Submitted by Izabel Monteiro (izabel_22@hotmail.com) on 2016-08-03T13:35:08Z No. of bitstreams: 1 Liane Cristine Rebouças Demosthenes - Tese.pdf: 1077147 bytes, checksum: b3915a604b50db5ab23367233a0eb874 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-08-15T18:05:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Liane Cristine Rebouças Demosthenes - Tese.pdf: 1077147 bytes, checksum: b3915a604b50db5ab23367233a0eb874 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-08-15T18:10:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Liane Cristine Rebouças Demosthenes - Tese.pdf: 1077147 bytes, checksum: b3915a604b50db5ab23367233a0eb874 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-15T18:10:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Liane Cristine Rebouças Demosthenes - Tese.pdf: 1077147 bytes, checksum: b3915a604b50db5ab23367233a0eb874 (MD5) Previous issue date: 2013-12-17 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is one of the most important diseases of solanaceous. Present in all national territory, causes rapid wilting of plants and affects several crops of agronomic interest. In Amazonas, the high temperature and humidity combined with the genetic diversity of this pathogen diversity of hosts favor the development and aggressiveness of the pathogen and complicate the management of this disease. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity of R. solanacearum using AFLP markers and evaluate defense responses submitted by Capsicum spp. natives of the Amazon region, verifying the expression of pathogenesis-related proteins, resulting from infection by the pathogen. Samples were collected in four counties vegetable growers in the metropolitan area of Manaus to establish a collection of 30 isolates of the pathogen. We performed classical biochemical characterization of the isolates and characterization of genetic diversity using AFLP molecular markers. The 24 primer combinations were tested and selected the six best informative combinations . The six combinations of primers generated a 432 bands , ranging from 47 to 103 loci in the combination E + AT / M + C. The Jaccard similarity coefficient estimated between 30 isolates ranged from 0.01 to 0.98. From the similarity matrix a dendrogram was generated by UPGMA method being possible separate the isolates into six groups with cophenetic correlation coefficient of r = 0.98. The defense response submitted by Capsicum spp. were also evaluated by biochemical methods for the determination of total protein, phenylalanine ammonia lyase activity and peroxidase activity phenoloxidases. The enzymatic activity varied according to the level of resistance of the evaluated accessions, being higher in the first hours after inoculation and decreased after 72 hours. It was possible to identify two resistant accessions ( BC 05 and NT ) showed that grade point average of 1.17 xi and 0.94 . The BC had access resistance of accessions was associated with increased activity of PPO and FAL, indicating that these enzymes make up the defense mechanism in plants of Capsicum. The POX activity was lower when compared with the activity of PPO and FAL / A murcha bacteriana causada por Ralstonia solanacearum é uma das doenças mais importantes das solanáceas. Presente em todo o território nacional, causa murcha rápida das plantas e afeta várias culturas de interesse agronômico. No Amazonas, as condições de altas temperatura e umidade do ar aliados à ampla diversidade genética deste patógeno, diversidade de hospedeiros e agressividade favorecem o desenvolvimento do patógeno e dificultam o manejo desta doença. O objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade genética de R. solanacearum utilizando marcadores AFLP e avaliar as respostas bioquímicas de defesa apresentadas por acessos de Capsicum spp. nativos da região Amazônica, verificando a expressão de proteínas relacionadas com a patogênese, decorrentes da infecção pelo patógeno. Foram realizadas coletas em quatro municípios produtores de hortaliças da área metropolitana de Manaus para estabelecer uma coleção com 30 isolados do patógeno. Foi realizada a caracterização bioquímica clássica dos isolados, testes de patogenicidade e caracterização da diversidade genética utilizando marcadores moleculares AFLP. Foram testadas 24 combinações de primers e seleciondas as seis combinações mais informativas. As seis combinações de primers utilizadas apresentaram um total de 432 bandas, variando de 47 loci à 103 na combinação E+AT/M+C. O coeficiente de similaridade de Jaccard estimado entre os 30 isolados avaliados variou de 0,01 à 0,98. A partir da matriz de similaridade foi gerado o dendrograma pelo método UPGMA sendo possível separar os isolados em seis grupos com coeficiente de correlação cofenética no valor de r = 0,98. Também foram avaliadas as resposta de defesa apresentadas por acessos de Capsicum spp. através de métodos bioquímicos de determinação de proteínas totais, atividade da fenilalanina amônia liase, atividade de fenoloxidases e peroxidases. A atividade enzimática variou conforme o nível de resistência ix dos acessos avaliados, sendo maior nas primeiras horas após a inoculação e decrescendo após 72 horas. Foi possível identificar dois acessos resistentes (BC 05 e NT) que apresentaram média de notas de 1,17 e 0,94. O acesso BC apresentou A resistência dos acessos foi associada com a maior atividade da PPO e FAL, indicando que estas enzimas compõem o mecanismo de defesa em plantas de Capsicum. A atividade da POX foi menor quando comparada com a atividade da PPO e FAL.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-06T14:08:09Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Vanessa C. Franco.pdf: 1623704 bytes, checksum: 8f262fad29d3dfa20d8ab93f9518f274 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-06T14:08:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Vanessa C. Franco.pdf: 1623704 bytes, checksum: 8f262fad29d3dfa20d8ab93f9518f274 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-06T14:08:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Vanessa C. Franco.pdf: 1623704 bytes, checksum: 8f262fad29d3dfa20d8ab93f9518f274 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-06T14:08:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Vanessa C. Franco.pdf: 1623704 bytes, checksum: 8f262fad29d3dfa20d8ab93f9518f274 (MD5) Previous issue date: 2014-03-25 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alkaline phosphatase function is to catalyze the hydrolysis of a phosphomonoester, and thus has the property of removing phosphate groups 5' DNA and RNA, making it an important tool for genetic engineering. Expression of the E. coli alkaline phosphatase gene was obtained by cloning the gene into plasmid pBR322. Subsequently phoA structural gene was transferred to the vector pAC92 derivative of pUC18 where its expression was regulated partly yielding the recombinant plasmid capable of programming in E. coli highest level of expression. But this vector has the need to control the expression with glucose medium, otherwise the excess of the enzyme in the periplasm causes cell death of the host. In work carried out in the Laboratory of Technologies of DNA called a vector UFAM Pula was built from obtaining pAC92 promoter region, restored operator, cloned in a vector called pUN, this being the modified pUC18 lacking the gene for β - galactosidase and without its promoter region / operator of origin. This paper describes the expression of the alkaline phosphatase of E. coli by means of the adjustable jumps expression system and purification of this enzyme. Thus, the phoA gene was subcloned into the vector jumps successfully, yielding the vector pUNF, which appeared stable and functional, regulated by the induction of IPTG. The best expression of the enzyme in the system in question occurred in the middle with a concentration of 0.05 % glucose, with 1 mM IPTG and after 18 hours of induction. / A fosfatase alcalina tem como função catalisar a hidrólise de um fosfomonoéster, e assim, possui a propriedade de remover grupos de fosfatos 5’ de DNA e RNA, o que faz dela uma importante ferramenta para engenharia genética. A expressão do gene da fosfatase alcalina de E. coli foi obtida clonando-se o gene no plasmídeo pBR322. Posteriormente o gene estrutural phoA foi transferido para o vetor pAC92, derivado do pUC18, onde sua expressão ficou parcialmente regulada, originando o plasmídeo recombinante capaz de programar em E. coli maior nível de expressão. Porém este vetor possui a necessidade do controle da expressão com glicose no meio, do contrário, o excesso da enzima no periplasma causa a morte celular das hospedeiras. Em trabalhos desenvolvidos no Laboratório de Tecnologias de DNA da UFAM um vetor denominado pULA foi construído a partir da obtenção da região promotora do pAC92, com operador restaurado, clonado em um vetor denominado de pUN, este sendo o pUC18 modificado sem o gene de β–galactosidase e sem sua região promotora/operadora de origem. O presente trabalho descreve a expressão da fosfatase alcalina de E. coli por meio do sistema de expressão regulável do pULA, assim como a purificação desta enzima. Dessa forma, o gene phoA foi subclonado no vetor pULA com sucesso, dando origem ao vetor pUNF, que se apresentou estável e funcional, regulado pela indução do IPTG. A melhor expressão da enzima no sistema em questão, ocorreu em meio com concentração de 0,05% de glicose, com um 1mM de IPTG e após 18 horas de indução.

O bagaço de cana de açúcar é um resíduo lignocelulósico que, após a sua hidrólise, pode ser utilizado como substrato para a produção de hidrogênio (H2) por fermentação. O objetivo deste trabalho foi realizar pré-tratamentos do bagaço de cana com os ácidos clorídrico (HCl) e fosfórico (H3PO4) para a solubilização de carboidratos, produzindo o mínimo de inibidores, bem como para tornar a sua estrutura mais suscetível à hidrólise enzimática. Além disso, foi verificada a possibilidade de utilização dos hidrolisados na produção biológica de H2 por uma cultura mista de micro-organismos. A otimização das condições de pré-tratamento com os ácidos foi feita por meio de um planejamento experimental, variando-se a concentração entre 0,64 e 7,36 % (m/v), a temperatura de 63,20 a96,80°C e o tempo de 38,40 a 441,60 min. Nos hidrolisados obtidos foram determinadas as concentrações de açúcares redutores totais (ART) e de monossacarídeos, tais como a glicose, a xilose e a arabinose, além de potenciais inibidores de fermentação, o furfural, o hidroximetilfurfural (HMF) e o ácido acético. As condições de pré-tratamento do bagaço, nas quais foram obtidas as maiores concentrações de ART (13,88 g/L) foi utilizando 6,0 % (m/v) de HCl, em 360,00 min., a 90°C. Entretanto, sob estas condições, também foram detectadas as concentrações mais elevadas dos inibidores. A condição ótima para a hidrólise com o HCl, obtida através da análise estatística, na qual a concentração de inibidores foi minimizada e a de ART maximizada foi de 96,80ºC, 441,6 min e 7,36 % (m/v) de ácido. Para o pré-tratamento com o H3PO4, as condições ótimas foram as mesmas encontradas para o HCl, obtendo-se 4,98 g/L de ART. Os bagaços pré-tratados foram submetidos à hidrólise enzimática com a enzima Celluclast® e um extrato enzimático bruto com atividade de xilanases. A maior concentração de ART (20,98 g/L) obtida pelas duas hidrólises (ácido/enzimática) foi no bagaço pré-tratado com HCl no tempo de 360,00 min., 6,0 % (m/v) de ácido a 90°C, o qual também apresentou a maior concentração de inibidores (total de 1,23 g/L). O hidrolisado obtido com HCl que apresentou maior concentração de ART foi utilizado em ensaios de fermentação para a produção de H2 por cultura mista. / Sugarcane bagasse is a lignocellulosic residue that can be used as substrate to produce hydrogen (H2) by fermentation after hydrolysis. This study aimed to optimize the pretreatment of sugarcane bagasse with hydrochloric acid (HCl) and phosphoric acid (H3PO4), to solubilize carbohydrates and produce the minimal amount of inhibitors as well as make its structure more susceptible to enzymatic hydrolysis. In addition, we verified the possibility of using hydrolysates in the biological production of H2 by a mixed culture of microorganisms. We optimized the conditions for bagasse pretreatment with acids using an experimental designwe varied the concentration between 0.64 and 7.36% (w/v), the temperature from 63.20 to 96.80 °C, and the time from 38.40 to 441.60 min. In the hydrolysates, we determined the concentrations of total reducing sugars (TRS); monosaccharides such as glucose, xylose, and arabinose; and potential inhibitors of fermentation like furfural, hydroxymethylfurfural (HMF), and acetic acid. The conditions of bagasse pretreatment 6.0% (w/v) HCl, 360 min. and 90 °C led to the highest TRS concentrations (13.88 g L-1), but also to the highest concentrations of inhibitors. Statistical analysis revealed that the optimum conditions for the hydrolysis of sugar cane bagasse with HCl that minimized the concentration of inhibitors while maximizing the TRS concentration were: 96.80 °C, 441.6 min, and 7.36% (w/v) of acid. The optimum conditions for pre-treatment with H3PO4 were the same as those found for HCl; which yielded 4.98 g L-1 TRS. We subjected the pretreated bagasse to enzymatic hydrolysis with Celluclast® enzyme and to a crude enzyme extract with xylanase activity. For both hydrolyses (acid and enzymatic), the highest TRS concentration (20.98 g L-1) was achieved with the bagasse pretreated with HCl 6.0% (w/v) at 90 °C for 360.00 min., which also furnished the highest concentration of inhibitors (total 1.23 g L-1). The hydrolysate obtained with HCl contained higher TRS concentration was used as substrate in fermentation assays for the production of H2 by mixed culture.

Os osteoblastos são responsáveis pelo início do processo de biomineralização óssea mediada pela liberação de vesículas da matriz (MVs). As MVs surgem por brotamento das superfícies laterais dos osteoblastos e são secretadas para a matriz. A membrana das MVs possuem níveis elevados de Fosfatase Alcalina (TNAP), entre outra enzimas/proteínas, bem como de Chol, em comparação com a membrana plasmática. O objetivo deste estudo foi a construção de proteolipossomos constituídos por Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ou Dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), com Colesterol (Chol) em diferentes proporções para a caracterização cinética da TNAP, utilizando os substratos ATP, PPi e ADP, a fim de se obter um sistema que mimetize as MVs. O aumento da concentração de Chol dificultou a incorporação da TNAP aos sistemas constituídos com DPPC, e facilitou a sua incorporação aos constituídos por DOPC. A presença do Chol em todos os sistemas miméticos preparados afetou os parâmetros cinéticos de hidrólise da TNAP para todos os substratos estudados. Entretanto, independentemente da presença do Chol, a hidrólise do PPi apresentou sempre uma maior eficiência (maior kcat/K0.5), sugerindo que este substrato provavelmente possa ser hidrolisado preferencialmente. O tratamento com 2 mM de ciclodextrina (bmCD), resultou na remoção de apenas 70% do Chol de proteolipossomos constituídos por DPPC:Chol 36% mol. Estudos de calorimetria diferencial (DSC) revelaram que a bmCD fica ligada ao sistemas vesiculares causando interferência para os demais ensaios. Quando 36% mol de colestenona (Achol), um análogo de Chol, foi empregado na construção dos proteolipossomos de DPPC, foram encontrados comportamentos cinéticos distintos para a TNAP. O ATP foi hidrolisado com uma Vmáx menor que a os sistemas constituídos por DPPC:Chol 36% e maior do que para sistemas de DOPC:Chol 36% mol. Os valores de K0.5 foram menores para DPPC:Achol 36 % mol em comparação aos sistemas análogos. Com relação a hidrolise do PPi, os parâmetros cinéticos foram similares, em relação aos sistemas estudados contendo DPPC:Chol ou DOPC:Chol. Por fim, foi avaliada a capacidade de propagação de nódulos de mineralização pelos sistemas vesiculares contendo DPPC, DPPC:Chol e DPPC:Achol (com e sem TNAP incorporada), utilizando o ATP como substrato. A mineralização foi cerda de 16 vezes mais eficiente na presença de protelipossomos que continham tanto Chol ou colestenona, do que para o sistema somente constituído por DPPC (cerca de 4 vezes), quando comparados com os respectivos sistemas de lipossomos (na ausência de enzima). Diante destas diferenças apresentadas, tanto no comportamento cinético, quanto na capacidade de mineralização, pode-se suger que o microambiente lipídico tem um importante papel das MVs. Uma explicação que pode ser sugerida é que fatores termodinâmicos como: a diminuição da entalpia de transição; perda de pré-transição; presença de cargas superficiais; presença de diferentes substratos; bem como, orientações das ligações de hidrogênio com a molécula de água na superfície dos proteolipossomos, podem acarretar em modificações conformacionais na TNAP. A relevância dos resultados apresentados pode contribuir no entendimento da função dos lipídios e de suas interações com as proteínas presentes na MVs no processo de biomineralização. / Osteoblasts are responsible for initiating the bone biomineralization process mediated by the release of matrix vesicles (MVs). The MVs arise by budding from the membrane of the osteoblasts and are secreted into the matrix. The MVs membrane has high levels of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), among other enzymes/proteins, as well as cholesterol, compared with the plasma membrane. The objective of this study was to build proteoliposomes constituted by Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) or dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), with cholesterol (Chol) in different molar ratios for the kinetic characterization of TNAP, using the substrates ATP, ADP and PPi, in order to obtain systems that mimic the MVs. The increase in the cholesterol concentration hampered the incorporation of TNAP into the DPPC systems, but favored its incorporation into the DOPC liposomes. The presence of cholesterol in all prepared mimetic systems affected the kinetic parameters of hydrolysis for all substrates studied. Regardless of the presence of cholesterol, PPi hydrolysis always showed greater catalytic efficiency (kcat/K0.5), suggesting a preferential hydrolysis of this substrate. Treatment with 2 mM cyclodextrin (BMCD) resulted in removal of 70% of the cholesterol from the proteoliposome constituted of DPPC:Cholesterol 36% (molar ratio). Differential scanning calorimetry (DSC) studies showed that BMCD was bound to the vesicular systems interfering with the other assays. When 36% of cholestenone (Achol), an analogue of cholesterol, was employed in the construction of DPPC proteoliposomes, a different kinetic behavior was observed for TNAP. The Vmax for ATP hydrolysis was lower compared with the systems constituted of DPPC:Chol 36% and higher than that obtained for the DOPC:Chol 36% system. The values of K0.5 were lower for DPPC:Achol 36% compared to the similar systems. With respect to the hydrolysis of PPi, the kinetic parameters were similar for the systems constituted of DPPC:Chol and DOPC:Chol. Finally, we evaluated the ability of the vesicular systems containing DPPC, DPPC:Chol and DPPC:Achol (with and without TNAP incorporated) to propagate mineralization nodules, using ATP as substrate. The mineralization was about 16 times more efficient in the presence of proteoliposomes containing Chol or Achol than for the system constituted of DPPC only (about 4 times more efficient) compared with the corresponding liposome (in the absence of enzyme). Given the differences observed for both the kinetic behavior and the mineralization ability of the different systems, we suggest that the lipid microenvironment plays an important role in MVs function. A possible explanation for these differences is that thermodynamic factors such as the decrease in the enthalpy of transition and the loss of pre-transition, as well as the presence of surface charges, the presence of different substrates, and the orientation of hydrogen bonds with the water molecule on the surface of the proteoliposomes, may cause conformational changes in TNAP molecule. These relevant results can contribute for the understanding of the role of lipids and their interactions with proteins present in MVs in the biomineralization process.

A dinâmica estrutural fundamentando a função das xilanases GH11 ainda não está clara. Novo conhecimento sobre a dinâmica catalítica dessas enzimas é crucial para a engenharia de novas enzimas melhoradas beneficiando, assim, diversas indústrias biotecnológicas e de química verde. Com base nesse fato, esse trabalho teve por objetivo obter novas informações acerca da dinâmica catalítica de uma xilanase GH11, através do uso de um conjunto de diversas técnicas avançadas de biofísica molecular em nível bulk e em nível de molécula única (inglês single molecule ou sm). Para isso, foram projetadas xilanases GH11 de Bacillus subtilis ssp. subtilis 168 (XynA) com mutações únicas de cisteína para a marcação dos resíduos D119 e R122 no domínio polegar, do resíduo N54 no domínio dedos, e do resíduo N151 na alfa-hélice, seguidas pela sua construção e produção por métodos de biologia molecular. Esses mutantes foram marcados em seus respectivos grupos tióis com a sonda fluorescente sensível à polaridade Acrylodan, com a sonda de spin MTSSL, e com a sonda fluorescente fotoestável AttoOxa11. A xilanase tipo selvagem for marcada em seu N-terminal com a sonda fotoestável Alexa Fluor® 488 5-SDP Ester. Foram utilizados ensaios de espectrofotometria de fluorescência em nível bulk e de espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica para investigar como a dinâmica do domínio polegar da xilanase GH11, temperatura, e ligação ao substrato se correlacionam um com o outro. Os resultados atestaram que um estado do domínio polegar controlado por temperatura, aberto, dinâmico e flexível tem mais chances de se ligar efetivamente ao substrato de uma maneira produtiva, o que está em completo acordo com estudos anteriores de simulação de dinâmica molecular, cristalografia, desnaturação térmica, e análise funcional por desenho racional de mutantes de domínio polegar de xilanases GH11. Com base nas evidências adquiridas e em estudos anteriores, nós propomos um conjunto de hipóteses e modelos para a dinâmica catalítica da xilanase, focando no papel do domínio polegar nesse processo. No intuito de determinar a constante de afinidade da xilanase por seu substrato e os tempos de relaxamento e constantes de velocidade dos movimentos do domínio polegar, foram feitas medidas de espectroscopia de correlação de fluorescência simples e combinada com transferência eletrônica fotoinduzida, usando as xilanases marcadas com as sondas fluorescentes fotoestáveis, na presença e na ausência de substrato. Os resultados mostraram tempos de difusão muito maiores para as xilanases na presença de substrato, como efeito da afinidade da enzima pelo mesmo. Entretanto, não foi verificada nenhuma curva de decaimento como efeito de supressão dinâmica da sonda por PET. Esses mesmos conjugados foram aplicados com sucesso em microscopia por imagem de tempo de vida de fluorescência, no intuito de analisar sistematicamente a afinidade da xilanase por partículas insolúveis e filmes de substrato, e por fragmentos insolúveis de frações de processos de deslignificação e desestruturação de bagaço de cana-de-açúcar, assim como para a análise da composição, estrutura e topologia desses materiais. Foi possível verificar a presença de xilano na maioria das frações desse bagaço tratado, mas em quantidades variáveis / The structural dynamics underlying the function of GH11 xylanases is still unclear. New insights into the catalytic dynamics of these enzymes are crucial for engineering novel improved enzymes benefiting biotechnological and green chemistry industries. The objective of this work was to obtain new information concerning the catalytic dynamics of a GH11 xylanase, by using a combination of advanced molecular biophysics techniques, both at the bulk level and at the single molecule level (sm). Mutant GH11 xylanases from Bacillus subtilis ssp. subtilis 168 (XynA) were designed with single point cysteine mutations for labeling the residues D119 and R122 on the thumb domain, N54 on the fingers domain, and N151 on the alpha helix, followed by their construction and production by molecular biology methods. These mutants were labeled at their respective thiol groups by the polarity sensitive fluorescent probe Acrylodan, by the electron spin probe MTSSL, and by the photostable fluorescent probe AttoOxa11. The wild-type xylanase was labeled at its N-terminus by the photostable fluorescent probe Alexa Fluor® 488 5-SDP Ester. Bulk fluorescence spectrophotometry and electron paramagnetic resonance assays were used to investigate how the thumb domain dynamics of the GH11 xylanase, temperature and substrate binding were correlated. These results demonstrated that a temperature controlled, open, dynamical and flexible thumb domain state is more likely to effectively bind the substrate in a productive way, which is in complete agreement with previous studies from molecular dynamics simulations, crystallography, thermal denaturation, and function analysis by the rational design of thumb mutants for GH11 xylanases. Based on this evidence and previous studies, we proposed a hypothesis for the xylanase catalytic dynamics, focusing on the role of the thumb domain. In order to determine the xylanase affinity constant for its substrate and the relaxation times and rate constants of the thumb domain movements, fluorescence correlation spectroscopy measurements were performed. Both simple and combined measurements with photoinduced electron transfer were performed, using the xylanases labeled with photostable fluorescent probes, in the presence and absence of substrate. The results have shown longer diffusion times for the xylanases in the presence of substrate, as an effect of the enzyme affinity for it. However, it was not verified any decay curve as an effect of the dynamic suppression of the probe via PET. The same conjugates were successfully applied to fluorescence-lifetime imaging microscopy, aiming to systematically analyze the affinity for xylanase of substrates in the form of insoluble particles and films, and for water insoluble fractions from sugarcane bagasse delignification processes. In addition, the composition, structure and topology of these materials was examined. It was possible to verify the presence of xylan in most fractions of this treated bagasse, although in variable quantities

O capítulo 1 descreve o estudo da biorredução do grupo carbonílico de cetoazidas e β-ceto-1,2,3-triazois para a produção de β-hidroxi-1,2,3-triazois enantiomericamente puros ou enriquecidos. Cinco linhagens de fungos de origem marinha foram avaliadas para a redução da 2-azido-1-feniletanona 1 e duas linhagens, A. sydowii CBMAI 935 e M. racemosus CBMAI 847, foram selecionadas também para a biorredução das 2-azido-1-feniletanonas 2-4 para a produção dos (R)- e (S)-2-azido-1-feniletanois 2a-4a. Os azidoálcoois enantiomericamente enriquecidos obtidos 1a-4a das reações biocatalíticas foram empregados como material de partida para a síntese dos β-hidroxi-1,2,3-triazois 7a-10a enantiomericamente enriquecidos através da click reaction entre a azida terminal e o alcino, fenilacetileno. Uma segunda abordagem para a obtenção de β-hidroxi-1,2,3-triazois enantiomericamente enriquecidos foi o estudo da biorredução de β-ceto-1,2,3-triazois, que são cetonas contendo dois substituintes volumosos. Uma triagem inicial para a biorredução do β-ceto-1,2,3-triazol 7 foi realizada com seis linhagens de fungos de origem marinha, na qual a linhagem do fungo P. citrinum CBMAI 1186 foi selecionada para estudos de otimização da reação biocatalítica. Estudos com variação do meio reacional, utilização de co-solvente e efeito do pH mostraram que as condições ótimas de reação foram utilizando-se tampão fosfato (Na2HPO4/KH2PO4, 0,07 M) em pH 5 e metanol 5% (v/v) como co-solvente. O fungo P. citrinum CBMAI 1186 foi empregado na biorredução dos β-ceto-1,2,3-triazois 8-12 com excelentes resultados de rendimento e seletividade para a produção dos (S)-β-hidroxi-1,2,3-triazois 8a-12a. O Capítulo 2 apresenta a síntese multienzimática da diidropinidina, um alcaloide de origem natural. A nonano-2,6-diona utilizada como material de partida foi obtida através da descarboxilação do dicetoéster, 2-butiril-5-oxo-hexanoato de etila. Estudos para a otimização tanto da síntese do dicetoéster quanto da etapa de descarboxilação foram realizados. Condições ótimas de produção do 2-butiril-5-oxo-hexanoato de etila foram obtidas através da reação da but-3-em-2-ona com o 3-oxo-hexanoato de metila catalisada por CeCl3/NaI. A descarboxilação do dicetoéster foi avaliada através do método de Krapcho empregando-se sais de cloro e água em altas temperaturas, entretanto, a elevada formação de subprodutos estimulou a busca por uma diferente metodologia para a obtenção da nonano-2,6-diona. Foram avaliadas diferentes lipases e esterases para a hidrólise enzimática do dicetoéster seguida por descarboxilação por HCl, na qual a esterase de fígado de porco foi selecionada e promoveu a hidrólise de até 1,6 M de dicetoéster para a produção da nonano-2,6-diona. Diferentes transaminases (TAs) foram estudadas para a aminação redutiva assimétrica da nonano-2,6-diona e duas linhagens foram selecionadas para a produção da (R)- e (S)-2-metil-6-propil-2,3,4,5-tetra-hidropiridina, as TAs de Arthrobacter sp. e Arthrobacter citreus, respectivamente empregando-se isopropilamina como amino doador. As (R)- e (S)-2-metil-6-propil-2,3,4,5-tetra-hidropiridina foram avaliadas pela redução assimétrica para a síntese da diidropinidina por imina redutases (IREDs) e duas linhagens foram selecionadas, a IRED de Mesorhizobium sp. e Norcardiopsis alba, respectivamente. TAs e IREDs foram acopladas em um sistema one-pot multienzimático utilizando como material de partida a nonano2,6-diona (100 mM) para a obtenção dos isômeros cis da diidropinidina com excelentes excessos diastereoisoméricos. / The Chapter 1 describes the bioreduction of the carbonyl group of ketoazides and β-keto-1,2,3-triazoles to produce enantiomerically pure or enriched β-hydroxy-1,2,3-triazoles. Five marine-derived fungi strains were screened to perform the reduction of 2-azido-1-phenylethanone 1. The strains from A.sydowii CBMAI 935 and M. racemosus CBMAI 847 were selected for the bioreduction of the 2-azido-1-phenylethanones 2-4 to yield the (R)- and (S)-2-azido-1-phenylethanols 2a-4a. The enantiomerically enriched azidoalcohols 1a-4a obtained from biocatalytical reactions were used as starting materials for the synthesis of enantiomerically enriched β-hydroxy-1,2,3-triazoles 7a-10a through the click reaction between the terminal azide and phenylacetylene. A second approach for obtaining enantiomerically enriched β-hydroxy-1,2,3-triazoles was the bioreduction of β-keto-1,2,3-triazoles, which are ketones with two bulky substituents. The screening for the bioreduction of the β-keto-1,2,3-triazol 7 was performed with six marine-derived fungi strains and P. citrinum CBMAI 1186 was selected for the optimization studies for the biocatalytic reduction of β-keto-1,2,3-triazoles 8-12.Studies about the composition of reaction medium, use of cosolvent and pH effect showed that the optimal conditions was in phosphate buffer (Na2HPO4/KH2PO4, 0.07 M) at pH 5 and methanol 5% (v/v) as cosolvent. P. citrinum CBMAI 1186 was applied to the bioreduction of β-keto-1,2,3-triazoles 8-12 and good yields and selectivities were obtained for the (S)-β-hydroxy-1,2,3-triazoles 8a-12a. The Chapter 2 describes the multienzymatic synthesis of dihydropinidine, a natural alkaloid. The nonane-2,6-dione used as starting material was obtained through the reduction of the diketoester, methyl butyryl-5-oxohexanoate, and the optimization studies for both diketoester synthesis and decarboxylation reaction were performed. Optimal conditions for the synthesis of methyl butyryl-5-oxohexanoate were obtained by the reaction between but-3-en-2-one and 3-oxohexanoate catalyzed by CeCl3/NaI. The diketoester decarboxylation step was evaluated by the Krapcho method using chlorine and water at high temperatures. However, because of the production of side products by this method, a different procedure for the synthesis of nonane-2,6-dione was studied. Different enzymes (lipases and esterases) were evaluated for the diketoester hydrolysis followed by decarboxylation by HCl. The porcine liver esterase was selected to promote the diketoester hydrolysis up to 1.6 M, yielding nonane-2,6-dione. Different transaminases (TAs) were applied to the asymmetric reductive amination of the nonane-2,6-dione and TAs from Arthrobacter sp. e Arthrobacter citreus were selected for the production of (R)- and (S)-2-methyl-6-propyl-2,3,4,5-tetrahydropyridine, respectively, using isopropylamine as the amine donor. The asymmetric reduction of (R)- and (S)-2-methyl-6-propyl-2,3,4,5-tetrahydropyridine by imine reductases (IREDs) was evaluated and the IREDs from Mesorhizobium sp. and Norcardiopsis alba were selected. TAs and IREDs were coupled in multienzymatic one-pot system using nonane-2,6-dione (100 mM) as starting material for the syntheses of cis isomers of dihydropinidine in excellent diastereoisomeric excess.

O Brasil é um país com forte produção agrícola, produzindo anualmente uma grande quantidade de biomassa vegetal, proveniente de resíduos agroflorestais, como o bagaço de cana-de-açúcar, a casca de café, entre outros. As biomassas de origem vegetal são constituídas basicamente por frações de celulose, hemicelulose e lignina que encontram-se intimamente associadas dando origem a uma estrutura recalcitrante do vegetal. O presente estudo teve como objetivo contribuir para o emprego de uma nova matéria-prima, a casca de café, para obtenção de produtos com valor agregado. Foi analisado a composição química da casca de café para determinar os valores de compostos extrativos, celulose, hemicelulose, lignina e cinzas. Foi analisado também diferentes condições de pré-tratamento ácido e pré-tratamento alcalino, seguido de sacarificação, da casca de café. Os hidrolisados obtidos foram submetidos à fermentação pelas leveduras Scheffersomyces shehatae UFMG-HM 52.2 e Candida guilliermondii FTI 20037 para produção de etanol e xilitol, respectivamente e Saccharomyces cerevisiae 174 para produção de etanol pelos métodos SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation) e SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation). A caracterização química da casca de café apresentou concentrações de 38,05% de compostos extrativos, 24% de celulose, 19% de hemicelulose, 13,68% de lignina e cerca de 0,36% em cinzas. As melhores condições de pré-tratamento ácido forneceram um hidrolisado com 31,35 g/L de xilose, 12,42 g/L de glicose, 1,25 g/L de ácido acético e pH de 0,8. A fermentação do hidrolisado ácido produziu 6,1 g/L de etanol, com um Yp/s de 0,27 g/g. A fermentação do hidrolisado hemicelulósico de casca de café para produção de xilitol apresentou valores de 2,82 g/L do produto, com um Yp/s de 0,16 g/g. A produção de etanol pelo método SHF a partir do hidrolisado enzimático da casca de café foi de 4,89 g/L nas primeiras 12 horas de fermentação, com Yp/s de 0,20 g/g. A fermentação pelo método SSF produziu 4,66 g/L de etanol, com um Yp/s de 0,17 g/g de etanol no período de 18 horas de fermentação. Frente a isto é possível concluir que a casca de café é uma biomassa com potencial para uso em processos biotecnológicos na produção de compostos com valor agregado como etanol e xilitol. / Brazil is a country with strong agriculture, producing a large amount of plant biomass from agroindustrial waste, such as sugarcane bagasse, coffee husk, among others. Biomasses from plants are basically constituted of cellulose, hemicellulose and lignin, which are deeply associated, resulting in a recalcitrant structure in the plant. The present study aimed at contributing for the application of a new feedstock, coffee husk, for obtaining value-added products. The chemical composition of the coffee husk was analyzed in order to determine values of extractive compounds, cellulose, hemicellulose, lignin and ashes. It was also analyzed different conditions of acid pretreatment and alkaline pretreatment, followed by saccharification, of coffee husks in order to improve the release of sugars. The hydrolysates were fermented by the yeasts Scheffersomyces shehatae UFMG-HM 52.2 and Candida guilliermondii FTI 20037 for the production of ethanol and xylitol, respectively, and by the yeast Saccharomyces cerevisiae 174 for the production of ethanol through SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation) and SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) methods. Chemical characterization of the coffee husk presented 38.05% of extractive compounds, 24% of cellulose, 19% of hemicellulose, 13.68% of lignin and around 0.36% of ashes. The best conditions for acid pretreatment yielded 31.35 g/L in xylose, 12.42 g/L glucose and 1.25 g/L acetic acid in 0.8 pH. Acid hydrolysate fermentation of coffee husk produced 6.1 g/L of ethanol, with an YP/S of 0.16 g/g. Ethanol production through SHF methods from enzymatic hydrolysate of coffee husk yielded 4.89 g/L in the first 12 hours of the process, with an YP/S of 0.20 g/g. SSF process yielded 4.66 g/L of ethanol with YP/S of 0.17 g/g after 18 hours of fermentation. It is possible to conclude, thus, that coffee husk is a biomass with potential for biotechnological applications in the production of value-added compounds, such as ethanol and xylitol.

Bilirrubina oxidase de Myrothecium verrucaria é uma multicobre oxidase capaz de reduzir O2 pela oxidação de fenóis, aminas aromáticas e polipirróis. Eletroquimicamente, essa reação de redução ocorre pela transferência de elétrons entre a enzima e um eletrodo. Nesta tese, foi investigada a eficiência da enzima como agente redutor de O2 na superfície de eletrodos modificados pela função orgânica naftil-2-carboxilato por acoplamento de diazônio. Essa modificação na superfície do eletrodo aumenta em até quatro vezes a atividade do filme catalítico em relação à obtida por eletrodos em que a adsorção da enzima foi feita de forma convencional, sem a modificação. Foram estudados os efeitos da temperatura sobre a atividade da enzima para a redução de O2, sendo observado um aumento linear da atividade do eletrodo com o aumento da temperatura até 30 °C, de tal forma que temperaturas mais altas proporcionaram o aumento da inativação natural das moléculas de enzima. Esse efeito de inativação foi confirmado pela diminuição da atividade com o tempo na presença de O2, por cronoamperometria, sendo a atividade interrompida pela inserção de argônio e retomada do mesmo ponto pela reinserção de O2, descartando a idéia da queda de corrente proveniente da dessorção de enzima. Foi estudado também o efeito do pH na máxima atividade da bilirrubina oxidase, conduzidos entre pH 5,0 e 8,0, e verificando-se que a máxima atividade da enzima foi obtida entre pH 5,5 e 6,0 e, além disso, verificou-se que a corrente catalítica em baixos valores de pH aumenta diretamente com o aumento do sobrepotencial aplicado. Porém, em altos valores de pH, a curva de redução toma a forma sigmoidal e passa a ser independente do sobrepotencial aplicado, sendo a reação governada por etapas químicas de transferência de prótons. O uso de eletrodos de disco rotatório possibilitou resolver parâmetros de Michaelis-Menten para a cinética do filme catalítico de forma mais precisa (a resposta de corrente é menos dependente do transporte de massa de reagentes) e esses dados foram obtidos dentro de um intervalo de pH importante para aplicações práticas. O sobrepotencial da reação de redução de O2 catalisada por bilirrubina oxidase foi comparado com o sobrepotencial obtido para a mesma reação catalisada por Platina eletrodepositada sobre a superfície de grafite pirolítico, onde foi observado um sobrepotencial de 140 mV para a catálise enzimática, demasiado menor que o valor de 415 mV obtidos para a Platina, sob as mesmas condições experimentais, em pH neutro. A metodologia proposta para a construção de um cátodo para aplicação em células a combustível enzimáticas e os subsequentes estudos possibilitaram uma investigação minuciosa para caracterizar a enzima bilirrubina oxidase como talvez o catalisador mais eficiente na redução eletroquímica de oxigênio molecular em células a combustível até o momento. / Bilirubin oxidase from Myrothecium verrucaria is a multicopper oxidase reducing O2 at the expenses of phenols, aromatic amines and polypyrrols oxidation. Electrochemically, this reduction reaction undergoes through the electron transfer between enzyme and electrode. In this thesis, the enzyme was investigated as an efficient O2 reducing agent on electrode surfaces modified by naphthil-2-carboxylate functionalities through diazonium coupling. This modification of the electrode surface increases the activity of the catalytic film up to four times comparing to that obtained by electrodes in which the enzyme molecules were adsorbed conventionally, without modification. It was studied the effect of temperature on O2 reduction, in which catalysis increased linearly with temperature up to 30 °C, and higher temperatures increased the natural enzyme inactivation. This inactivation was confirmed by the activity drop off with time in the presence of O2, by chronoamperometry, ceased out when argon was inserted into the cell and re-established from the same point when argon was purged out by insertion of O2. These results cast aside the idea of activity drop off caused by enzyme desorption. It was also investigated the pH effect on the maximum activity of bilirubin oxidase, carried out between pH 5.0 and 8.0, being the highest activity obtained at pH 5.5-6.0. Furthermore, it was observed that the catalytic current directly increases with applied overpotential, at low pH values, and the reduction wave shape becomes sigmoidal and independent on applied overpotential at high pH values. The reaction is then governed by chemical steps, as the proton transfer. The use of rotating-disc electrodes favored solving the Michaelis-Menten kinetics for the catalytic film in a much greater accuracy (the current response is much less dependent on reagent mass transport) and these data were obtained for pH interval important for practical applications. The overpotential for the O2 reduction reaction catalyzed by bilirubin oxidase was compared to the overpotential obtained by the same reaction catalyzed by Platinum electrodeposited onto a pyrolytic graphite electrode. An overpotential of only 140 mV was observed for the enzymatic catalysis, much lower compared to the 415 mV obtained for the Platinum electrode, under the same experimental conditions, at neutral pH. The proposed method for constructing a cathode for enzymatic fuel cell application and subsequent investigation described allowed an in-depth study of bilirubin oxidase characterization as perhaps the most efficient catalysts for the electrochemical reduction of molecular oxygen in fuel cells to date.

A glândula pineal é um órgão neuroendócrino regulado pelo fotoperíodo ambiental. Sua principal inervação é constituída por fibras simpáticas provenientes do gânglio cervical superior que, liberando noradrenalina, ativa receptores b1 adrenérgicos resultando na produção noturna de melatonina, cuja biossíntese envolve a conversão da serotonina à NAS. O ATP, co-liberado com a noradrenalina, liga-se a receptores purinérgicos presentes na pineal e leva a uma potenciação da produção de NAS. Após a liberação, o ATP sofre rápida degradação enzimática, degradação esta, funcionalmente importante, uma vez que metabólitos do ATP atuam como ligantes em diferentes receptores. Os receptores purinérgicos são classificados em duas grandes famílias: receptores P1, que reconhecem adenosina e, receptores P2, que reconhecem principalmente ATP, ADP e AMP. Várias famílias de enzimas estão envolvidas na hidrólise de ATP liberado para o meio extracelular, sendo elas: as E-NTPDases, as E-NPPs e a ecto-5\'-nucleotidase. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a expressão gênica, a distribuição celular e a atividade das ecto-nucleotidases na glândula pineal de ratos a fim de aprimorar a caracterização do sistema purinérgico neste órgão. / The pineal gland is a neuroendocrine organ regulated by environmental photoperiod. Its main innervation is constitute by fibers from the sympathetic superior cervical ganglion that by releasing noradrenaline active b1 adrenergic receptors resulting in the nocturnal production of melatonin whose biosynthesis involves the conversion of serotonin to NAS. ATP, co-released with norepinephrine binds purinergic receptors present in the pineal gland and leads to an enhancement of the production of NAS. After release, ATP and other nucleotides are rapid enzymatic degradation, this degradation is functionally important since ATP metabolites act as ligands in different receivers. Purinergic receptors are classified into two large families: P1 receptors that recognize adenosine and P2 receptors that recognize mainly ATP, ADP and AMP. Several families of enzymes are involved in the hydrolysis of ATP released into the extracellular environment: the E-NTPDase, E-NPP and the ecto-5\'-nucleotidase. This study aimed to characterize the gene expression, the cellular distribution and activity of ecto-nucleotidases in the rat pineal gland in order to improve the characterization of the purinergic system in this organ.

Ácidos graxos são requeridos para a manutenção da função celular e atuam como moduladores da secreção de insulina induzida. Os importantes sítios de formação de EROs são a mitocôndria e a NAD(P)H oxidase, a primeira pode alterar a produção de EROs em função da atividade metabólica e a segunda tem sua atividade regulada por diversos fatores, dentre eles a PKC .O ácido oléico, junto com o palmítico, é um dos AGs mais abundantes na circulação. O tratamento agudo (1 hora) com 100 µM de ácido oléico aumentou a secreção de insulina associado ao aumento no metabolismo do AG. A oxidação desse ácido graxo induziu aumento no conteúdo de EROs em 16,7 mM de glicose com participação da NAD(P)H oxidase. Apesar da reconhecida função da EROs como sinalizadores, a diminuição de EROs induzida pela inibição da NAD(P)H oxidase promoveu aumento relativo na oxidação da glicose. A secreção relativa de insulina aumentou após inibição da NAD(P)H oxidase, sugerindo função regulatória das EROs no metabolismo da glicose e, conseqüentemente, da secreção de insulina. Dessa forma, o ácido oléico é capaz de aumentar a secreção de insulina com participação da NAD(P)H oxidase e as EROs produzidas por essa enzima promovendo a regulação do metabolismo da glicose. / Fatty acids are required to maintain cellular functioning and are able to modulate insulin secretion from pancreatic islets. The important sites of ROS production are the mitochondria and the NAD(P)H oxidase. The mitochondrial ROS release depends on cellular activity and NAD(P)H oxidase activity depends on many factors, including PKC. Acute (1 hour) exposure to oleic acid increased insulin secretion at 16.7 mM glucose. The insulin secretion induced by OA was associated to increased fatty acid oxidation and decreased glucose metabolism. Also, at 16.7 mM glucose, OA oxidation increased ROS production mediated by NAD(P)H. ROS decreased content induced by NAD(P)H oxidase inhibition induced glucose oxidation re-establishment after OA stimulus. The relative secretion was stimulated by NAD(P)H oxidase inhibition after OA stimulus. This suggests that ROS produced by NAD(P)H oxidase act as glucose metabolism regulators in the pancreatic cell. In consequence of glucose metabolism re-establishment the insulin secretion was increased. In conclusion, ROS produced by NAD(P)H oxidase are regulators of glucose metabolism. The glucose metabolism regulation may be in part responsible for the increased insulin secretion induced by ROS.