A necessidade de economias sustentáveis tem aumentado o interesse no desenvolvimento de plataformas microbianas para novos processos, tanto para a produção de biocombustíveis quanto para a síntese de compostos que demandam alta capacidade energética e processamento químico em sua produção. O isolamento de microrganismos, capazes de degradação materiais lignocelulósicos, resistentes a diferentes inibidores e com rendimento elevado na biossíntese de moléculas específicas faz-se necessário para atender tais propósitos. Neste trabalho, microrganismos cultiváveis isolados do trato digestivo de larvas dos insetos pragas de cana-de-açúcar, besouro da raiz, Migdolus fryanus, bicudo da cana, Sphenophorus levis, broca-gigante da cana, Telchin licus licus e de broca-da-cana, Diatraea saccharalis, foram caracterizados quanto a atividade enzimática em fontes de carbono e identificados por técnicas moleculares. Larvas no terceiro ínstar de M. fryanus e S. levis e quinto ínstar de T. licus licus e D. saccharalis foram coletadas em plantios de cana-de-açúcar no interior de São Paulo. Um total de 341 microrganismos cultiváveis foram avaliados quanto a capacidade de degradação de substratos lignocelulósicos, como única fonte de carbono em meio sólido usando o índice de atividade enzimática (I.E.). Os isolados foram identificados por sequênciamento das regiões do 16S rRNA para bactérias, ITS rDNA para fungos e 26S rDNA para leveduras. Bactérias com atividade enzimática foram relacionadas aos gêneros do filo Firmicutes Bacillus, Enterobacter Serratia e Citrobacter. Os isolados relacionados à B. amyloliquefaciens destacaram-se na degradação da celulose. Entre fungos filamentosos, leveduras e leveduriformes, a atividade enzimática foi destacada para a degradação da hemicelulose. Fungos filamentosos e leveduras pertencem ao filo Ascomycota e os leveduriformes ao filo Chlorophyta. Fungos que apresentaram hidrólise de xilano foram relacionados aos gêneros Pyrenophora, Aspergillus e Penicillium. As leveduras relacionam-se a nove gêneros, majoitariamente aos gêneros Meryerozyma e Candida. Leveduras com capacidade hidrolítica destacada foram relacionadas à Meyerozyma guilliermondii, Cryptococcus laurentti, Candida pseudointermedia, C. parapsilosis, C. solani e Aureobasidium pullulans. Entre as leveduras, 40 isolados apresentam sequências que diferem em mais de 1% das sequências referência, podendo-se inferir a respeito de possíveis novas espécies. No ensaio cinético, realizado para a triagem de leveduras com capacidade de bioconversão da D-xilose em xilitol e etanol, o maior rendimento em xilitol foi demonstrado pelo microrganismo relacionado à Prototheca zopfi var. hydrocarbonea. A capacidade desse organismo de produzir xilitol não havia sido descrita. Os resultados obtidos nesse trabalho, revelaram que o trato digestivo das pragas de cana-de-açúcar como uma fonte de microrganismos que apresentam capacidade de degradação enzimática para celulose e xilano cujo potencial para utilização na biotecnologia industrial ainda precisa ser revelado / The pursuit for sustainable economies has increased the interest in development of microbial-based platforms for new processes, both for biofuel production and for the synthesis of compounds, which demands high energetic capacity and chemical processing in its production. The isolation of microorganisms capable of degradation of lignocellosic materials, resistant to different inhibitors and highly efficient in the biosynthesis of specific molecules is necessary to achieve such purposes. In this research, cultivable microorganisms isolated from the larval gut of sugarcane pests: sugarcane borer root Migdolus fryanus, sugarcane weevil Sphenophorous levis, giant sugarcane borer Telchin licus licus and sugarcane borer Diathrea saccharalis, were characterized according to their extracellular enzymatic activity in carbon sources and molecularly identified. Third-instar larvae of Migdolus fryanus and S. levis and fifth-instar larvae of T. licus licus and D. saccharalis were collected in sugarcane fields in São Paulo, Brazil. A total number of 341 strains were evaluated for their capacity of degradation of lignocelulitic substrates, as single carbon sources in solid medium. The enzymatic activities of the strains were estimated by Enzymatic Activity Index (EAI); further, the strains were molecularly identified by sequencing of the 16S rRNA region for bacterias; ITS rDNA region for filamentous fungi and 26S rDNA region for yeasts. Bacteria strains which presented enzymatic activity were related to Firmiculites genera Bacillus, Enterobacter, Serratia and Citrobacter. Strains related to B. amyloliquefaciens have demonstrated higher levels of cellulosic degradation. Among filamentous fungi, yeasts and yeast-like organisms higher activity was showed to degradation of hemicelluloses. Filamentous fungi and yeasts belong to phylum Ascomycota, and the yeast-like organisms to phylum Chlorophyta. Six filamentous fungi which presented higher hidrolisys of xylan were related to Pyrenophora, Aspergillus and Penicillium genera. Yeasts were related mostly to the Meryerozyma and Candida genera. Yeasts with higher hydrolysis cababilities were reated to Meyerozyma guilliermondii, Cryptococcus laurentti, Candida pseudointermedia, C. parapsilosis, C. solani e Aureobasidium pullulans. Among the yeasts, 40 strains showed sequences that differ by more than 1% from reference sequences, which allows infering about possible new species. In the kinetic assay carried out for screening for yeasts capable of bioconverting D-xylose into xylitol and ethanol, higher yields of xylitol were obtained for the yeast-like organism related to Prototheca zopfi var. hydrocarbonea. This microorganism\'s ability to produce xylitol had not been reported yet. The results obtained in this work have demonstrated the gut of sugarcane pests as source of microorganisms capable of enzymatic degradation of cellulose and xylan, whose potential for use in the industrial biotechnology has yet to be revealed.

O uso intensivo de produtos organoclorados contendo estruturas aromáticas em sua composição tem crescido de forma rápida nos últimos anos em face de sua ampla utilização em vários setores da indústria moderna. A decomposição de tais compostos é lenta, dada sua grande estabilidade química, tornando-os poluentes recorrentes do meio-ambiente. Diferentes estratégias estão disponíveis para tentar solucionar este problema. Os chamados processos de bioremediação estão entre elas e vem ganhando espaço dentre as possíveis escolhas em face de sua maior eficiência e por estarem baseados no uso de moléculas como enzimas, que não afetam o ambiente, para realizar a tarefa de degradação de substâncias tóxicas. Neste contexto se coloca a enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida, alvo de estudos deste trabalho. Nosso grupo tem trabalhado no entendimento do mecanismo de ação da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida há alguns anos já que acreditamos que a utilização de forma mais eficiente e efetiva possível da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida passa necessariamente pelo conhecimento acerca de maneiras de controle da atividade enzimática. Com isso, os resultados obtidos consistiram na otimização dos processos de expressão e purificação que permitiram a obtenção da proteína pura e com bom rendimento, após mudança no vetor de expressão. Foram feitos ensaios de atividade enzimática com diferentes substratos e desenvolvimento de um protocolo de caracterização cinética, para assim avaliar a existência de mecanismos de inibição/modulação da reação pelo substrato e/ou produto. Análise da estrutura secundária por meio de dicroísmo circular e dicroísmo circular com radiação síncrotron para avaliar a integridade estrutural frente da nova construção. Também foram realizados testes para separação dos ligantes enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas putida para análise em espectrômetro de massas afim de se identificar as moléculas anfipáticas que podem estar presentes em seu sítio hidrofóbico. Por fim, ensaios de interação proteína-lipídio utilizando calorimetria diferencial de varredura, ressonância paramagnética eletrônica e dicroísmo circular indicam uma provável interação com modelos de membrana, principalmente, quando na presença de PIP2 (fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato). / The use of chlorinated compounds bearing aromatic structures in their chemical composition has quickly grown in the last few years due to their general presence in processes of modern industry. The degradation of such compounds is slow, due to their high chemical stability, thus making them frequent polutants of the environment. Different strategies to tackle this problem are available. The so-called bioremediation methods are among those strategies and have been gaining many applications because of their higher efficiency and due to the use of enzymes, which do not affect the environment, to perform the degradation task. Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida is one of those enzymes and is the object of study of this project. Our group has been working on understanding the mechanism of action of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida since we believe that a more efficient use of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida necessarily involves knowledge about ways of controlling the enzymatic activity. Thus, our results consisted in the optimization of the expression and purification protocols that allow the production of pure protein in high yields after changing its expression vector. Assays of enzyme activity with different substrates and development of a protocol for kinetic characterization was also done to assess the existence of mechanisms of inhibition/modulation of the reaction by the substrate and/or product. Analysis of the secondary structure by circular dichroism and synchrotron radiation circular dichroism was also performed to assess the integrity of the new construction. Tests were also carried out to separate the amphipatic ligands present in the Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida structure for analysis in a mass spectrometer in order to identify which kind of amphipathic molecule may be present in enzyme hydrophobic site. Finally, lipid-protein interactions were investigated by means of differential scanning calorimetry, electron paramagnetic resonance and circular dichroism. The results indicated a potential interaction with model membranes, especially in the presence of PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate).

O presente trabalho avaliou o comportamento de três híbridos de cana-de-açúcar, contrastantes quanto aos teores de hemicelulose e lignina, diante do pré-tratamento com ácido sulfúrico diluído e da subsequente conversão enzimática da glucana à glicose. Os híbridos 89, 140 e 321 (H89, H140 e H321) foram submetidos à diferentes condições de pré-tratamento ácido: 150 ºC; 13 g ácido sulfúrico/100 g material; e tempos de reação que variaram entre 20 e 90 min. Os rendimentos de sólidos residuais diminuíram progressivamente em função do aumento da severidade do pré-tratamento. O H89 apresentou rendimentos nitidamente menores, comparados ao dos híbridos H140 e H321; reflexo da maior solubilização de todos os três constituintes estruturais deste híbrido. A hemicelulose foi o componente da parede celular removido com maior eficiência pelo pré-tratamento ácido. Além disso, o pré-tratamento modificou a proporção molar dos constituintes iniciais da hemicelulose (xilose, ácido acético e arabinose), resultando em estruturas residuais menos ramificadas. Paralelamente, também foi observada uma pequena remoção de lignina (entre 21% e 31%, dependendo do híbrido) e de glucana (entre 4% e 15%, dependendo do híbrido) durante o pré-tratamento. Os carboidratos detectados nos hidrolisados ácidos dos híbridos foram predominantemente monoméricos quando os tempos de reação foram maiores do que 40 min. No entanto, os híbridos H140 e H321 se diferenciaram do H89, pois apresentaram oligossacarídeos (DP>=2) nos hidrolisados obtidos em tempos de reação entre 20 e 30 min. Os rendimentos de conversão enzimática da glucana contida nos sólidos pré-tratados aumentaram substancialmente após o pré-tratamento ácido (principalmente devido à remoção de hemicelulose). No entanto, as conversões máximas de glucana em glicose não ultrapassaram 65%. A deslignificação parcial das amostras pré-tratadas com ácido (90 min), empregando soluções de clorito de sódio/ácido acético, permitiu aumentar a conversão enzimática de glucanas até valores próximos a 100%. De forma geral, o pré-tratamento ácido e a subsequente deslignificação proporcionaram maiores ganhos de conversão enzimática àqueles híbridos inicialmente mais recalcitrantes (H321 e H140). Os rendimentos de pré-tratamento (ácido diluído e clorito-ácido) e da conversão enzimática demonstraram que a maior obtenção de glicose por área plantada (Kg/hectare) ou por material processado (Kg/ton material) seria alcançada com a utilização dos híbridos H89 e H321, respectivamente. A investigação das características microestruturais das paredes celulares dos híbridos permitiu compreender como as etapas de tratamento químico afetaram a conversão enzimática da glucana. O pré-tratamento ácido diminuiu substancialmente o volume total de poros dos três híbridos, enquanto a subsequente deslignificação não retornou a porosidade aos níveis originalmente detectados nas amostras não tratadas. Por outro lado, a área superficial acessível de glucana dos substratos apresentou relação direta com os rendimentos de conversão enzimática da glucana à glicose (R2=0,92). A compilação dos dados analíticos, aliada às determinações de glucana acessível, permitiu propor um parâmetro empírico (relação do teor de glucana com a soma de hemicelulose+lignina+extraíveis), útil para predizer os níveis de conversão enzimática de glucana nas amostras estudadas. / This study evaluated the performance of three sugarcane hybrids, contrasting for lignin and hemicellulose contents, under dilute sulfuric acid pretreatment and subsequent enzymatic conversion of glucan to glucose. The hybrids 89, 140 and 321 (H89, H140, and H321) were pretreated at different reaction conditions: 150 °C; 13 g sulfuric acid/100 g material; and reaction time ranging from 20 to 90 min. Residual solid yields gradually decreased according to increasing of pretreatment severity. H89 showed the lowest yields compared to the H140 and H321 hybrids, due to the highest solubilization of all the three structural components. Hemicellulose was the major cell wall component removed by the acid pretreatment. Furthermore, acid pretreatment modified the molar ratio of the initial hemicellulose constituents (xylose, arabinose and acetic acid), resulting in less branched structures. Lignin (between 21% and 31%, depending on the hybrid) and glucan (between 4% and 15%, depending on the hybrid) removal were also observed during the pretreatment. Carbohydrates in liquid hydrolysates were predominantly detected as monomers at reaction times greater than 40 min. However, H140 and H321 hybrids differed from H89, since they presented oligosaccharides (DP>=2) in the hydrolysates obtained at short reaction time (20 and 30 min). Enzymatic conversion of glucan from pretreated solids was substantially increased after the acid pretreatment (mainly due to the hemicellulose removal). Nevertheless, maximum conversion of glucan to glucose did not exceed 65%. Partial delignification of the acid pretreated samples (90 min), employing sodium chlorite/acetic acid solutions, increased the enzymatic conversion of glucan to values near to 100%. In general, acid pretreatment and subsequent delignification provided higher gains of enzymatic conversion to the hybrids originally more recalcitrant (H321 and H140). The pretreatment (dilute acid and chlorite-acid) and enzymatic conversion yields demonstrated that to obtain higher amounts of glucose, taking into account the planted area (Kg/ha) or raw material processed (Kg/ton), would be achieved by using H89 and H321 hybrids, respectively. Analysis of the micro-structural features of the hybrids allowed understanding the effect of the chemical treatment step in the enzymatic conversion of glucan. Acid pretreatment significantly decreased the total pores volume of these hybrids, while the subsequent delignification do not returned the porosity to the original levels detected in raw samples. On the other hand, the accessible surface area of glucan showed a direct correlation with the enzymatic conversion levels of glucan to glucose (the model including several substrates presented R2=0.92). The compilation of analytical data, combined with the accessible glucan, allowed proposing an empirical parameter (ratio of the glucan content with the sum of hemicellulose+lignin+extractives), that was useful for predicting the enzymatic conversion levels of glucan for all the evaluated samples.

Orientador: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Carlos Noriyuki Kaneto / Banca: Alessandro Francisco Talamini do Amarante / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência de Cryptosporidium spp. em crianças e seus respectivos cães e gatos de estimação residentes no Município de Andradina, SP, por meio do Teste de Imunoadsorção Enzimática (ELISA). Durante o período de janeiro a agosto de 2009, foram analisadas 188 amostras fecais de crianças, bem como de seus respectivos cães e gatos de estimação para pesquisa de Cryptosporidium spp. O teste quiquadrado (χ2) foi utilizado para verificar a associação entre as variáveis: sexo, idade, raça e consistência fecal, com nível de significância de 5%. Pelo ELISA foi detectado Cryptosporidium spp. em em amostras fecais de 2,1% (4/188) das crianças com idade inferior a sete anos. Entre os animais examinados, 6,8% (9/132) dos cães e 5,4% (3/56) felinos apresentaram amostras positivas para este coccídeo. Tanto nas crianças como nos animais não houve influencia do sexo e da idade na detecção do Cryptosporidium spp. sendo que nestes últimos a raça também não influenciou (P> 0,05). Neste trabalho foi evidenciada uma baixa ocorrência deste parasito nas crianças, assim só será possível determinar com precisão a relação entre a infecção das crianças com dos animais, com a posterior caracterização molecular deste protozoário. / Abstract: The objective this study was to evaluate the occurrence of Cryptosporidium spp. in children and their dogs and pet cats in the city of Andradina, SP. through Test-linked immunosorbent assay (ELISA), during the period from January to August 2009, we analyzed 188 fecal samples from children, as well as their dogs and pet cats for detection of Cryptosporidium spp. The chi-square test (χ2) was used to verify the association between gender, age, race and fecal consistency, with a significance level of 5%. Using ELISA was detected Cryptosporidium spp. in stool samples in 2.1% (4/188) of children under the age of seven years. Among the animals examined, 6.8% (9/132) of dogs and 5.4% (3/56) cats had positive samples for this coccidium. Both children and animals there was no influence of sex and age on the detection of Cryptosporidium spp. being that in these last race did not influence (P> 0.05). This study demonstrated a low occurrence of this parasite in children, so only you can accurately determine the relationship between the infection of children with the animal with the molecular characterization of this parasite. / Mestre

Estrongiloidíase é a infecção parasitária causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. Em indivíduos imunocompetentes cursa de forma crônica e assintomática na maioria dos casos; entretanto em imunocomprometidos pode assumir as formas graves como a hiperinfecção e/ou estrongiloidíase disseminada. Diante da baixa sensibilidade do diagnóstico parasitológico, vêm sendo realizadas pesquisas envolvendo o imunodiagnóstico, sobretudo voltadas para variações na obtenção das frações antigênicas heterólogas utilizando Strongyloides venezulensis como fonte de antígeno. O presente trabalho teve como objetivo aprimorar o diagnóstico sorológico da estrongiloidíase humana utilizando técnicas imunoproteômicas. Foram utilizadas amostras de fezes e soro de indivíduos imunocompetentes, divididos em três grupos de acordo com o resultado do exame parasitológico (P: positivos para S. stercoralis; OP: com outras parasitoses; N: negativos para quaisquer parasitos ou comensais) e imunocomprometidos divididos em dois grupos de acordo com o resultado do exame parasitológico (S+ID: positivos para S. stercoralis e S-ID: negativos para S. stercoralis ou qualquer parasito). As amostras de soro dos cinco grupos de pacientes foram submetidas a testes sorológicos a partir das frações antigênicas heterólogas de S. venezuelensis solúvel (TS) e de membrana (TM) utilizando as técnicas ELISA, DOT ELISA e Western-blotting. O ELISA apresentou 95% de sensibilidade em ambas frações antigênicas e 91,8% e 93,8% de especificidade para TS e TM, respectivamente. A técnica foi capaz de detectar anticorpos anti-Strongyloides em 34,4% e 28,1% em pacientes do grupo S+ID utilizando os antígenos TS e TM, respectivamente. O DOT ELISA foi executado somente com a fração TM e apresentou 95% de sensibilidade e 85,7% de especificidade detectando 28,1% de positividade no grupo S+ID. A banda de 40-35 KDa foi a única frequente em todos indivíduos do grupo P e a mais frequente em pacientes S+ID (62,5% para TS e 53,1% para TM). Géis réplicas foram realizados, excisados nas regiões de identificação proteica e submetidos a identificação de proteínas por espectrometria de massas. As proteínas mais abundantes nas frações antigênicas TS e TM foram actina e galectina. A fração TS foi purificada em coluna de afinidade para galectina, dada sua capacidade de modulação do sistema imunológico. As frações não ligada (NL) e galectina (Gal) foram utilizadas como antígenos na técnica ELISA apresentando 90% de sensibilidade e 89,8 e 75% de especificidade para NL e Gal, respectivamente. Foram positivos no ELISA 34,4% e 18,1% das amostras do grupo S+ID utilizando as frações NL e Gal, respectivamente. As técnicas sorológicas utilizando variações antigênicas constituem ferramentas alternativas importantes de diagnósticos que podem ser aplicadas à estrongiloidíase humana, sobretudo na população imunocomprometida / Strongyloidiasis is a parasitic infection caused by nematode Strongyloides stercoralis. In immunocompetent patients, it is chronic and asymptomatic in the most of cases. However, in immunocompromised patients, it can take on severe forms such as hyperinfection and / or disseminated strongyloidiasis. Due to the parasitological diagnosis\'s low sensitivity, research involving the immunoassay has been carried out, primarily focused on changes in the heterologous antigenic fractions using Strongyloides venezulensis as a source of antigen. The present work aimed to improve the serological diagnosis of human strongyloidiasis using immunoproteomic techniques. Feces and sera samples from immunocompetent patients were used and divided into three groups according to parasitological examination result (P: positive for S. stercoralis, OP: with other parasites, N: negative for any parasites or commensal). Samples from immunocompromised patients were divided into two groups according to the parasitological examination result (S+ID: positive for S. stercoralis and S-ID: negative for S. stercoralis or any parasite). Serum samples from the five groups of patients were submitted to serological tests by S. venezuelensis soluble (TS) and from membrane (TM) heterologous antigenic fractions by ELISA, DOT ELISA and Western blotting techniques. The ELISA test showed 95% sensitivity in both antigenic fractions and 91.8% and 93.8% specificity for TS and TM, respectively. This technique was able to detect anti-Strongyloides antibodies in 34.4% and 28.1% in S+ID group by using the TS and TM antigens, respectively. DOT ELISA was performed only with the TM fraction and showed 95% sensitivity and 85.7% specificity, detecting 28.1% positivity in S+ID group. The 40-35 KDa band was the only present in all P group individuals and the most frequent in S+ID patients (62.5% for TS and 53.1% for TM). Replicate gels were made, excised in the protein identification regions and submitted to protein identification by mass spectrometry. The most abundant proteins in TS and TM antigenic fractions were actin and galectin. TS antigen was purified on a galectin affinity column, due the immune modulation ability. The non-bound (NL) and galectin (Gal) fractions were used as antigens in the ELISA technique with 90% of sensitivity and 89.8 and 75% of specificity for NL and Gal, respectively. 34.4% and 18.1% of S+ID group were positive in the ELISA by NL and Gal fractions, respectively. Serological techniques using antigenic variations are an important alternative diagnostic tool and can be applied to human strongyloidiasis, especially in the immunocompromised population

Triquentrinas A são produtos naturais marinhos com atividade biológica e alta complexidade estrutural. Estes fatores tornam estes alcaloides e compostos análogos, como os herbindóis, alvos para a síntese total e plataforma para o desenvolvimento de novas metodologias sintéticas. Nesta Dissertação de Mestrado, procurou-se completar a síntese estereosseletiva da (+)-cis-triquentrina A empregando-se intermediários sintéticos protegidos com o grupo benzila que poderão ser usados para a futura prospecção de novos compostos com atividade biológica. A rota proposta baseia-se na obtenção do ácido (S)-3-(1-benzil-4-etil-1H-indol-7-il)butanóico, um intermediário-chave já descrito por Silva e colaboradores no percurso da síntese total da (+)-trans-triquentrina A, e da finalização da síntese de acordo com a abordagem proposta pelo grupo de RajanBabu para conversão do análogo protegido com grupo tosila à (+)-cis-triquentrina A. A resolução enzimática do intermediário-chave com lipase de Pseudomonas cepacia imobilizada em terra diatomácea foi otimizada, resultando em rendimentos de 32% e 99% ee na metade do tempo descrito anteriormente. Na etapa-chave da síntese, o (S)-ácido foi submetido a uma acilação de Friedel-Crafts intramolecular na presença de anidrido trifluoroacético que produziu o produto de ciclização desejado com 40% de rendimento. Na etapa final da síntese, o intermediário sintético protegido com grupo benzila não pode ser convertido à (+)-cis-triquentrina A, empregando-se a metodologia desenvolvida para a redução do composto análogo tosilado, dada a diferença de reatividade imposta pela troca do grupo protetor. As etapas realizadas até o penúltimo intermediário sintético (S)-8, consta com 10 etapas e rendimento global de 1,3%. viii As diferenças eletrônicas e estruturais relacionadas a diferentes grupos protetores poderão ser refletidas em variações na atividade antiproliferativa de indóis relacionados a triquentrinas. Ainda no interesse de preparar moléculas para envio à análises de atividade antiproliferativa preparou-se um composto relacionado à síntese da trans-triquentrina A tendo como etapa-chave uma contração de anel mediada por I(III) em 21% de rendimento, cujo trabalho foi incluído nos anexos. / Trikentrins A are marine natural products with biological activity and high structural complexity. These factors make these alkaloids and analogous compounds, such as herbidoles, targets for total synthesis and platform for the development of new synthetic methodologies. In this Master\'s Dissertation, we attempted to complete the stereoselective synthesis of (+)-cis-trikentrin A using synthetic intermediates protected with the benzyl group that could be used for the future prospection of new compounds with biological activity. The proposed route is based on the preparation of (S)-3-(1-benzyl-4-ethyl-1H-indol-7-yl) butanoic acid, a key intermediate already described by Silva et al., in the course of total synthesis (+)-trans-triquentrin A, and the final part of the synthesis according to the approach proposed by the RajanBabus group for conversion of the protected analogue with tosyl group to (+)-cis-trikentrin A. The enzymatic resolution of the key intermediate with Pseudomonas cepacia lipase immobilized on diatomaceous earth was optimized, resulting in 32% yield and 99% ee in half the time described above. In the key step of the synthesis, the (S)-acid was subjected to an intramolecular Friedel-Crafts acylation in the presence of trifluoroacetic anhydride which yielded the desired cyclization product in 40% yield. In the final step of the synthesis, the synthetic intermediate protected with benzyl group couldnt be converted to (+)-cis-trikentrin A, employing the methodology developed for the reduction of the tosylated analogous compound, given the difference of reactivity imposed by exchange of the protective group. The steps carried out up to the synthetic intermediate (S)-8, consists of 10 steps and overall yield of 1.3%. Electronic and structural differences related to different protective groups may be reflected in variations in the antiproliferative activity of indoles related to trikentrins. A compound related to the synthesis of trans-triquentrin A having as its key step an I(III) mediated ring contraction in 21% yield was also prepared in the interest of preparing molecules for antiproliferative activity analysis, whose work was included in the appendix.

Haemophilus influenzae tipo b é uma bactéria Gram-negativa, patogênica causadora de meningites em crianças. A cápsula polissacarídica (PSb) é o principal fator de virulência e é usado como antígeno vacinal. O método clássico de purificação do PSb envolve várias etapas de precipitação com etanol, fenol e detergente catiônico (inflamável, corrosivo e tóxico), e etapas de ultracentrifugação. O objetivo deste estudo foi substituir total ou parcial as precipitações e/ou uso das centrífugas por cromatografia, digestão enzimática, microfiltração e ultrafiltração tangencial. As cromatografias de troca iônica e de filtração em gel não apresentaram boas purificações, entretanto a hidrofóbica pode eliminar as proteínas contaminantes. As precipitações com etanol foram necessárias para obter a pureza requerida. O etanol de alguma forma favoreceu a ação enzimática e facilitou a posterior ultrafiltração. A separação com etanol em fibra-oca de microfiltração tangencial mostrou melhores purificações do que a centrifugação, mas com uso repetido verificou-se redução na eficiência. / Haemophilus influenzae type b is Gram-negative pathogenic bacterium cause meningitis in children. The capsular polysaccharide (PSb) is the main virulence factor and it is used as vaccine antigen. The classical PSb purification process includes ethanol, phenol and cationic detergent precipitations (explosion prone, corrosive, toxic) and ultracentrifugation steps. The aim of this work was to replace total or partial ethanol precipitations steps and/or elimination of centrifugation by chromatography methods, enzymatic digestion and ultrafiltration (UF) or microfiltration. The results have showed that ion exchange chromatography and gel filtration did not result in good purification, however the hydrophobic can be used for proteins elimination. The ethanol precipitation steps are necessary to achieve the required purity of PSb. In some way ethanol contributed for enzymes action and further improvements in the UF. The ethanol separation with hollow fiber microfiltration exhibited better purification than centrifugation, but after some uses the efficiency has reduced.

Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) catalisam a hidrólise de fosfotirosina de outras proteínas e, assim, regulam importantes processos bioquímicos. Dois representantes desta família são as fosfatases de dupla especificidade VHR e CDC25B. A primeira etapa de reação catalisada é um ataque nucleofílico da cadeia lateral de uma cisteína sobre o fósforo do substrato, com uma possível transferência de H+ de um ácido geral para o grupo de saída, formando uma PTP intermediária tiofosforilada e desfosforilando o substrato. Dúvidas ainda persistem sobre esta etapa, envolvendo os estados de protonação do substrato e do nucleófilo enzimático, a inatividade de certos mutantes e a identificação do ácido geral nas CDC25s. Procuramos solucionar estas questões por simulações computacionais das reações catalisadas pela VHR e pela CDC25B. Inicialmente, caminhos das reações de tiólise e alcoólise de ésteres de fosfato na fase gasosa foram determinados por cálculos de estrutura eletrônica ab initio e analisados como referências da reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e como modelos da atividade enzimática. Um potencial híbrido de mecânica quântica e mecânica molecular foi amplamente testado e calibrado, empregando estes caminhos de reação e outros dados ab initio. A calibração permitiu que conclusões semiquantitativas pudessem ser obtidas a partir das simulações enzimáticas. Potenciais de força média foram determinados com o potencial híbrido para desfosforilação de diferentes substratos catalisada pelas PTPs selvagens e por suas mutantes. Os resultados mostram que o mecanismo da reação catalisada segue uma adição e eliminação simultânea, com um estado de transição dissociativo com caráter de metafosfato. As barreiras calculadas são bastante próximas às energias de ativação experimentais. O substrato enzimático é um diânion desprotonado e o nucleófilo está ionizado. As reações do substrato ou do nucleófilo protonados apresentam barreiras, no mínimo, 15 kcal/mol mais altas que os valores experimentais. A VHR mutante cisteína para serina no sítio ativo é inativa, porque a serina está protonada. As CDC25s não utilizam um ácido geral para catálise, ao contrário das outras PTPs. Propostas de que o ácido geral poderia ser o próprio substrato ou um dos ácidos glutâmicos presentes no sítio ativo são energeticamente inacessíveis. / Protein tyrosine phosphatases (PTPs) catalyse the hydrolysis of phosphotyrosine from other proteins and, hence, regulate important biochemical processes. Two members from this family are the dual specificity phosphatases VHR and CDC25B. The first step of the catalysed reaction is the nucleophilic attack from the side chain of a cystein towards the substrate, with a possible H+ transfer from a general acid to the leaving group, forming a PTP thiophosphorylated intermediate and dephosphorylating the substrate. There are still some doubts about this step, involving the protonation states of the substrate and the nzymatic nucleophile, the inactivity of certain mutants and the identification of the general acid in CDC25s. We tried to solve this questions by computer simulations of the reactions catalysed by VHR and by CDC25B. Initially, reaction pathways of phosphate esters thiolysis and alcoholysis in the gas-phase were determined by ab initio electronic structure calculations and analysed as benchmarks for the intrinsic reactivity of phosphate esters and as models of the enzymatic activity. A hybrid potential of quantum mechanics and molecular mechanics was fully tested and calibrated, employing these reaction pathways and other ab initio data. The calibration allowed that semiquantitative conclusions could be obtained from the enzymatic simulations. Potentials of mean force were determined with the hybrid potential for the dephosphorylation of different substrates catalysed by the wild-type PTPs and their mutants. The results show that the catalysed reaction mechanism follows a concerted addition and elimination, with a dissociative transition state with metaphosphate-like. The calculated barriers are very close to the experimental activation energies. The enzymatic substrate is a deprotonated dianion and the nucleophile is ionised. The reactions of the protonated substrate or nucleophile have barriers, at least, 15 kcal/mol higher than the experimental results. The active site cystein to serine VHR mutant is inactive because the serine is protonated. The CDC25s do not employ a general acid for catalysis, differently from the other PTPs. Proposals that the general acid is the substrate or one of the glutamic acids present in the active site are not energetically accessible.

Hemicelulose extraída do bagaço de cana-de-açúcar foi hidrolisada por enzimas de Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei e Aspergilus niger para obtenção de xilo-oligossacarídeos (XOs). A hemicelulose foi extraída com hidróxido de sódio na presença de antraquinona, sulfito de sódio ou peróxido de hidrogênio. O uso de antraquinona ou sulfito aumentou o rendimento de extração, porém a hemicelulose apresentou baixa solubilidade em água, propriedade inadequada para a hidrólise enzimática. A extração da hemicellulose com peróxido de hidrogênio em meio alcalino foi otimizada através de um planejamento fatorial completo 24 variando-se a concentração de H2O2 de 2 a 6% (m/v), tempo de reação de 4 a 16 h, temperatura de 20 a 60°C e presença ou não de 0,5% de sulfato de magnésio. No ponto central o rendimento de extração de hemicelulose foi de 94,5% com remoção de mais que 88% da lignina. Um rendimento de 86% de hemicelulose com baixo teor de lignina (5,9%) foi obtido em 6% de peróxido de hidrogênio por 4h a 20°C. Nessa condição a hemicelulose apresentou massa molar de 21.000 g/mol, composição aproximada de 81% xilose, 4% de arabinose, 4% de glicose e 3% de ácidos urônicos, alta solubilidade em água (90 % em massa) e coloração amarelo claro. As enzimas usadas na hidrólise dessa hemicelulose foram produzidas pelo cultivo dos fungos em meio sólido contento farelo de trigo. Em todos os extratos foi observada baixa atividade de endoglucanase e β-xilosidase e elevadas atividades de endo-β-1,4-xilanase. A máxima atividade de xilanase foi produzida por T. aurantiacus (1500 U/g), enquanto A. niger produziu 500 U/g e T. reesei 240 U/g, em 5 dias de cultivo. O perfil de produção de XOs com enzimas de T. aurantiacus e T. reesei foi semelhante, o principal produto foi xilobiose, seguido por xilose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose, sendo esses XOs de cadeia linear. A hidrólise da hemicelulose com enzimas de A. niger produziu exclusivamente xilose, consequência da presença de elevada atividade de β-xilosidase. A velocidade de conversão da hemicelulose em XOs com as enzimas de T. reesei foi maior no início da reação (6 h), diminuindo a partir de 24 h, período em que inicia a produção de xilose. A influência da concentração de substrato e carga de xilanase na conversão da hemicelulose em XOs foi avaliada através de um planejamento experimental 22 com face centrada. A condição otimizada da hidrólise (2,6% substrato e 60 U/g de endo-β-1,4-xilanase) com o extrato de T. aurantiacus resultou em 42% de conversão em XOs. A otimização da hidrólise da hemicelulose com o extrato de T. reesei resultou em uma conversão máxima de 20%, com ótimo de 3,8 % de substrato e 87,5 U/g de endo-β-1,4-xilanase. A eficiência da hidrólise com enzimas de T. aurantiacus foi maior que a obtida com alguns extratos comerciais testados neste trabalho. Além disso, apresentaram capacidade de degradar hemiceluloses de diferentes fontes: bétula e semente de aveia, com composições variadas. Diferenças na composição de açúcares e teor de lignina não interferiram na ação dessas enzimas. A hidrólise enzimática mostrou-se mais apropriada para a produção de XOs do que a auto-hidrólise, que gerou predominantemente xilose e houve formação de furfural. Apesar do curto tempo de reação, a produção de XOs foi menor e há necessidade de purificação para obtenção de um produto final com características desejáveis. / Hemicellulose extracted from sugarcane bagasse was hydrolyzed by enzymes from Thermoascus aurantiacus, Trichoderma reesei and Aspergilus niger to cause the degradation of xylan to xylooligosaccharides (XOs). Hemicellulose was extracted with hydrogen peroxide in the presence of antraquinone, sodium sulphite or hydrogen peroxide. Hemicelluloses extracted with antraquinone or sulphite presented low solubility in water, which is not appropriated to enzymatic hydrolysis. To maximize the hemicellulose yields several extraction conditions were examined applying the 24 factorial design: H2O2 concentration from 2 to 6% (w/v), reaction time from 4 to 16 h, temperature from 20 to 60°C, and magnesium sulfate absence or presence (0.5%, w/v). This approach allowed selection of conditions for the extraction of low and high lignin content hemicellulose. At midpoint the yield of hemicellulose was 94.5% with more than 88% of lignin removed. Hemicellulose in 86% yield with low lignin content (5.9%) was obtained with 6% H2O2 treatment for 4 h and 20°C. This hemicellulose is much lighter in color than samples obtained at the midpoint condition and was found suitable for subsequent enzymatic hydrolysis. The molecular weight of hemicellulose was 21,000 g/mol with composition of aproximately 81% xylose, 4% arabinose, 4% glucose and 3% uronic acids, high water solubility (90 %). Enzymes for hemicellulose hydrolysis were produced by the fungi on wheat bran. Cellulases and hemicellulases were present in all extracts especially the endo-β-1,4-xylanase. The profile of production of XOs obtained on hydrolysis with enzymes from T. aurantiacus and T. reesei was similar, with the main product xylobiose, followed by xylose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose, and these XOs showed linear chain. The hydrolysis of hemicellulose with enzymes of A. niger produced exclusively xylose, a consequence of β-xylosidase content. The rate of conversion of hemicellulose in XOs with enzymes of T. reesei was higher at the beginning of the reaction (6 h), decreasing from 24 h, when starts the production of xylose. The influence of substrate concentration and loading of xylanase in conversion of hemicellulose to XOs was evaluated by an 22 full factorial design with centered face. Optimization of hydrolysis (2.6% substrate and 60 U/g endo-β-1,4-xylanase) with the extract of T. aurantiacus resulted in 42 % conversion XOs. The optimization with the extract of T. reesei resulted in a conversion of hemicellulose up to 20%, with optimal substrate 3.8% and 87.5 U/g endo-β-1,4-xylanase. The efficiency of hydrolysis by enzymes from T. aurantiacus was superior to commercial extracts, and showed ability to degrade hemicelluloses of different compositions (birchwood and oat spelt). The structural differences, such as branches and lignin content did not affect the action of these enzymes. The differences in the efficiency and extent of enzymatic hydrolysis by enzymes of these fungi might have occurred in function of differences in physicochemical properties and specific activity. The enzymatic hydrolysis was more appropriate for production of XOs than autohydrolysis, which generated predominantly xylose and formation of furfural. Despite of short reaction time, the production of XOs was low and purification is needed in order to obtain a final product with desirable characteristics.

O presente trabalho avaliou o comportamento de três híbridos de cana-de-açúcar, contrastantes quanto aos teores de hemicelulose e lignina, diante do pré-tratamento com ácido sulfúrico diluído e da subsequente conversão enzimática da glucana à glicose. Os híbridos 89, 140 e 321 (H89, H140 e H321) foram submetidos à diferentes condições de pré-tratamento ácido: 150 ºC; 13 g ácido sulfúrico/100 g material; e tempos de reação que variaram entre 20 e 90 min. Os rendimentos de sólidos residuais diminuíram progressivamente em função do aumento da severidade do pré-tratamento. O H89 apresentou rendimentos nitidamente menores, comparados ao dos híbridos H140 e H321; reflexo da maior solubilização de todos os três constituintes estruturais deste híbrido. A hemicelulose foi o componente da parede celular removido com maior eficiência pelo pré-tratamento ácido. Além disso, o pré-tratamento modificou a proporção molar dos constituintes iniciais da hemicelulose (xilose, ácido acético e arabinose), resultando em estruturas residuais menos ramificadas. Paralelamente, também foi observada uma pequena remoção de lignina (entre 21% e 31%, dependendo do híbrido) e de glucana (entre 4% e 15%, dependendo do híbrido) durante o pré-tratamento. Os carboidratos detectados nos hidrolisados ácidos dos híbridos foram predominantemente monoméricos quando os tempos de reação foram maiores do que 40 min. No entanto, os híbridos H140 e H321 se diferenciaram do H89, pois apresentaram oligossacarídeos (DP>=2) nos hidrolisados obtidos em tempos de reação entre 20 e 30 min. Os rendimentos de conversão enzimática da glucana contida nos sólidos pré-tratados aumentaram substancialmente após o pré-tratamento ácido (principalmente devido à remoção de hemicelulose). No entanto, as conversões máximas de glucana em glicose não ultrapassaram 65%. A deslignificação parcial das amostras pré-tratadas com ácido (90 min), empregando soluções de clorito de sódio/ácido acético, permitiu aumentar a conversão enzimática de glucanas até valores próximos a 100%. De forma geral, o pré-tratamento ácido e a subsequente deslignificação proporcionaram maiores ganhos de conversão enzimática àqueles híbridos inicialmente mais recalcitrantes (H321 e H140). Os rendimentos de pré-tratamento (ácido diluído e clorito-ácido) e da conversão enzimática demonstraram que a maior obtenção de glicose por área plantada (Kg/hectare) ou por material processado (Kg/ton material) seria alcançada com a utilização dos híbridos H89 e H321, respectivamente. A investigação das características microestruturais das paredes celulares dos híbridos permitiu compreender como as etapas de tratamento químico afetaram a conversão enzimática da glucana. O pré-tratamento ácido diminuiu substancialmente o volume total de poros dos três híbridos, enquanto a subsequente deslignificação não retornou a porosidade aos níveis originalmente detectados nas amostras não tratadas. Por outro lado, a área superficial acessível de glucana dos substratos apresentou relação direta com os rendimentos de conversão enzimática da glucana à glicose (R2=0,92). A compilação dos dados analíticos, aliada às determinações de glucana acessível, permitiu propor um parâmetro empírico (relação do teor de glucana com a soma de hemicelulose+lignina+extraíveis), útil para predizer os níveis de conversão enzimática de glucana nas amostras estudadas. / This study evaluated the performance of three sugarcane hybrids, contrasting for lignin and hemicellulose contents, under dilute sulfuric acid pretreatment and subsequent enzymatic conversion of glucan to glucose. The hybrids 89, 140 and 321 (H89, H140, and H321) were pretreated at different reaction conditions: 150 °C; 13 g sulfuric acid/100 g material; and reaction time ranging from 20 to 90 min. Residual solid yields gradually decreased according to increasing of pretreatment severity. H89 showed the lowest yields compared to the H140 and H321 hybrids, due to the highest solubilization of all the three structural components. Hemicellulose was the major cell wall component removed by the acid pretreatment. Furthermore, acid pretreatment modified the molar ratio of the initial hemicellulose constituents (xylose, arabinose and acetic acid), resulting in less branched structures. Lignin (between 21% and 31%, depending on the hybrid) and glucan (between 4% and 15%, depending on the hybrid) removal were also observed during the pretreatment. Carbohydrates in liquid hydrolysates were predominantly detected as monomers at reaction times greater than 40 min. However, H140 and H321 hybrids differed from H89, since they presented oligosaccharides (DP>=2) in the hydrolysates obtained at short reaction time (20 and 30 min). Enzymatic conversion of glucan from pretreated solids was substantially increased after the acid pretreatment (mainly due to the hemicellulose removal). Nevertheless, maximum conversion of glucan to glucose did not exceed 65%. Partial delignification of the acid pretreated samples (90 min), employing sodium chlorite/acetic acid solutions, increased the enzymatic conversion of glucan to values near to 100%. In general, acid pretreatment and subsequent delignification provided higher gains of enzymatic conversion to the hybrids originally more recalcitrant (H321 and H140). The pretreatment (dilute acid and chlorite-acid) and enzymatic conversion yields demonstrated that to obtain higher amounts of glucose, taking into account the planted area (Kg/ha) or raw material processed (Kg/ton), would be achieved by using H89 and H321 hybrids, respectively. Analysis of the micro-structural features of the hybrids allowed understanding the effect of the chemical treatment step in the enzymatic conversion of glucan. Acid pretreatment significantly decreased the total pores volume of these hybrids, while the subsequent delignification do not returned the porosity to the original levels detected in raw samples. On the other hand, the accessible surface area of glucan showed a direct correlation with the enzymatic conversion levels of glucan to glucose (the model including several substrates presented R2=0.92). The compilation of analytical data, combined with the accessible glucan, allowed proposing an empirical parameter (ratio of the glucan content with the sum of hemicellulose+lignin+extractives), that was useful for predicting the enzymatic conversion levels of glucan for all the evaluated samples.