Orientador: Edson Luiz Furtado / Banca: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Marcos Antonio Machado / Banca: Mariangela Cristofani Yali / Banca: Sylvia Dias Guzzo / Resumo: A ferrugem causada por Puccinia psidii é uma das principais doenças do eucalipto no Brasil, provocando prejuízos em viveiros e no campo. Ataca plantas jovens com menos de dois anos de idade, sempre em órgãos tenros como primórdios foliares e terminais de galhos. A resistência genética é apontada como a melhor opção para o controle da doença, mesmo em genótipos suscetíveis é possível ativar os mecanismos de resistência por meio de tratamento com agentes bióticos ou abióticos, sendo conhecida como 'indução de resistência'. Com o objetivo de estudar os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos no processo de defesa do eucalipto contra P. psidii, quatro ensaios foram executados com mudas de dois genótipos híbridos (Eucalyptus grandis x E. urophylla) denominados VR e C0. No primeiro ensaio, mudas foram tratadas com Acibenzolar-S-metil (ASM), Agro-Mos, Saccharomyces cerevisiae, Dipel, Ecolife40 e Crop-set, cinco dias antes da inoculação com o patógeno. A severidade da doença foi estimada 15 dias após a inoculação por meio de comparação com uma escala de notas. Nos tratamentos mais eficientes analisou-se a atividade das enzimas quitinase e peroxidase, 48 horas após inoculação (h.a.i). No segundo ensaio as mudas foram tratadas com ASM cinco dias antes da inoculação e a atividade de peroxidase e quitinase foi determinada 0, 24, 72 e 96 h.a.i nas folhas em diferentes estágios de desenvolvimento (1º, 2º e 4º pares). No terceiro ensaio a ação dos indutores ASM e S. cerevisiae, aplicados cinco dias antes da inoculação, foi correlacionada com possíveis alterações bioquímicas nas plantas. A atividade de quitinase, peroxidase, fenilalanina amônialiase (FAL) e polifenoloxidase em folhas do 1º e 2º pares coletadas em 5 períodos 0, 24, 48, 72 e 96 h.a.i. foi determinada. Finalmente, no quarto ensaio foi analisado o padrão de expressão gênica... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Common bacterial blight of snap bean (CBCSB), caused by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli responsible for expressive culture damage and reduction of seeds production and quality. The environmental impact of the indiscriminate use of pesticides has lead to search alternative methods of plant pathogens control. Resistance inducers have been efficiently successful on several plant pathogens control. Thus, this study aimed to evaluate the potential of alcohol extracts of Lippia alba (Melissa), Lippia sidoides (pepper-rosmarin), Mikania glomerata (guaco), Equisetum sp. (horsetail) and Hedera helix (English Ivy), essential oils of Rosmarinus officinalis (rosemary) and Cinnamomum zeylanicum (cinnamon) and, pyraclostrobin and acibenzolar-S-metil on the control of common bacterial blight in snap beans, Bragança cultivar. These products were used in the following assays: in vitro bactericidal activity (except for acibenzolar-S-metil), in vivo activity of greenhouse-cultivated plants treated with products and the area under the disease progress curve (AUPDC) was calculated; activity of poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins in treated anduntreated bean leaves, infected and non-infected leave collected in different stages (0, 3, 5, 8 and 10 days after sprinkling with alcohol extracts, essential oils, acibenzolar-S-metil and pyraclostrobin). Results showed in vitro activity against X. axonopodis pv. phaseoli for L. alba and L. sidoides extracts, and essential oils while pyraclostrobin did not show any in vitro activity effect. L. Alba alcohol extract, pyraclostrobin and acibenzolar-S-methy showed the lowest AUPDC values compared to control treatment. The highest poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins values were observed in plant leaflets sprinkled with these products which probably are related to resistance induction. Essential oils did not show difference on AUPDC nor protein induction. / Doutor

Orientador: Wilma Aparecida Starke Buzetti / Banca: Maria Conceição Zocoller Seno / Banca: Caris Maroni Nunes / Resumo: A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma zoonose parasitária causada pelo protozoário Leishmania infantum transmitido principalmente pela picada do vetor flebotomíneo da espécie Lutzomyia longipalpis. O presente estudo objetivou avaliar a prevalência da LVC em cães, a distribuição de flebotomíneos e os fatores de riscos associados à doença, em uma área rural periurbana denominada por Cinturão Verde, localizada do município de Ilha Solteira, SP. Dessa forma, amostras de 250 cães, incluindo aspirados de linfonodos, de sangue e de suabe conjuntival foram coletadas para a realização dos exames parasitológico direto (PA), sorológico (ELISA e RIFI) e PCR (suabe conjuntival). A positividade dos cães para LVC foi de 31,6% (79/250) à RIFI, 28,8% (72/250) ao teste ELISA, 25,2% (63/250) ao PA e 20,4% (49/240) à PCR. A concordância entre os métodos, quando analisada pelo índice Kappa (p ≤ 0,05), foi considerada excelente entre ELISA x RIFI (94,5%), moderada entre ELISA x PA (81,7%) e entre RIFI x PA (78,3%), mas foi baixíssima entre PCR e os demais testes analisados. Os flebotomíneos da espécie Lu. longipalpis foram capturados com auxilio de armadilhas luminosas do tipo CDC ("Center for Disease Control and Prevention"), colocadas mensalmente no peridomicílio das propriedades rurais do Cinturão Verde, no período de setembro/2012 a agosto/2013, com três coletas em três dias consecutivos por mês. O numero de flebotomíneos capturados totalizou 65 machos e 25 fêmeas em 12 meses. O maior número de flebotomíneos capturados foi nos meses de dezembro/2012, fevereiro/2013, maio/2013 e julho/2013. Os fatores de riscos associados à LVC foram determinados estatisticamente pela análise univariada, os quais foram estatisticamente significativos (p ≤ 0,05) para os cães de porte grande, mostrando serem estes os mais susceptíveis à LVC, além da presença de galinhas nas propriedades ... / Abstract: Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is a parasitic zoonosis caused by Leishmania infantum, which is transmitted by the bite of Phebotominae insect of the Lutzomyia longipalpis species (sandfly). This study aimed to survey the prevalence of CVL in dogs, the distribution of sand flies and the risk factors associated with the disease in a rural area called "Cinturão Verde", located in the municipality of Ilha Solteira, SP. Thus, samples of lymph node aspirates and blood were collected from 250 dogs for ELISA and indirect fluorescence antibody test (IFAT) and direct parasitological (PA) exams. In addition, conjunctival swab samples were also collected for Polymerase Chain Reaction (PCR). 79/250 (31.6%) dogs were positive by IFAT; 72/250 (28.8%) by ELISA; 63/250 (25.2%) by PA and 49/240 (20.4%) by PCR. The concordance of methods when statistically analysed two by two by the Kappa índexes (p ≤ 0.05) were considered of excellent agreement between ELISA and IFAT (94.5%), moderate between ELISA and PA (81.7%) and between IFAT and PA (78.3%), but when PCR was compared with the other tests, the agrrement indexes were very low. Lu. longipalpis were captured with the help of CDC (Center for Disease Control and Prevention) light traps, placed three consecutive times per month in the rural peridomiciliary properties of the "Cinturão Verde", from September/2012 to August/2013 in 100 % of the properties visited. The parasite density ranged from 01 to 12 per month including males and females, totaling 64 males and 25 females over 12 months. The largest number of insects captured was in December 2012, February/2013, May/2013 and July/2013. The univaried statistical analysis of risk factors associated with CVL revealed that the big size-dogs, the presence of chickens in the properties as well as the lack of knowledge by the rural population about the CVL disease were considered indicators to predict infection ... / Mestre

Orientador: Tereza Cristina Cardoso Silva / Banca: Maria Cecília Rui Luvizotto / Banca: Edviges Maristela Pituco / Resumo: A língua azul é uma doença viral, cujo agente etiológico pertence à família Reoviridae, gênero Orbivírus, transmitida por um vetor (artrópode) hematófago, do gênero Culicoides. Por se tratar de doença confundível com Febre Aftosa está incluída na lista de diagnóstico diferencial juntamente com Estomatite Vesicular, Varíola Ovina, Ectima Contagioso. O estudo teve como objetivo detectar a presença de anticorpos para língua azul em ovinos da região de Araçatuba, por ser esta uma região com rebanho expressivo e condições climáticas favoráveis à multiplicação de insetos. As amostras foram colhidas ao longo do ano de 2006, de ovinos adultos, em fase reprodutiva, (acima de 12 meses e com pelo menos uma parição, ou em caso de machos sexualmente maduros) e sem sintomas característicos da doença, de ambos os sexos, cadastrados no Núcleo de Produtores de Ovinos da Região de Araçatuba, distribuídas nos municípios da Região administrativa de Araçatuba. O tamanho da amostras foi calculado, considerando-se distribuição normal, prevalência de 50%, nível de confiança de 95% e precisão absoluta de 3%. Foram analisadas 1002 amostras de soros ovinos adultos, provenientes de 31 cabanhas, pelas provas de imunodifusão dupla em gel de agar (IDGA) e ELISA (Enzyme Linked immunosorbent Assay) de competição da fase sólida (ELISA CFS), provenientes do Centro Panamericano de Febre aftosa. Dessas amostras, 744 (74,3%) foram reagentes ao vírus da língua azul , pelo teste de ELISA-CFS e 651 (65,1%), pela técnica de IDGA. Não houve associação significante entre prevalência da doença e o sexo dos animais. Esses resultados revelam que o Vírus da Língua Azul encontra-se disseminado nessas regiões, sugerindo a ocorrência de infecções inaparente. / Abstract: Bluetongue (BT) is an infectious, non-contagious, insect-born viral disease of Ruminants. The causative agent of BT is bluetongue virus (BTV) that belongs to the family Reoviridae genus Orbivirus. Insect vectors in the genus Culicoides transmit this virus. BT affects domestic and wild ruminants, however small ruminants are considered the most affected specie. BT is included in the OIE list based on the differential diagnosis with Foot and Mouth Disease (FMDV), Vesicular Stomatitis Virus (VSV) and Sheep Pox Virus (SPV). The aim of the study was to detect antibodies against BTV in commercial sheep farms, of the Northeastern region of Sao Paulo State, Brazil. The size of the samples was calculated, considering normal distribution, prevalence of 50%, confidence level of 95% and absolute precision of 3%.A total of 1002 sera samples collected from adult sheep (above 1 year-old), comprising a total of 31 farms, were screened for the presence of BTV antibodies, by agar gel immunodiffusion test (AGID) and ELISA-CFS (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - competitive solid phase), both produced by Pan American Center of FMDV. From a total of 744 samples 74,3% were positive by ELISA - CFS and 651 (65,1%) were positive by AGID. There was no significant association between prevalence of the disease and sex of animals.These results suggest that the BTV is widespread among farms, probably causing subclinical infections, with high level of antibodies. / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Aramis Augusto Pinto / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Resumo: A nucleoproteina do vírus da doença de Newcastle (VDN) é um dos componentes antigênicos ideais para fazer o imunodiagnóstico da DN, por ser mais conservada e possuir uma elevada imunogenicidade. A sequência completa do gene da nucleoproteína (NP) (1470 pb) da estirpe La Sota do VDN foi amplificada, nesse estudo, por RT-PCR e submetida a clonagem no vetor de expressão em Escherichia coli pETSUMO (Invitrogen). A proteína NP foi expressa sob a forma de uma proteína recombinante de fusão contendo o peptídeo SUMO e a sequência de poli-histidina, em seguida foi purificada em resina de níquel-agarose e caracterizada por SDSPAGE e Western-blotting, apresentando um peso molecular de cerca de 66kDa e reatividade com anticorpos policlonais de galinhas hiperimunizadas com esse mesmo vírus. Foi então desenvolvido um método indireto de ELISA com essa proteína (NPVDN- ELISA) para ser aplicado na detecção de anticorpos anti-virais específicos. O NP-VDN-ELISA revelou ser capaz de diferenciar amostras de soros positivos para o VDN das amostras de soros negativos e, na comparação dos resultados obtidos na análise de 125 soros de campo pelo NP-VDN-ELISA com os do teste de Inibição da Hemaglutinação (HI), foi encontrado um coeficiente de correlação significante entre estes métodos (r = 0,8345), bem como elevadas sensibilidade (89,3%), acurácia (90,4%) e especificidade (95,5%). Concluindo, a proteína NP recombinante expressa pelo sistema pET SUMO - E. coli compartilha os principais epítopos para interagir com anticorpos de galinhas produzidos contra a proteína NP do VDN, tendo, portanto, um bom potencial de ser aplicada de forma bem sucedida e com vantagens no teste de ELISA para realizar de forma mais rápida e prática, o imunodiagnóstico da DN de um maior número de amostras séricas de galinhas / Abstract: The nucleocapsid protein (NP) of Newcastle Disease Virus (NDV), is a preferred choice to develop a serologic assay on account of highly conserved sequences, and high immunogenicity. The whole open-reading-frame (orf) of NP gene from LaSota strain of NDV was amplified by RT-PCR and cloned in pETSUMO vector (Invitrogen) and Escherichia coli as cellular host. The NP protein was expressed as a fusion recombinant protein containing SUMO peptide and poly-histidine tags. This protein was easily purified in nickel-agarose resin, and characterized by SDS-PAGE and Western-blotting, showing a molecular weight of approximately 66 kDa and reactivity with polyclonal antibodies from NDV hiperimmunized chickens. The recombinant NP protein was used as antigen to develop an indirect ELISA (NP-NDVELISA) for the detection chicken anti-NDV antibodies. The capability of the recombinant NP protein to differentiate positive from normal chicken sera was evident in NP-NDV-ELISA, and by comparing this ELISA with haemagglutination-inhibition test (HI) a high and significant correlation with the haemagglutination-inhibition test (r = 0,8345), as well as high sensitivity (89,3%), specificity (95,5%) and accuracy (90,4%) were obtained. In conclusion the results indicated that the recombinant NP protein shared the main epitopes with the homologous viral protein and has a great potential to be advantageously used in the ELISA for the analysis of large number of samples in the DN immunodiagnosis / Mestre

Orientador: João Pessoa Araujo Júnior / Banca: Marcelo de Souza Zanutto / Banca: Jenner karlisson Pimenta dos Reis / Banca: Valéria Maria Lara Carregaro / Banca: Regina Kiomi Takahira / Resumo: A infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV) é uma das mais importantes doenças infecciosas dos felinos domésticos. Os gatos infectados apresentam sinais clínicos inespecíficos, portanto para confirmar a infecção são necessários testes laboratoriais específicos. A detecção de anticorpos anti-FIV possui uma correlação direta com a infecção viral, pois uma vez infectado o gato permanece infectado permanentemente. No presente estudo, foram produzidos antígenos recombinantes do capsídeo viral (p24) e proteína de matriz (p17) do FIV. Os fragmentos codificantes da p24 e p17 foram amplificados a partir do DNA pró-viral extraído do sangue periférico de gatos naturalmente infectados pelo FIV (subtipo B), e clonados e expressos em fase com a cauda de histidina (6xHis) na porção amino ou carboxi-terminal. Os antígenos p24, p17, p24 fundido com o epítopo transmembrana (p24/TM) e peptídeo sintético TM do FIV foram utilizados na padronização e aplicação dos testes de ELISA indireto rápido e Western blot para detecção de anticorpos anti-FIV. A reatividade dos antígenos foi analisada separadamente no ELISA indireto rápido, e permitiu a comparação dos antígenos quanto aos valores de sensibilidade e especificidade relativa. O antígeno FIVp24/TM apresentou melhor desempenho, com concordância de 100% com o teste SNAP® FIV/FeLV Combo test (n=110). A validação do ELISA indireto rápido com o antígeno FIVp24/TM mostrou características desejáveis para o uso comercial, tais como alta precisão e manutenção da reatividade durante o armazenamento. Pode-se concluir que a produção de antígenos recombinantes do FIV foi eficiente e possibilitou o desenvolvimento de um teste rápido (ELISA indireto rápido) e um teste confirmatório (Western blot) para o diagnóstico da infecção pelo FIV / Abstract: Infection with feline immunodeficiency virus (FIV) is one of the most important infectious diseases of domestic cats. Infected cats exhibit non-specific clinical signs, so specific laboratory assays are necessary to confirm the diagnosis of FIV infection. Detection of anti-FIV antibodies has a direct correlation with the viral infection, because once a cat has been infected it will remain infected permanently. In the present study, we produced FIV recombinant capsid antigen (p24) and matrix protein (p17). The coding fragments of p24 and p17 were obtained from proviral DNA extracted from peripheral blood of cats naturally infected with FIV (subtype B). These fragments were cloned and expressed in phase with amino or carboxi-terminal histidine tag (6xHis). The antigens FIVp24, FIVp17, p24 fused to transmembrane epitope (FIVp24/TM) and synthetic peptide TM were used for standardization and implementation of rapid indirect ELISA and Western blot assays for detection of anti-FIV antibodies. The reactivity of the antigens was analyzed separately in rapid indirect ELISA and allowed the determination of relative sensitivity and specificity of the antigens. The FIVp24/TM antigen has better performance, with 100% of agreement with SNAP® FIV/FeLV Combo test (IDEXX laboratories). The validation of the FIVp24/TM rapid indirect ELISA showed desirable characteristics for commercial use, such as high precision and maintenance of reactivity during storage. In conclusion, production of FIV recombinant antigens was efficient and allowed the development of a rapid test (rapid indirect ELISA) and a confirmatory test (Western blot) for diagnosis of FIV infection / Doutor

Orientador: Antônio de Queiroz Neto / Coorientador: Delphim da Graça Macoris / Banca: Adolorata Aparecida Bianco Carvalho / Banca: Estevam Guilherme Lux Hoppe / Banca: Natalino Hajime Yoshinari / Banca: Jairo Jaramillo Cardenas / Resumo: A Borreliose de Lyme é uma doença causada pela espiroqueta Borrelia burgdorferi sensu lato, cosmopolita, transmitida por meio da picada de carrapatos que permanecem aderidos ao hospedeiro por mais de 24 horas. Em humanos, pode provocar doenças articulares, cardíacas e neurológicas. Nos equinos, até o presente momento a doença havia sido descrita por meio de relatos de caso e extrapolações de sua patogenia nos humanos. Por meio do presente estudo, pretende-se pesquisar os sinais clínicos e alterações hematológicas da borreliose de Lyme nos equinos. Além disso, avaliou-se também a viabilidade de se tratar os equinos infectados com ceftriaxona sódica. Para tanto, o experimento foi composto por três principais fases. A primeira fase foi composta por um levantamento epidemiológico da doença no Estado de São Paulo, especificamente nas cidades com casos suspeitos de borreliose de Lyme em humanos. Coletou-se amostras de sangue e histórico clínico de 760 equinos e obteve-se média de 21% de soropositividade no estado. Desta fase, concluiu-se que existe grande relação entre a soropositividade, presença de carrapatos Amblyomma sculptum, presença de capivaras na propriedade, linfopenia, abortamento e retenção de placenta. A segunda fase foi composta por uma infecção experimental de dois equinos adultos com B. burgdorferi cepa G39/40. Os equinos foram avaliados durante 90 dias de infecção e foi possível verificar que os animais apresentaram sinais clínicos e alterações hematológicas inespecíficas somente nos primeiros 11 dias de infecção. Notou-se a presença de anemia normocítica hipocrômica discreta, dores musculares, palidez de mucosas, letargia e aumento de linfonodos, sinais que podem facilmente ser confundidos com a piroplasmose crônica. Durante a fase 3 do experimento, os dois equinos infectados experimentalmente foram submetidos ao tratamento com ceftriaxona... / Abstract: Lyme borreliosis is a disease caused by the spirochete Borrelia burgdorferi sensu lato, cosmopolitan and transmitted by the bite of ticks which remain adhered to the host for more than 24 hours. In humans, it can cause articular, cardiac and neurological diseases. In horses, so far the disease had been described by means of case reports and extrapolations of its pathogenesis in humans. This study aimed to investigate the clinical signs and hematological changes of Lyme disease in horses. Furthermore, it is also assessed the feasibility of treating infected horses with sodium ceftriaxone. To this end, the experiment consisted of three main phases. The first phase consisted of an epidemiological survey of the disease in São Paulo State, specifically in cities with suspected cases of Lyme borreliosis in humans. It was collected blood samples and clinical history of 760 horses that resulted in an average of 21% seropositivity in the state. In this stage, it was concluded that there was a high relationship between seropositivity, Amblyomma sculptum tick presence, the presence of capybaras in the property, lymphopenia, abortion and retained placenta. The second phase consisted of an experimental infection of two adult horses with B. burgdorferi strain G39 / 40. The horses were evaluated for 90 days of infection and we found that the animals showed nonspecific clinical signs and hematologic changes only in the first 11 days of infection. It was noted the presence of mild hypochromic normocytic anemia, muscle pain, pale mucous membranes, lethargy and swollen lymph nodes, signs that can easily be confused with chronic piroplasmosis. During phase 3 of the experiment, the two horses experimentally infected underwent treatment with intravenous sodium ceftriaxone. Already during the first application, both developed an anaphylactoid reaction moderate to severe with colic syndrome as consequence for one ... / Doutor

In this work was studied the simultaneous influence of sodium alginate, gelatin and glutaraldehyde concentrations in the immobilization process of Beta-galactosidase from Aspergillus oryzae and the kinetic of lactose hydrolysis by the enzyme in the soluble and immobilized forms. The free enzyme was studied at 35°C and in a pH of 4.5, showing that for substrate concentrations up to 90g/L, the Michaelis-Menten model fitted the experimental data, with a Km and Vm value of 17.83 g/L (52.13 mM) and 1032.07 gglicose/L.min.mg proteína respectively. Galactose acted as a competitive inhibitor on the free enzyme kinetic, presenting kinect constants Ki and Km values of a 1.015 and e 17.61 g/L respectively. The enzyme was stable at pH values ranging from 4.5 to 7.0 and a maximum temperature activity of 55°C, with an activation energy of 6.9 kcal/mol. The thermal stability of the enzyme was studied from 53 to 65°C, presenting a half-life of 7.7 hours at 53°C. The activation energy for the thermal deactivation process was 88.14 kcal/mol. Through a central composite design, the sodium alginate, gelatin and glutaraldehyde concentrations that maximized the -galactosidase from Aspergillus oryzae activity in the inhibition process were, respectively, 6.60%(w/v), 4.05%(w/v) and 3.64%(v/v). The immobilized enzyme presented a 20% drop in activity after 25 uses. The immobilization yield found was 30%. The enzymatic activity for the immobilized form was maximum at pH of 5.0 and 60°C, determined through a central composite design. The reaction activation energy for the immobilized enzyme was 7.74 kcal/mol. The immobilized biocatalyst was stable on pH values ranging from 4.5 to 7.0. The half-life time of the immobilized enzyme was 12.8 hours at 53°C, with a activation energy for the thermal deactivation process value of 72.03 kcal/mol . The substrate concentration influence was studied from 5 to 140 g/L of lactose and the Michaelis-Menten model fitted the experimental data, with Vm and Km values of 1428.14 glactose/min.m3catalyst and 20.62 g/L (60.3 mM), respectively. It was observed a small resistance to lactose mass transfer at the biocatalyst particles, in the immobilized enzyme, due to the high effectiveness factor values. The inhibition model fitted the experimental data and the adjusted Km and Ki values were 16.7 and 9.6g/L, respectively. / Neste trabalho estudou-se a influência conjunta das concentrações de alginato de sódio, gelatina e glutaraldeído no processo de imobilização de Beta-galactosidase de Aspergillus oryzae e a cinética de hidrólise de lactose pela enzima nas formas solúvel e imobilizada. A cinética da enzima na forma livre foi estudada a 35°C, a pH 4,5, verificando que para concentrações de substrato de até 90g/L o modelo de Michaelis- Menten se ajustou aos resultados experimentais, com valores de Km e Vm iguais a 17,83 g/L (52,13 mM) e 1032,07 gglicose/L.min.mg proteína respectivamente. A galactose atuou como um inibidor competitivo na cinética da enzima na forma livre, apresentando constantes cinéticas Ki e Km com valores iguais a 1,015 e 17,61 g/L respectivamente. A enzima apresentou-se estável na faixa de pH de 4,5 a 7 e temperatura de máxima atividade de 55°C, com energia de ativação de 6,9 kcal/mol. A estabilidade térmica da enzima foi estudada na faixa de 53 a 65°C, apresentando meia vida de 7,7 horas a 53°C. A energia de ativação do processo de desativação térmica foi de 88,14 kcal/mol. Por meio de um planejamento composto central as concentrações de alginato de sódio, gelatina e glutaraldeido que maximizaram a atividade de b-galactosidase de Aspergillus oryzae no processo de imobilização foram, respectivamente, 6,60% (p/v), 4,05% (p/v) e 3,64% (v/v). A enzima imobilizada apresentou queda de 20% na atividade após 25 usos. O rendimento de imobilização encontrado foi de 30%. A atividade enzimática para a forma imobilizada foi máxima a pH a 5,0, a 60ºC, determinados através de um planejamento composto central. A energia de ativação da reação usando a enzima imobilizada foi 7,74 kcal/mol. O biocatalisador imobilizado apresentou-se estável na faixa de pH de 4,5 a 7. O tempo de meia vida da enzima imobilizada foi 12,8 horas a 53°C apresentando energia de ativação do processo de desativação térmica de 72,03 kcal/mol. A influência da concentração de substrato foi estudada para uma faixa de 5 a 140g/L de lactose e o Modelo de Michaelis-Menten ajustou-se bem aos dados experimentais, com valores de Vm e Km de 1032,07 glactose/min.m3catalisador e 20,62 g/L (60,3 mM), respectivamente. Em relação à enzima na forma imobilizada observou-se pequena resistência à transferência de massa de lactose nas partículas do biocatalisador, em função dos altos valores do fator de efetividade. O modelo de inibição competitivo ajustou-se bem aos dados experimentais e os valores de Km e Ki calculados foram 16,7 e 9,6g/L, respectivamente. / Doutor em Engenharia Química

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The study of the enzymatic hydrolysis of the lactose has been of great importance, due to absence or lack of the enzyme present lactase in the process digestive human. The enzyme β-galactosidase is very used in the processing of milk products by being of low cost and enough studied all over the world. The use of this enzyme in the dairy products prevents the crystallization of the products and it provides to the intolerant people the lactose better life quality. The objective of this work was accomplish a comparative study of the hydrolysis of the cheese whey usig two different maufactures β-galactosidase Prozyn and Lactozym, respectively, Kluyveromyces lactis and Kluyveromyces fragilis, of origin of yeasts. The tests of hydrolysis of the cheese whey were accomplished in a reactor with agitation control and temperature. The cheese whey concentration was of 60 g/L, temperatures of 43, 45 and 48°C, concentration of the enzyme of 4 g/L, pH 6,0 and 6,5 and agitation 300 rpm. Both enzymes obteined better result to 45 °C, however the enzyme Prozyn converts the lactose in smaller time. An analysis was accomplished to verify the concentration of total sugar of the cheese whey, 75%, to evaluate the hydrolysis, obtaining the glucose concentration in function of the time for each studied condition. The influence of the lactose concentration was verified in the enzyne, using lactose solution in erlenmeyer. The enzymatic activity was growing of the concentration 10 g/L up to 120 g/. The enzyatic stability in relation to the pH presented better result pH 6,5 for both enzymes Prozyn and Lactozym. The thermal stability of the free enzyme was certain for the time of half life. The enzyme Prozyn to temperature of 50°C it presented time of life 4,62 min and to 55°C was 2,77 min and enzyme Lactozym to the 50°C was 6,32 min and to 45°C was 115,52 min. In the determination of the enzymatic activity the method of the initial rates of the reaction of hydrolysis of the cheese whey was used. The obteined enzymatic activity was 75,03.10-3 mol/(genzyme.h) and 44,6.10-3 mol/(genzyme.h) for Prozyn and Lactozym, respectively. / O estudo da hidrólise enzimática da lactose tem sido de grande importância, devido a ausência ou carência da enzima lactase presente no processo digestivo humano. A enzima β-galactosidase é a mais utilizada no processamento de produtos lácteos por ser de baixo custo, eficiente e bastante estudada em todo o mundo. A utilização desta enzima nos laticínios previne a cristalização da lactose dos produtos e proporciona às pessoas intolerantes a lactose melhor qualidade de vida. O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo comparativo da hidrólise da lactose presente no soro de queijo, utilizando β- galactosidase originária das leveduras Kluyveromyces lactis e Kluyveromyces fragilis adquiridas da Prozyn e Lactozym. Os ensaios de hidrólise do soro de queijo foram realizados em um reator com controle de agitação e temperatura. A concentração de soro foi de 60 g/L, temperaturas de 43, 45, 48 e 53°C, concentração da enzima de 4 g/L, pH 6,0 e 6,5 e agitação 300 e sem agitação mecânica. Ambas as enzimas forneceram melhor resultado à 45 °C, no entanto, a enzima Prozyn converte a lactose em menor tempo. O teor de lactose presente no soro de queijo com concentração 60 g/L foi de 75%. A concentração de glicose em função do tempo determinou a duração da hidrólise, onde a lactose foi quebrada pela enzima e resultou na formação de glicose e galactose em quantidade equimolar. Verificou-se a influência da concentração de lactose na enzima, utilizando solução de lactose na faixa de 10 a 120 g/L em solução tampão láctico pH 6,5 e temperatura 30°C. A atividade enzimática foi crescente da concentração 20 g/L até 100 g/L. A estabilidade enzimática em relação ao pH apresentou melhor resultado em pH 6,0 para a Prozyn e pH 6,5 para a Lactozym. A estabilidade térmica da enzima livre foi determinada pelo tempo de meia vida. A enzima Prozyn à 50°C, apresentou tempo de meia vida de 4,62 min e à 55°C, 2,77 min e a enzima Lactozym à 50°C, 6,30 min e à 45°C, 115,52 min. Na determinação da atividade enzimática utilizou-se o método das taxas iniciais da reação de hidrólise do soro. A atividade enzimática obtida foi 75,03.10-3 mol/(genz..h) e 44,6.10-3 mol/(genz..h) para Prozyn e Lactozym, respectivamente. / Mestre em Engenharia Química

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A matriz energética mundial é baseada em fontes fósseis e renováveis. No Brasil, o bioetanol é gerado principalmente a partir da cana-de-açúcar. Resíduos agroindustriais (fontes celulósicas ou amiláceas) despontam como biomassas alternativas à cana-de-açúcar, para aumentar a competitividade deste combustível renovável frente aos de origem fóssil e também favorecer a sustentabilidade e a segurança alimentar e energética, pois são ricos em polissacarídeos não diretamente fermentescíveis, abundantes (problema ambiental) e apresentam baixo valor comercial. O farelo de mandioca é um exemplo de resíduo sólido gerado na produção de fécula (amido) e farinha de mandioca que ainda contém, em média, 75% de amido. Consequentemente, deve ser previamente hidrolisado e posteriormente fermentado por leveduras do gênero Saccharomyces para gerar etanol. O objetivo deste estudo foi produzir bioetanol a partir de hidrolisados enzimáticos de farelo de mandioca, usando levedura álcool resistente (AR). Primeiramente, a concentração de açúcares obtida a partir da hidrólise enzimática foi verificada através de um planejamento fatorial completo (24), com triplicata no ponto central, a fim de investigar a influência dos seguintes fatores na hidrólise: concentração de α-amilase (Termamyl 2X), tempo de liquefação, concentração de glucoamilase (AMG 300L) e o tempo sacarificação. A condição de hidrólise mais favorável foi a do ensaio com 0,517 mL de AMG/g amido, 0,270 mL de Termamyl/g amido, 1h de tempo de liquefação e 2h de tempo de sacarificação. O caldo resultante da condição escolhida alcançou altas concentrações de glicose (160 g/L). Os ensaios de fermentação alcoólica foram realizados em duplicata em biorreator de 3L, em regime de batelada, a 30C, 100 rpm e pH 5,5. Cerca de 3 g/L (massa seca) de uma linhagem de levedura álcool tolerante, Saccharomyces cerevisiae Hansen BY4741, crescida por 12h em meio YEDP (2% de glicose) foram usados como inóculo. O mosto consistiu de um litro de hidrolisado (160 g/L de glicose) fortificado com extrato de levedura (1%) e peptona de carne (1%), além da adição de um antiespumante (Tween 80) na concentração de 0,05% (m/v). Em 30 horas de fermentação, a média da concentração de etanol obtida foi de 65 g/L. A eficiência foi de 87,6% e o rendimento e a produtividade foram 0,448 e 2,16 g/L.h, respectivamente. Os resultados indicaram a aplicabilidade do farelo de mandioca como matéria-prima para a produção de bioetanol / The world energy matrix is based on fossil and renewable sources. In Brazil, bioethanol is generated mainly from sugarcane. Agro-industrial wastes (cellulosic or starchy sources) emerge as an alternative to sugarcane biomass, in order to increase this renewable fuel competitiveness against fossil ones, and also promote sustainability, food security and energy security, because they are rich in polysaccharides (not directly fermentable), abundant (environmental problem), and have low commercial value. The cassava bagasse is an example of a solid waste originated from starch and cassava flour industries, which still contains on average 75% of starch. Consequently, it should be hydrolyzed and then fermented by Saccharomyces yeasts in order to generate ethanol. This study aimed to produce bioethanol from enzymatic hydrolysate of cassava bagasse, using alcohol resistant (AR) yeast. At first, the concentration of sugars obtained from enzymatic hydrolysis was verified using a full factorial design (24) with triplicate at the center point to investigate the influence of α-amylase concentration (Termamyl 2X), liquefaction time, glucoamylase concentration (AMG 300L), and saccharification time. The best condition of hydrolysis was 0,270 mL of Termamyl/g starch, 1h of liquefaction, 0,517 mL of AMG/g starch, and 2h of saccharification. The resultant syrup of the chosen condition achieves high levels of glucose (160 g/L). Alcoholic fermentation assays were performed in duplicate in a 3L bioreactor under batch regime at 30C, 100 rpm and pH 5.5. About 3 g/L (dry weight) of an alcohol tolerant yeast strain, Saccharomyces cerevisiae Hansen BY4741, grown for 12 h in YEDP medium (2% glucose), were used as inoculum. The fermentation broth consisted of one liter of hydrolysate (160 g/L of glucose) supplemented with yeast extract (1%) and meat peptone (1%), plus the addition of an antifoam (Tween 80) in a concentration of 0.05% (w/v). At 30 hours of fermentation, the average ethanol concentration obtained was 65 g/L. The efficiency was 87.6% and the yield and the productivity were, respectively, 0.448 and 2.16 g/L.h. The results indicated the applicability of cassava bagasse as raw material for bioethanol production

O processo de transesterificação de óleos vegetais para a síntese de biodiesel por catálise básica tem sido utilizado largamente em escala industrial e altas conversões são obtidas. Entretanto, uma grande quantidade de água é necessária para a purificação dos ésteres, gerando altos volumes de rejeitos aquosos inadequados para descarte, e dessa forma, a utilização de síntese enzimática catalisada por lipases imobilizadas destaca-se como uma alternativa ao método alcalino. Este trabalho teve como objetivo aperfeiçoar a produção de biodiesel a partir de diferentes fontes de óleos vegetais por diferentes lipases imobilizadas comercialmente. Na primeira fase do trabalho foi realizada uma análise dos principais fatores envolvidos na síntese enzimática de biodiesel, com foco nos parâmetros envolvidos na escolha e na configuração dos reatores. Uma extensa discussão foi apresentada sobre as vantagens e desvantagens de cada tipo de reator e seu modo de funcionamento. O cenário atual do mercado de síntese enzimática de biodiesel e algumas perspectivas futuras também foram apresentadas. Na segunda etapa desta pesquisa foi testado o conceito “combi-lipase”, que se baseia no uso de misturas de lipases com diferentes especificidades para a cadeia molecular de um óleo em particular (o substrato). Neste caso, foram utilizadas as lipases comerciais imobilizadas Novozym 435 (CALB), Lipozyme TL-IM (TLL), e Lipozyme RM-IM (RML) como biocatalisadoras na síntese de biodiesel via transesterificação enzimática dos óleos de oliva e palma, com etanol como aceptor acila. Repetidas reações em batelada foram realizadas para testar a estabilidade operacional do sistema combi-lipase, em que elas puderam ser usadas em pelo menos sete ciclos, mantendo em torno de 80 % da sua atividade inicial. Dando sequencia ao conceito de combi-lipase, na terceira etapa dessa pesquisa, foi avaliada a utilização de substratos alternativos, como os provenientes de fritura doméstica e comercial, comparada ao óleo de soja. As reações foram conduzidas em banho de ultrassom, com a otimização dos parâmetros razão molar etanol:óleo, quantidade de água adicionada na reação e quantidade de biocatalisador (previamente à definição da composição do combi-lipase). O uso de tecnologia de ultrassom, concomitante com a aplicação de misturas de enzimas com diferentes preços de aquisição e uso de óleos residuais apresentou excelentes rendimentos, com 90 % (com óleo de soja) e 70 % (com óleo residual) de conversão de biodiesel. Na última etapa deste trabalho, foi conduzida a síntese contínua de biodiesel em um reator de leito empacotado (PBR) com o uso de etanol e dos substratos óleos de soja e óleo residual, utilizando combi-lipase com biocatalisador. Após a otimização de alguns parâmetros de reação, foram definidas as seguintes condições: utilização de pérolas de vidro misturada ao combi-lipase para compor o leito enzimático; uso de terc-butanol como solvente de reação e velocidade de fluxo de 0,08 mL min-1. O combi-lipase apresentou excelente estabilidade operacional, e o reator manteve-se operando continuamente por 30 dias em estado estacionário. Independente do tipo de substrato empregado, o rendimento de conversão manteve-se em torno de 50 %, com produtividade de 1,94 gbiodiesel gsubstrato-1 h-1. / The process of transesterification of vegetable oils for biodiesel synthesis catalyzed by alkalis has been widely used on an industrial scale and high conversions are obtained. However, a large amount of water is required for the purification of esters, generating large amounts of aqueous wastes, unsuitable for disposal. Therefore, the enzymatic synthesis of biodiesel using immobilized lipases as biocatalysts stands as an alternative to the alkaline method. This work aimed at enhancing the production of biodiesel from different sources of vegetable oils using different immobilized commercially available lipases. In the first step of the work, an analysis of the main factors involved in enzymatic synthesis of biodiesel was carried out, focusing on choices of immobilization protocol and parameters involved in the selection and configuration of the reactors. An extensive discussion is presented on the advantages and disadvantages of each type of reactor and its operation. The current scenario of the enzymatic synthesis of biodiesel market and some future prospects are also presented. In the second stage of this study it was tested the concept "combi-lipase", which is based on the use of lipase mixtures with different specificities for a particular oil, the substrate. The immobilized commercial lipases Novozym 435 (CALB), Lipozyme TL-IM (TLL), and Lipozyme RM-IM (RML) were used as biocatalysts in enzymatic transesterification of biodiesel from olive and palm oils, with ethanol as acyl acceptor. Repeated batches of reaction were carried out in order to test the operational stability of the combi-lipase systems, with results showing that they could be used for at least seven cycles keeping higher than 80 % of their initial activities. Following the concept of combi-lipase, in the third stage of this research, it was evaluated the use of alternative substrates, such as waste frying oils, compared to soybean oil. The reactions were conducted in an ultrasonic bath, with the optimization of the molar ratio of ethanol: oil, amount of water added in the reaction and amount of biocatalyst (prior to the definition of the combi-lipase composition). The use of ultrasonic technology, concomitant with the application of mixtures of enzymes with different acquisition and use prices of residual oils presented excellent yields, with 90 % (with soybean oil) and 70 % (with residual oil) of biodiesel conversion. Finally, in the last stage of this work, the combi-lipase concept was applied in the continuous ethanolysis of biodiesel in a packed bed reactor (PBR) with the use of soybean and waste oils as substrates. After optimization of some reaction parameters, the following conditions were defined: use of glass beads mixed with lipases to compose the enzymatic bed; Use of tert-butanol as reaction solvents and flow rate of 0.08 mL min-1. The combi-lipase presented excellent operational stability, and the reactor was continuously operated for 30 days at steady state. Regardless of the type of substrate used, the conversion yield remained around 50 %, with productivity of 1.94 gbiodiesel gsubstrate-1 h-1.