillin resistance was evaluated by the amplification of blaZ gene. For methicillin resistance, a screening test with cefoxitin was conducted followed by confirmation through the mecA amplification. The majority (89,7%) of the collected samples were stored under refrigeration. Among the 179 atypical colonies obtained from Baird-Parker agar, 59 were phenotypically compatible with CNS and were further subjected to genotyping. Thirteen bacterial species were identified, being Macrococcus caseolyticus the most frequent (40%). Thirty-five strains were confirmed as CNS, being S. equorum and S. vitulinus the most prevalent followed by S. hyicus, S. saprophyticus and S. epidermidis. The gene blaZ was detected in five strains of CNS and in one strain of M. caseolyticus, being relatively more frequent in S. hyicus and S. warneri. The mecA gene was not detected. Eight CNS strains amplified SE gene: SEB was the most frequent, followed by SED, SEA and SEE. There was no enterotoxin C gene detected. Eleven strains carried at least one of the genes investigated; six strains presented genes for SE and blaZ, concomitantly. The profiles SEB/blaZ (n = 4) and blaZ (n = 3) were the most frequent. The diversity of CNS in inspected colonial cheeses was confirmed. In addition, the low frequency of strains carrying genes for enterotoxins and resistance to penicillin and methicillin was observed.

A produção de alimentos inócuos, aptos ao consumo humano, é de extrema importância tanto à saúde pública quanto para atividade econômica. O queijo colonial é tipicamente consumido pela população do Rio Grande do Sul, porém ainda há poucos dados sobre a qualidade microbiológica desse produto. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) avaliar a qualidade microbiológica de queijos coloniais comercializados em feiras modelo e mercado público de Porto Alegre; (ii) caracterizar as cepas de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes presentes neste produto quanto a alguns fatores de patogenicidade, resistência e tipificação genotípica. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijo colonial inspecionado, compreendendo 17 marcas distintas comercializadas em feiras modelos e no Mercado Público de Porto Alegre. As análises microbiológicas evidenciaram que 47,31% dos queijos estavam não conformes com pelo menos um dos parâmetros microbiológicos estabelecidos na RDC nº12, portanto impróprios ao consumo humano. Com relação à quantificação de coliformes termotolerantes e Staphylococcus coagulase positiva, 10,73% e 40,48% das amostras apresentaram contagens superiores ao limite máximo estabelecido na legislação, respectivamente. Valores acima do padrão aceitável foram observados em 5,85% dos queijos amostrados para ambos os parâmetros. No que diz respeito à pesquisa de Salmonella sp., todas as amostras apresentaram-se em conformidade. Listeria sp. foi detectado em 12,19% dos queijos, dos quais 24% foram classificados como L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri/L. seeligeri e 8% L. grayi. / The production of innocuous food, fit for human consumption, is of extreme importance to both public health and economic activity. Colonial cheese is typically consumed by the population of Rio Grande do Sul, but there is still limited data on the microbiological quality of this product. Thus, the objectives of the present study were: (i) to evaluate the microbiological quality of colonial cheeses marketed in model fairs and central market in Porto Alegre; (ii) to characterize Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes strains present in these products according to some pathogenicity and resistance factors as well as to their genotype. Thus, from November 2014 to May 2015, we analyzed 205 samples of colonial cheese, comprising 17 different brands marketed in model fairs and in the Public Market of Porto Alegre. Microbiological analyzes showed that 47.31% of the samples were not compliant with at least one of the microbiological parameters established in RDC nº12, therefore unfit for human consumption. Regarding the quantification of thermotolerant coliforms and Staphylococcus coagulase positive, 10.73% and 40.48% of the samples presented counts higher than the maximum limit established in the legislation, respectively. Values above the acceptable standard were observed in 5.85% of the samples for both parameters. With regard to Salmonella sp., all samples were negative. Listeria sp. was detected in 12.19% of the samples, of which 24% were classified as L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri / L. seeligeri and 8% L. grayi. Concomitant isolation of L. monocytogenes and L. inoccua species was observed in one sample. Two samples presented counts of 3.6 NMP.g-1 and 11 NMP.g-1 of Listeria sp.,; in the others, the population found was <3.0 NMP.g-1. Serotyping of L. monocytogenes indicated the presence of serovars 1 / 2a, 1 / 2b and 1 / 2c and the PFGE profile showed five pulse types. The amplification of the nuc gene, confirmed the 83 isolates of Staphylococcus coagulase positive as S. aureus. Regarding the antimicrobial susceptibility profile, all strains were susceptible to cefoxetin, oxacillin and vancomycin. Strains resistant to: penicillin (26.5%) were detected, all of them confirmed as beta-lactamase producers; ciprofloxacin and erythromycin (9.63%); tetracycline (7.22%) and gentamicin (4.81%). Of the total strains, 66.26% were susceptible to all antimicrobials tested, while 6.02% were considered multiresistant. The gene blaZ was detected in 31.32% of the strains. All strains were negative for mecA and lukS-F genes. As for the presence of genes coding for classical SEs, 16.86% amplified some gene being sea and sec the most frequent. From the molecular typing of the 83 strains of S. aureus it was possible to detect 19 different spa types among the 11 brands of cheeses commercialized; the t127 and t002 genotypes were predominant. Three different types of sequences were detected in the four strains of S. aureus selected for typing by the MLST technique performed in silico: ST-133, ST-5 and ST-1. The colonial cheese marketed in model fairs and in the public market of Porto Alegre, was confirmed as a possible carrier of microorganisms that cause DTA. Among these pathogens, the frequency of isolation of L. monocytogenes and, especially, of S. aureus is noteworthy.

A resistência aos antimicrobianos pela produção de &#946;-lactamases em enterobactérias é um problema adicional neste cenário. Staphylococcus spp é considerado um patógeno humano freqüentemente associado a infecções adquiridas no ambiente hospitalar. O objetivo desse trabalho foi estudar a resistência aos antimicrobianos em cepas de Enterobactérias e Staphylococcus spp. isoladas de equipamentos utilizados no preparo de dietas destinadas à pacientes internados em um hospital universitário no município do Rio de Janeiro, além de verificar a presença de genes codificadores de enterotoxinas nas cepas de Staphylococcus spp. As enterobactérias e os Staphylococcus spp. foram isolados e identificados por metodologia convencional. Para o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos foram utilizados discos contendo antimicrobianos clinicamente relevantes. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de microdiluição em caldo para os antimicrobianos clinicamente relevantes. A pesquisa de genes que codificam &#946;-lactamases em enterobactérias foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA-1 e blaCMY-2. Para Staphylococcus spp. foram pesquisados, através da PCR e sequenciamento, os genes de resistência a meticilina, gentamicina e eritromicina e os genes codificadores de enterotoxinas (sea-see, seg-sej, sen-ser e seu). Foram isoladas 97 cepas de enterobactérias, 40 de liquidificador e 57 de batedeira e 40 cepas de Staphylococcus spp., 20 de cada equipamento. Dentre as enterobactérias, o gênero Enterobacter foi isolado com maior frequencia (n=37, 38%). Foram ainda isoladas seis cepas de Salmonella spp. Das enterobactérias, 80% (n=79) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 38% (n=37) a três ou mais. A expressão fenotípica presuntiva de b-lactamases do tipo AmpC foi detectada em 32 cepas. O gene blaCMY-2 não foi encontrado. Doze cepas apresentaram halos de inibição com screaning positivo para a pesquisa de ESBL. Foi detectada a presença do gene blaSHV em K. pneumoniae subsp. pneumoniae. O sequenciamento desse gene permitiu identificá-lo como sendo blaSHV-36. Dentre os Staphylococcus spp., oito foram identificados como coagulase-positivas (SCP) e 32 como coagulase-negativas (SCN). As oito cepas de SCP foram identificadas como S. aureus subsp. aureus. Dentre os SCN, as espécies identificadas com maior frequência foram: S. caprae (n=7, 17,5%), S. simulans (n=5, 12,5%) e S. epidermidis (n=4, 10%). Destas, 83% (n=33) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 30% (n=12) foram resistentes a mais do que três. Duas cepas (5%) de S. epidermidis apresentaram perfil de resistência a até seis antimicrobianos e genes de resistência a meticilina, a eritromicina e a gentamicina. Todas as sete cepas que foram resistentes no TSA e na CIM a gentamicina, apresentaram o gene aac(2)/aph(6). O gene ermB foi observado ainda em uma S hominis subsp hominis que apresentou resistência na CIM e no TSA. Foi detectada a presença de pelo menos um gene codificador de enteroxotxina em 83% (n=33) das cepas. O gene seg foi detectado em 11 cepas, o gene sei em 17 cepas e o gene sen em 31 cepas. Os resultados encontrados implicam as dietas preparadas com esses equipamentos como veículo de disseminação de enteropatógenos e Staphylococcus spp. com marcadores de resistência e genes codificadores de enterotoxinas relevantes no ambiente hospitalar.

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Janete Apparecida Desiderio Sena / Banca: Gislayne Fernandes Lemes Trindade Vilas-Bôas / Banca: Sérgio Antonio de Bortoli / Banca: Fernando Hercos Valicente / Resumo: O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA) da FCAV-UNESP. Foram caracterizados geneticamente, por PCR, isolados de Bacillus thuringiensis, provenientes de três coleções brasileiras, quanto aos tipos de genes cry1, avaliando-se o efeito dos mesmos sobre uma população de Plutella xylostella caracterizando-se também os isolados de B. thuringiensis quanto à presença de enterotoxinas HBL, NHE e o regulador pleitrópico PLC, por verificação biomolecular, avaliando a variabilidade, bem como a estruturação genética de populações de B. thuringiensis, por PCR-RFLP. Verificou-se que existe uma distribuição homogênea das subclasses cry1 dentro do banco de isolados de B. thuringiensis, com maior porcentagem de isolados portadores dos genes cry1Ab (42,12%) e com menor porcentagem de representantes da subclasse cry1Db (0,6%). Nos bioensaios observou-se 100% de mortalidade para lagartas de P. xylostella com os isolados utilizados, indicando que combinações de tipos diferentes de genes cry1 apresentam ação tóxica para larvas de P. xylostella. Analisando a estrutura populacional de B. thuringiensis foram obtidos 78 haplótipos, definidos para as populações das diferentes coleções, e 76 haplótipos, definidos para as populações de diferentes regiões brasileiras, retratando a variabilidade genética para os loci hblA, plcR, nheBC e cry1 analisados. Segundo valores FSTs, de comparação duas a duas, diferenças significativas entre coleções e populações de B. thuringiensis provenientes das regiões brasileiras foram verificadas. Mesmo assim, alguns grupos formados são constituídos por uma população clonal de isolados da bactéria. / Abstract: The work was developed in the Laboratory of Bacterias' Genetics and Applied Biotechnology (LGBBA) at UNESP/ Jaboticabal Campus. There were genetically characterized, by PCR, isolates of B. thuringiensis, belonging to three Brazilian collections basead on cry1 gene content, evaluating their effects on Plutella xylostella. They were also characterized concerning their enterotoxins production such as HBL, NHE and the PLC virulence factor, using molecular techniques, so as to evaluate their gene diversities, as well as their population genetic, using the PCR-RFLP approach. It was observed a homogeneous distribution of the cry1 subclasses within B. thuringiensis strain collections studied, with bigger percentage of isolates showing the cry1Ab genes (42.12%) and with lower percentage of isolates for subclass cry1Db (0.6%). The bioassays have revealed 100% mortality to P. xylostella larvae meaning that the effectiveness of B. thuringiensis as a biological control agent does not depend at the cry genes content. When the B. thuringiensis population structure was considered, 78 haplotypes were defined for the strains contents of different collections and 76 haplotypes were defined for strains of different Brazilian regions, exhibiting the great genetic variability for hblA, plcR, nheBC and cry1 loci. According to the FSTs values for establish pair comparisons, significant differences among the B. thuringiensis collections and populations, were observed. Nevertheless some of the formed groups were considered as bacterial clonal population. / Doutor

A resistência aos antimicrobianos pela produção de &#946;-lactamases em enterobactérias é um problema adicional neste cenário. Staphylococcus spp é considerado um patógeno humano freqüentemente associado a infecções adquiridas no ambiente hospitalar. O objetivo desse trabalho foi estudar a resistência aos antimicrobianos em cepas de Enterobactérias e Staphylococcus spp. isoladas de equipamentos utilizados no preparo de dietas destinadas à pacientes internados em um hospital universitário no município do Rio de Janeiro, além de verificar a presença de genes codificadores de enterotoxinas nas cepas de Staphylococcus spp. As enterobactérias e os Staphylococcus spp. foram isolados e identificados por metodologia convencional. Para o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos foram utilizados discos contendo antimicrobianos clinicamente relevantes. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de microdiluição em caldo para os antimicrobianos clinicamente relevantes. A pesquisa de genes que codificam &#946;-lactamases em enterobactérias foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA-1 e blaCMY-2. Para Staphylococcus spp. foram pesquisados, através da PCR e sequenciamento, os genes de resistência a meticilina, gentamicina e eritromicina e os genes codificadores de enterotoxinas (sea-see, seg-sej, sen-ser e seu). Foram isoladas 97 cepas de enterobactérias, 40 de liquidificador e 57 de batedeira e 40 cepas de Staphylococcus spp., 20 de cada equipamento. Dentre as enterobactérias, o gênero Enterobacter foi isolado com maior frequencia (n=37, 38%). Foram ainda isoladas seis cepas de Salmonella spp. Das enterobactérias, 80% (n=79) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 38% (n=37) a três ou mais. A expressão fenotípica presuntiva de b-lactamases do tipo AmpC foi detectada em 32 cepas. O gene blaCMY-2 não foi encontrado. Doze cepas apresentaram halos de inibição com screaning positivo para a pesquisa de ESBL. Foi detectada a presença do gene blaSHV em K. pneumoniae subsp. pneumoniae. O sequenciamento desse gene permitiu identificá-lo como sendo blaSHV-36. Dentre os Staphylococcus spp., oito foram identificados como coagulase-positivas (SCP) e 32 como coagulase-negativas (SCN). As oito cepas de SCP foram identificadas como S. aureus subsp. aureus. Dentre os SCN, as espécies identificadas com maior frequência foram: S. caprae (n=7, 17,5%), S. simulans (n=5, 12,5%) e S. epidermidis (n=4, 10%). Destas, 83% (n=33) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 30% (n=12) foram resistentes a mais do que três. Duas cepas (5%) de S. epidermidis apresentaram perfil de resistência a até seis antimicrobianos e genes de resistência a meticilina, a eritromicina e a gentamicina. Todas as sete cepas que foram resistentes no TSA e na CIM a gentamicina, apresentaram o gene aac(2)/aph(6). O gene ermB foi observado ainda em uma S hominis subsp hominis que apresentou resistência na CIM e no TSA. Foi detectada a presença de pelo menos um gene codificador de enteroxotxina em 83% (n=33) das cepas. O gene seg foi detectado em 11 cepas, o gene sei em 17 cepas e o gene sen em 31 cepas. Os resultados encontrados implicam as dietas preparadas com esses equipamentos como veículo de disseminação de enteropatógenos e Staphylococcus spp. com marcadores de resistência e genes codificadores de enterotoxinas relevantes no ambiente hospitalar.

A pesquisa de Staphylococcus spp. coagulase negativa (CNS) em alimentos não é prevista na legislação, entretanto, estas bactérias têm emergido como patógenos oportunistas e sua capacidade enterotoxigênica já foi documentada. O queijo destaca-se entre os principais derivados lácteos associados a intoxicações alimentares e a presença de cepas enterotoxigênicas do gênero Staphylococcus neste alimento representa um risco ao consumidor. O queijo colonial, tradicionalmente consumido pelos gaúchos, não possui regulamento técnico específico e poucos são os estudos relacionados ao risco do consumo desse alimento, bem como, à identificação de micro-organismos presentes nessa matriz. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) identificar as espécies de Staphylococcus spp. coagulase negativa, presentes em queijo colonial inspecionado; (ii) pesquisar a presença de genes codificadores de enterotoxinas clássicas (SE), bem como de resistência à penicilina e à meticilina nas cepas isoladas desta matriz. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijos coloniais inspecionados, sendo 121 adquiridas em Feiras Modelo e 84 em bancas do Mercado Público de Porto Alegre, compreendendo 17 marcas distintas. O isolamento inicial de Staphylococcus spp. foi realizado de acordo com o protocolo ISO 6888-1:1999, adicionado da triagem fenotípica para CNS. A identificação genotípica dos isolados foi realizada pela amplificação da região V1-V2 do gene 16S rRNA, seguida de sequenciamento e comparação das sequências obtidas no GenBank. A pesquisa de genes de enterotoxinas clássicas foi realizada por amplificação dos genes sea, seb, sec, sed e see. A determinação de resistência à penicilina foi avaliada a partir da amplificação do gene blaZ. Para resistência à meticilina, foi realizado teste de triagem frente à cefoxitina, e confirmação pela pesquisa do gene mecA. O armazenamento sob refrigeração foi observado em quase 90% das amostras coletadas. Entre as 179 colônias retiradas do ágar Baird-Parker, 59 apresentaram-se fenotipicamente compatíveis com CNS e foram identificadas genotipicamente. Treze espécies foram identificadas, sendo Macrococcus caseolyticus (40%) a mais frequente. Das 35 cepas confirmadas como CNS, S. equorum e S. vitulinus foram as espécies predominantes seguidas de S. hyicus, S. saprophyticus e S. epidermidis. O gene blaZ foi detectado em cinco cepas de CNS e em uma cepa de M. caseolyticus, sendo relativamente mais frequente em S. hyicus e S. epidermidis. O gene mecA não foi detectado. Oito cepas de CNS amplificaram algum gene para SE, sendo seb o mais frequente, seguido por sed, sea e see. O gene para enterotoxina C não foi detectado. Onze cepas apresentaram pelo menos um dos genes investigados, das quais, seis cepas apresentaram genes para SE e blaZ, concomitantemente. Os perfis seb/blaZ (n=4) e blaZ (n=3) foram os mais frequentes. Foi possível confirmar a diversidade de Staphylococcus spp. coagulase negativa em queijos coloniais inspecionados, além da baixa frequência de cepas carreadoras de genes para enterotoxinas clássicas e resistência à penicilina e à meticilina. / The investigation of coagulase-negative Staphylococcus spp. (CNS) is not included in food monitoring; although these bacteria have emerged as significant opportunistic pathogens and their toxigenic capacity has been documented. Among the dairy products, cheese features as one of the most involved in food poisoning outbreaks. The presence of enterotoxigenic strains of Staphylococcus in this food therefore represents a hazard for the consumers. Colonial cheese, which is a traditionally consumed cheese type in Rio Grande do Sul, does not have a specific technical regulation, and there are few studies targeting the risk for consumers, or aiming to identify its typical microbiota. Thus, the objectives of this study were: (i) to identify coagulase-negative Staphylococcus spp. species in inspected colonial cheese (ii) to investigate the presence of genes encoding classical enterotoxins (SE), and resistance to penicillin and methicillin in strains obtained from this food. For this purpose, from November 2014 to May 2015, 205 cheese samples were analyzed, 121 of which were acquired in street fairs and 84 in Central Market. The samples belonged to 17 different brands. The isolation of Staphylococcus spp. was performed according to the ISO 6888-1: 1999 protocol, followed by the phenotypic screening of CNS. The genotype identification of the isolates was performed by amplification of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene, followed by sequencing and the sequences comparison with the GenBank database. Classical enterotoxin genes were investigated by amplification of sea, seb, sec, sed and see genes. The determination of penicillin resistance was evaluated by the amplification of blaZ gene. For methicillin resistance, a screening test with cefoxitin was conducted followed by confirmation through the mecA amplification. The majority (89,7%) of the collected samples were stored under refrigeration. Among the 179 atypical colonies obtained from Baird-Parker agar, 59 were phenotypically compatible with CNS and were further subjected to genotyping. Thirteen bacterial species were identified, being Macrococcus caseolyticus the most frequent (40%). Thirty-five strains were confirmed as CNS, being S. equorum and S. vitulinus the most prevalent followed by S. hyicus, S. saprophyticus and S. epidermidis. The gene blaZ was detected in five strains of CNS and in one strain of M. caseolyticus, being relatively more frequent in S. hyicus and S. warneri. The mecA gene was not detected. Eight CNS strains amplified SE gene: SEB was the most frequent, followed by SED, SEA and SEE. There was no enterotoxin C gene detected. Eleven strains carried at least one of the genes investigated; six strains presented genes for SE and blaZ, concomitantly. The profiles SEB/blaZ (n = 4) and blaZ (n = 3) were the most frequent. The diversity of CNS in inspected colonial cheeses was confirmed. In addition, the low frequency of strains carrying genes for enterotoxins and resistance to penicillin and methicillin was observed.

A produção de alimentos inócuos, aptos ao consumo humano, é de extrema importância tanto à saúde pública quanto para atividade econômica. O queijo colonial é tipicamente consumido pela população do Rio Grande do Sul, porém ainda há poucos dados sobre a qualidade microbiológica desse produto. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) avaliar a qualidade microbiológica de queijos coloniais comercializados em feiras modelo e mercado público de Porto Alegre; (ii) caracterizar as cepas de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes presentes neste produto quanto a alguns fatores de patogenicidade, resistência e tipificação genotípica. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijo colonial inspecionado, compreendendo 17 marcas distintas comercializadas em feiras modelos e no Mercado Público de Porto Alegre. As análises microbiológicas evidenciaram que 47,31% dos queijos estavam não conformes com pelo menos um dos parâmetros microbiológicos estabelecidos na RDC nº12, portanto impróprios ao consumo humano. Com relação à quantificação de coliformes termotolerantes e Staphylococcus coagulase positiva, 10,73% e 40,48% das amostras apresentaram contagens superiores ao limite máximo estabelecido na legislação, respectivamente. Valores acima do padrão aceitável foram observados em 5,85% dos queijos amostrados para ambos os parâmetros. No que diz respeito à pesquisa de Salmonella sp., todas as amostras apresentaram-se em conformidade. Listeria sp. foi detectado em 12,19% dos queijos, dos quais 24% foram classificados como L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri/L. seeligeri e 8% L. grayi. / The production of innocuous food, fit for human consumption, is of extreme importance to both public health and economic activity. Colonial cheese is typically consumed by the population of Rio Grande do Sul, but there is still limited data on the microbiological quality of this product. Thus, the objectives of the present study were: (i) to evaluate the microbiological quality of colonial cheeses marketed in model fairs and central market in Porto Alegre; (ii) to characterize Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes strains present in these products according to some pathogenicity and resistance factors as well as to their genotype. Thus, from November 2014 to May 2015, we analyzed 205 samples of colonial cheese, comprising 17 different brands marketed in model fairs and in the Public Market of Porto Alegre. Microbiological analyzes showed that 47.31% of the samples were not compliant with at least one of the microbiological parameters established in RDC nº12, therefore unfit for human consumption. Regarding the quantification of thermotolerant coliforms and Staphylococcus coagulase positive, 10.73% and 40.48% of the samples presented counts higher than the maximum limit established in the legislation, respectively. Values above the acceptable standard were observed in 5.85% of the samples for both parameters. With regard to Salmonella sp., all samples were negative. Listeria sp. was detected in 12.19% of the samples, of which 24% were classified as L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri / L. seeligeri and 8% L. grayi. Concomitant isolation of L. monocytogenes and L. inoccua species was observed in one sample. Two samples presented counts of 3.6 NMP.g-1 and 11 NMP.g-1 of Listeria sp.,; in the others, the population found was <3.0 NMP.g-1. Serotyping of L. monocytogenes indicated the presence of serovars 1 / 2a, 1 / 2b and 1 / 2c and the PFGE profile showed five pulse types. The amplification of the nuc gene, confirmed the 83 isolates of Staphylococcus coagulase positive as S. aureus. Regarding the antimicrobial susceptibility profile, all strains were susceptible to cefoxetin, oxacillin and vancomycin. Strains resistant to: penicillin (26.5%) were detected, all of them confirmed as beta-lactamase producers; ciprofloxacin and erythromycin (9.63%); tetracycline (7.22%) and gentamicin (4.81%). Of the total strains, 66.26% were susceptible to all antimicrobials tested, while 6.02% were considered multiresistant. The gene blaZ was detected in 31.32% of the strains. All strains were negative for mecA and lukS-F genes. As for the presence of genes coding for classical SEs, 16.86% amplified some gene being sea and sec the most frequent. From the molecular typing of the 83 strains of S. aureus it was possible to detect 19 different spa types among the 11 brands of cheeses commercialized; the t127 and t002 genotypes were predominant. Three different types of sequences were detected in the four strains of S. aureus selected for typing by the MLST technique performed in silico: ST-133, ST-5 and ST-1. The colonial cheese marketed in model fairs and in the public market of Porto Alegre, was confirmed as a possible carrier of microorganisms that cause DTA. Among these pathogens, the frequency of isolation of L. monocytogenes and, especially, of S. aureus is noteworthy.

A produção de alimentos inócuos, aptos ao consumo humano, é de extrema importância tanto à saúde pública quanto para atividade econômica. O queijo colonial é tipicamente consumido pela população do Rio Grande do Sul, porém ainda há poucos dados sobre a qualidade microbiológica desse produto. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) avaliar a qualidade microbiológica de queijos coloniais comercializados em feiras modelo e mercado público de Porto Alegre; (ii) caracterizar as cepas de Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes presentes neste produto quanto a alguns fatores de patogenicidade, resistência e tipificação genotípica. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijo colonial inspecionado, compreendendo 17 marcas distintas comercializadas em feiras modelos e no Mercado Público de Porto Alegre. As análises microbiológicas evidenciaram que 47,31% dos queijos estavam não conformes com pelo menos um dos parâmetros microbiológicos estabelecidos na RDC nº12, portanto impróprios ao consumo humano. Com relação à quantificação de coliformes termotolerantes e Staphylococcus coagulase positiva, 10,73% e 40,48% das amostras apresentaram contagens superiores ao limite máximo estabelecido na legislação, respectivamente. Valores acima do padrão aceitável foram observados em 5,85% dos queijos amostrados para ambos os parâmetros. No que diz respeito à pesquisa de Salmonella sp., todas as amostras apresentaram-se em conformidade. Listeria sp. foi detectado em 12,19% dos queijos, dos quais 24% foram classificados como L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri/L. seeligeri e 8% L. grayi. / The production of innocuous food, fit for human consumption, is of extreme importance to both public health and economic activity. Colonial cheese is typically consumed by the population of Rio Grande do Sul, but there is still limited data on the microbiological quality of this product. Thus, the objectives of the present study were: (i) to evaluate the microbiological quality of colonial cheeses marketed in model fairs and central market in Porto Alegre; (ii) to characterize Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes strains present in these products according to some pathogenicity and resistance factors as well as to their genotype. Thus, from November 2014 to May 2015, we analyzed 205 samples of colonial cheese, comprising 17 different brands marketed in model fairs and in the Public Market of Porto Alegre. Microbiological analyzes showed that 47.31% of the samples were not compliant with at least one of the microbiological parameters established in RDC nº12, therefore unfit for human consumption. Regarding the quantification of thermotolerant coliforms and Staphylococcus coagulase positive, 10.73% and 40.48% of the samples presented counts higher than the maximum limit established in the legislation, respectively. Values above the acceptable standard were observed in 5.85% of the samples for both parameters. With regard to Salmonella sp., all samples were negative. Listeria sp. was detected in 12.19% of the samples, of which 24% were classified as L. monocytogenes, 52% L. inoccua, 16% L. welshimeri / L. seeligeri and 8% L. grayi. Concomitant isolation of L. monocytogenes and L. inoccua species was observed in one sample. Two samples presented counts of 3.6 NMP.g-1 and 11 NMP.g-1 of Listeria sp.,; in the others, the population found was <3.0 NMP.g-1. Serotyping of L. monocytogenes indicated the presence of serovars 1 / 2a, 1 / 2b and 1 / 2c and the PFGE profile showed five pulse types. The amplification of the nuc gene, confirmed the 83 isolates of Staphylococcus coagulase positive as S. aureus. Regarding the antimicrobial susceptibility profile, all strains were susceptible to cefoxetin, oxacillin and vancomycin. Strains resistant to: penicillin (26.5%) were detected, all of them confirmed as beta-lactamase producers; ciprofloxacin and erythromycin (9.63%); tetracycline (7.22%) and gentamicin (4.81%). Of the total strains, 66.26% were susceptible to all antimicrobials tested, while 6.02% were considered multiresistant. The gene blaZ was detected in 31.32% of the strains. All strains were negative for mecA and lukS-F genes. As for the presence of genes coding for classical SEs, 16.86% amplified some gene being sea and sec the most frequent. From the molecular typing of the 83 strains of S. aureus it was possible to detect 19 different spa types among the 11 brands of cheeses commercialized; the t127 and t002 genotypes were predominant. Three different types of sequences were detected in the four strains of S. aureus selected for typing by the MLST technique performed in silico: ST-133, ST-5 and ST-1. The colonial cheese marketed in model fairs and in the public market of Porto Alegre, was confirmed as a possible carrier of microorganisms that cause DTA. Among these pathogens, the frequency of isolation of L. monocytogenes and, especially, of S. aureus is noteworthy.

Linhagens de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) são consideradas como importante agente de diarréia, principalmente entre crianças e turistas em países em desenvolvimento. Entre os fatores de virulência expressos por ETEC, as enterotoxinas termo-lábil (LT) e termo-estável (ST) representam os mais relevantes fenótipos. Evidências preliminares sugerem que a severidade da diarréia associada a linhagens de ETEC deve refletir a diversidade natural de linhagens selvagens quanto à produção de enterotoxinas e/ou à ocorrência de variantes naturais com efeitos tóxicos reduzidos. No presente trabalho, investigamos diversidade genética do óperon etx, que codifica para a toxina LT, e da capacidade de produção e secreção de LT por linhagens de ETEC isoladas de humanos ou suínos em diferentes regiões geográficas. Os resultados mostraram considerável variabilidade na produção de LT com valores variando de 2 a 2.525 ng de toxina por mL de cultura. Secreção de LT foi também variável com valores variando de menos que 0,04% a 49,5% do total de LT produzida pelas diferentes linhagens de ETEC. Adicionalmente, experimentos de alça ligada em coelho mostraram uma boa correlação entre a quantidade de LT secretada sob condições in vitro e a capacidade de causar acúmulo de fluidos in vivo. Nós determinamos ainda diversidade de ETEC pela obtenção das seqüências dos óperons etxAB de 50 linhagens (LT+ or LT+/ST+) pertencentes a diferentes sorotipos com ênfase para as linhagens produtoras apenas de LT e isoladas de crianças assintomáticas. As seqüências de nucleotídeo completas dos genes etxAB revelaram 23 alterações de aminoácidos nas subunidades A (18) e B (5), as quais geraram 16 variantes de LT. Entre estes variantes de LT, um mostrou efeito tóxico reduzido em comparação à toxina de referência LT1. A forma de LT atenuada (LT4) tem atividade enzimática reduzida devido à troca de aminoácido. / Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains represent an important etiological agent of diarrheal disease, particularly among children and travelers in developing countries. Among the virulence factors expressed by ETEC strains the heat-labile (LT) and heat-stable (ST) enterotoxins represent the most revelevant phenotypes. Indirect evidences suggest that the severity of diarrhea associated to ETEC strains might reflect the natural diversity of wild strains to produce enterotoxins and/or the occurrence of variants endowed with reduced toxic effects. In the present study, we investigated both the genetic diversity of the etx operon, encoding the heat-labile toxin, and the capability to produce/secrete LT by ETEC strains isolated from humans or porcine in different geoghrafic areas. The results showed a remarkable variability on the production of LT with values ranging from 2 to 2,525 ng of toxin per ml of culture. LT secretion was also variable with values ranging from less than 0.04% to 49.5% of total LT produced by the different ETEC strains. Additionally, rabbit ileal loop experiments showed a good correlation between the amounts of secreted LT under in vitro conditions and fluid accumulation in vivo. We determined also the diversity of the etxAB operon of 50 ETEC strains (LT+ or LT+/ST+) belonging to different serotypes with emphasis to LT+-only producing strains isolated from asymptomatic children. The complete nucleotide sequences of the etxAB genes revealed 23 amino acid changes at the A (18) or B (5) subunits, which generated 16 variant forms of LT. Among these LT variants, one of them showed reduced toxic effects in comparison to the reference toxin LT1. The attenuated LT form (LT4) had decreased enzymatic activity due to an amino acid replacement (K4R) at the A1 subunit. LT4 retains its immunogenic and adjuvant properties following nasal immunization. Additionaly, the LT4 variant showed altered immune modulatory features and promoted a more biased Th1 response, which favor activation of effector CD8+ T lymphocytes, to co-administred antigen with regard to LT1. Taken together, our results demonstrate that ETEC strains isolated from human subjects express natural genetic variability leading to a remarkable polymorphism of the etx operon as well as production and secretion of LT. Such natural genetic diversity observed in ETEC strains may affect the host-pathogen relationships and, consequently, contribute to the severity of the disease among infected subjects.

Linhagens de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) são consideradas como importante agente de diarréia, principalmente entre crianças e turistas em países em desenvolvimento. Entre os fatores de virulência expressos por ETEC, as enterotoxinas termo-lábil (LT) e termo-estável (ST) representam os mais relevantes fenótipos. Evidências preliminares sugerem que a severidade da diarréia associada a linhagens de ETEC deve refletir a diversidade natural de linhagens selvagens quanto à produção de enterotoxinas e/ou à ocorrência de variantes naturais com efeitos tóxicos reduzidos. No presente trabalho, investigamos diversidade genética do óperon etx, que codifica para a toxina LT, e da capacidade de produção e secreção de LT por linhagens de ETEC isoladas de humanos ou suínos em diferentes regiões geográficas. Os resultados mostraram considerável variabilidade na produção de LT com valores variando de 2 a 2.525 ng de toxina por mL de cultura. Secreção de LT foi também variável com valores variando de menos que 0,04% a 49,5% do total de LT produzida pelas diferentes linhagens de ETEC. Adicionalmente, experimentos de alça ligada em coelho mostraram uma boa correlação entre a quantidade de LT secretada sob condições in vitro e a capacidade de causar acúmulo de fluidos in vivo. Nós determinamos ainda diversidade de ETEC pela obtenção das seqüências dos óperons etxAB de 50 linhagens (LT+ or LT+/ST+) pertencentes a diferentes sorotipos com ênfase para as linhagens produtoras apenas de LT e isoladas de crianças assintomáticas. As seqüências de nucleotídeo completas dos genes etxAB revelaram 23 alterações de aminoácidos nas subunidades A (18) e B (5), as quais geraram 16 variantes de LT. Entre estes variantes de LT, um mostrou efeito tóxico reduzido em comparação à toxina de referência LT1. A forma de LT atenuada (LT4) tem atividade enzimática reduzida devido à troca de aminoácido. / Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains represent an important etiological agent of diarrheal disease, particularly among children and travelers in developing countries. Among the virulence factors expressed by ETEC strains the heat-labile (LT) and heat-stable (ST) enterotoxins represent the most revelevant phenotypes. Indirect evidences suggest that the severity of diarrhea associated to ETEC strains might reflect the natural diversity of wild strains to produce enterotoxins and/or the occurrence of variants endowed with reduced toxic effects. In the present study, we investigated both the genetic diversity of the etx operon, encoding the heat-labile toxin, and the capability to produce/secrete LT by ETEC strains isolated from humans or porcine in different geoghrafic areas. The results showed a remarkable variability on the production of LT with values ranging from 2 to 2,525 ng of toxin per ml of culture. LT secretion was also variable with values ranging from less than 0.04% to 49.5% of total LT produced by the different ETEC strains. Additionally, rabbit ileal loop experiments showed a good correlation between the amounts of secreted LT under in vitro conditions and fluid accumulation in vivo. We determined also the diversity of the etxAB operon of 50 ETEC strains (LT+ or LT+/ST+) belonging to different serotypes with emphasis to LT+-only producing strains isolated from asymptomatic children. The complete nucleotide sequences of the etxAB genes revealed 23 amino acid changes at the A (18) or B (5) subunits, which generated 16 variant forms of LT. Among these LT variants, one of them showed reduced toxic effects in comparison to the reference toxin LT1. The attenuated LT form (LT4) had decreased enzymatic activity due to an amino acid replacement (K4R) at the A1 subunit. LT4 retains its immunogenic and adjuvant properties following nasal immunization. Additionaly, the LT4 variant showed altered immune modulatory features and promoted a more biased Th1 response, which favor activation of effector CD8+ T lymphocytes, to co-administred antigen with regard to LT1. Taken together, our results demonstrate that ETEC strains isolated from human subjects express natural genetic variability leading to a remarkable polymorphism of the etx operon as well as production and secretion of LT. Such natural genetic diversity observed in ETEC strains may affect the host-pathogen relationships and, consequently, contribute to the severity of the disease among infected subjects.