Objetivos: Investigar o dano a lipídios, proteínas e ao DNA, níveis de glicosaminoglicanos (GAGs) e as concentrações de interleucina 1-β (IL1-β) em sangue de pacientes com Mucopolissacaridose (MPS) tipo II no diagnóstico e durante a terapia de reposição enzimática (TRE) e correlacioná-los com parâmetros de estresse oxidativo, bem como analisar o efeito in vitro da genisteína sob o dano ao DNA em leucócitos de pacientes com MPS tipo IVA. Métodos: Amostras de sangue e urina de doze pacientes com MPS II no diagnóstico e sob tratamento com TRE, além de controles saudáveis foram utilizados para avaliar: índice de lipoperoxidação e oxidação de proteínas (medida a partir do conteúdo de grupamentos carbonila e SH) em plasma, GAGs urinários, níveis de IL1-β plasmáticos, bem como índice de dano ao DNA em leucócitos através do ensaio cometa, também utilizada para avaliar o dano ao DNA em leucócitos de pacientes com MPS IVA, previamente incubados em diferentes concentrações de genisteína ou em tampão fosfato salino e dimetilsulfóxido. Resultados e Discussão: Foi observada a presença de dano oxidativo a biomoléculas em sangue de pacientes com MPS II, com altos níveis de lipoperoxidação, conteúdo de grupamentos carbonila, dano ao DNA e redução de grupos sulfidrila. Houve redução no dano ao DNA e na lipoperoxidação após TRE, além de aumento de grupamentos sulfidrila, embora a terapia não tenha sido capaz de reverter o dano a carbonila. Nossos resultados sugerem que o aumento dos GAGs induz o dano aos lipídios e ao DNA. A adição in vitro de genisteína (10, 30 e 50 μM) em amostras de sangue de pacientes MPS IVA acarretou em um aumento estatisticamente significativo no índice de dano ao DNA. Conclusões: Estresse oxidativo e inflamação estão envolvidos na fisiopatologia da MPS II. Além disso, a TRE mostrou ter papel protetor contra o dano ao DNA e a lipídios. A genisteína nas doses 10, 30 e 50 μM aumentou in vitro o índice de dano ao DNA em leucócitos de pacientes MPS IVA, demonstrando citotoxicidade. / Objectives: Investigate lipid, protein and DNA damage, glycosaminoglycans (GAGs) levels and the inflammatory marker interleukin 1-β (IL1-β) concentration of mucopolysaccharidosis (MPS) II patients at the moment of diagnosis and during enzyme replacement therapy (ERT), correlate these findings with oxidative stress parameters, as well as investigate the in vitro effect of genistein on DNA injury in leukocytes from MPS IVA patients. Material and Methods: Blood and urine samples from twelve MPS II patients at diagnosis and under ERT and healthy controls were evaluated regarding the parameters: lipid peroxidation index and protein oxidation (carbonyl and SH group contents) in plasma, urinary GAGs, as well as IL-1β in plasma and DNA damage index in leukocytes. Besides, blood samples from MPS IVA patients were incubated with different concentrations of genistein or phosphate buffered saline (PBS) and dimethylsulfoxide (DMSO), and the DNA damage index in leukocytes was evaluated by the comet assay. Results and Discussion: MPS II patients presented oxidative damage to biomolecules with high levels of lipid peroxidation, carbonyl content and DNA damage, as well as a reduction on SH groups. There was a decrease in DNA damage and lipid oxidative injury after ERT, and an increase in SH levels, although this therapy was not able to reverse carbonyl content. The high levels of urinary GAGs in MPS II patients were reduced after ERT and positively correlated with DNA and lipid oxidative injury, suggesting that GAGs accumulation induce lipid peroxidation and DNA damage. MPS IVA patients blood treated in vitro with genistein (10, 30 e 50 μM) had higher DNA damage index when compared to samples treated with PBS buffer and DMSO. Conclusions: Oxidative stress and inflammation process are involved in MPS II pathophysiology, and ERT protects against DNA and lipid injury, probably by reducing GAGs accumulation. Genistein increased in vitro DNA damage in leukocytes from MPS IVA patients, demonstrating cytotoxicity.

Les maladies lysosomales forment un groupe hétérogène d’une cinquantaine d’affections qualifiées de « rares ». Actuellement, seulement 9 maladies lysosomales disposent d’un traitement spécifique, principalement par enzymothérapie substitutive, mais les effets bénéfiques sont souvent limités. Le manque de ciblage pour le Récepteur du Mannose 6-Phosphate (RM6P), responsable de l’internalisation dans les lysosomes, expliquerait en partie cette efficacité modérée des enzymes thérapeutiques. Dans ce contexte, nous avons développé une approche de ciblage innovante basée sur des Analogues synthétiques du Mannose 6-Phosphate fonctionnalisés sur l’Aglycone (appelés AMFA) afin de répondre aux besoins non satisfaits par les traitements actuels.Les travaux de cette thèse portent principalement sur la maladie de Pompe, myopathie causée par la déficience d’une enzyme lysosomale, l’Alpha Glucosidase Acide (GAA), responsable de la conversion du glycogène en glucose. Afin d’améliorer l’adressage de l’enzyme thérapeutique aux lysosomes via le RM6P, nous avons fonctionnalisé la GAA recombinante humaine (rhGAA) avec les AMFA. Nos études sur la forme adulte de la maladie ont démontré une augmentation significative de l’internalisation et pour la première fois, chez des souris âgées modèles de la maladie, une restauration de la santé musculaire et une amélioration significative de la fonction motrice ont été observées (article 1). Nous nous sommes ensuite intéressés aux propriétés de la rhGAA-AMFA. Nous avons démontré que l’efficacité de la rhGAA-AMFA n’était pas uniquement due à une meilleure internalisation mais également à une meilleure maturation intracellulaire de l’enzyme (article 2). En effet, nos résultats ont démontré que chez les patients atteints de la maladie de Pompe, il existe une surexpression des phosphatases acides ACP2 et ACP5. Ces phosphatases peuvent détruire le signal mannose 6-phosphate (M6P) naturellement présent sur l’enzyme, ce qui interrompt sa maturation en forme active. L’AMFA, contrairement au M6P, est insensible à cette dégradation et assure donc la stabilité de l’adressage de l’enzyme in vitro, mais également in vivo.L’ensemble de ces résultats suggèrent que le greffage des AMFA sur des enzymes recombinantes représente une nouvelle solution thérapeutique pour le traitement de la maladie de Pompe et potentiellement pour le traitement d’autres maladies lysosomales. / Lysosomal diseases form a heterogeneous group of about fifty rare diseases. At present, only 9 lysosomal diseases have a specific treatment, mainly by enzyme replacement therapy but the beneficial effects appear often limited. The lack of targeting for the Mannose 6-Phosphate Receptor (M6PR), responsible for internalization into the lysosomes, would partly explain this moderate efficiency of the therapeutic enzymes. In this context, we have developed an innovative targeting approach based on Mannose 6-Phosphate Synthetic Analogues Functionalized at the Aglycone position (called AMFAs) to address the unmet needs of current treatments.The work of this thesis focuses mainly on Pompe disease which is a myopathy caused by the deficiency of a lysosomal enzyme, Acid Alpha Glucosidase (GAA), responsible for the conversion of glycogen into glucose. In order to improve the targeting of the therapeutic enzyme to lysosomes via the M6PR, we have functionalized the human recombinant GAA (rhGAA) with the AMFAs. Our studies on aged mice model of the adult form of the disease have demonstrated a significant increase of the enzyme internalization and for the first time, the restoration of muscle health and the significant improvement in motor function (article 1). We then investigated the properties of rhGAA-AMFA. We have proved that the effectiveness of rhGAA-AMFA is not only due to a better cell uptake but also to a more complete intracellular processing of the enzyme (article 2). Indeed, our results demonstrated that in myoblasts of patients affected by Pompe disease there is an overexpression of ACP2 and ACP5 acid phosphatases. These phosphatases can destroy the mannose 6-phosphate signal (M6P) naturally present on the enzyme, therefore possibly interrupting its processing into the active form. AMFA, unlike M6P, is insensitive to this degradation and thus ensures the stability of enzyme addressing in vitro, but also in vivo.All together, these results suggest that the grafting of the AMFAs on recombinant enzymes represents a new therapeutic solution for the treatment of Pompe disease and potentially for other lysosomal diseases.

INTRODUÇÃO: Após a cirurgia pancreática, a função exócrina é determinada pela extensão da ressecção e a quantidade de tecido pancreático remanescente, sendo recomendável a avaliação da insuficiência pancreática exócrina (IPE) em todos os pacientes. A reposição de enzimas pancreáticas é o pilar do tratamento da IPE, pois melhora a absorção de gordura, diminui os sintomas relacionados com a má absorção e melhora a qualidade de vida (QV). OBJETIVO: Sabendo que o ajuste da dose de enzimas pancreáticas é realizado com base nos sinais clínicos relatados pelo paciente, o presente estudo visa aprofundar a avaliação clínica destes e avaliar o atual protocolo de tratamento, mantendo ou melhorando a QV dos pacientes. MÉTODOS: Estudo transversal em que foram avaliados adultos com histórico de ressecção pancreática há 6 meses ou mais. No tempo 1 foi realizada avaliação nutricional antropométrica e recordatório alimentar, avaliação clínica de qualidade de vida (questionário SF-36), investigação hábitos intestinais e exames laboratoriais. No tempo 2 foi realizada nova consulta para discussão dos resultados e orientação nutricional individualizada. Para análise de correlações foi usado o teste de Pearson, para associações o teste de Fisher e para comparação de médias o teste Mann-Whitney. RESULTADOS: Foram avaliados 39 pacientes, 22 (56,4%) do sexo feminino; 33 (84,6%) >=60 anos; tempo pós operatório 14,1± 6,8 anos; exames bioquímicos: em todas as dosagens a maioria dos pacientes apresenta resultados dentro dos valores de referência, mas há alta prevalência de deficiência de vitaminas lipossolúveis; os pacientes têm bom estado nutricional já que grande parte apresenta eutrofia segundo o IMC (46,1%) e segundo a porcentagem de gordura (35,9%); no geral não relatam sintomas gastrointestinais adversos: 61,5% com fezes formadas, 53,8% sem dor abdominal, 84,6% sem esteatorreia; adequação no consumo de macronutrientes: 51,3% consumo adequado de carboidratos e lipídios, e 64,1% de consumo excessivo de proteínas; correlações positivas: a dose de enzimas se correlaciona com a dor (p= 0,004) e o IMC (p= 0,009), ou seja, pacientes que relatam mais dor e que pesam mais são os que recebem as maiores doses de enzimas pancreáticas; correlações negativas: capacidade funcional e parâmetros de avaliação nutricional como IMC (p=0,004), e porcentagem de gordura (p=0,028), e também parâmetros clínicos como a dose de enzimas (p=0,022) e o número de evacuações por dia (p=0,024); associações: a inadequação do consumo de lipídios na dieta está associada com importantes sintomas gastrointestinais como a consistência amolecida das fezes (p=0,005) e flatulência (p=0,012) e ressalta a importância da orientação nutricional aos pacientes em reposição de enzimas pancreáticas. CONCLUSÃO: A maioria dos pacientes apresentou bons resultados de exames bioquímicos, qualidade de vida, consumo de macronutrientes, estado nutricional e sintomas gastrointestinais. Observaram-se importantes correlações e associações que demonstram que o estado nutricional, o consumo alimentar e a dose de enzimas interferem nos sintomas gastrointestinais e na auto-percepção de qualidade de vida dos pacientes. Sendo assim, o atual protocolo é válido, mas deve ser associado a orientação nutricional individualizada / BACKGROUND: After pancreatic surgery, exocrine function is determined by the extent of resection and the amount of remaining pancreatic tissue, and all patients should be evaluated for exocrine pancreatic insufficiency (EPI). Pancreatic enzyme replacement is the mainstay of EPI treatment, since it improves fat absorption, reduces symptoms related to malabsorption and improves quality of life (QoL). OBJECTIVE: Knowing that the adjustment of pancreatic enzymes dose is based on the clinical signs reported by the patient, the present study aims to deepen the clinical evaluation and to evaluate the current protocol of treatment, maintaining or improving patients quality of life. METHODS: A cross-sectional study in which adults were evaluated 6 months or more after pancreatic resection. At time 1, anthropometric evaluation and food recall, clinical evaluation of quality of life (SF-36 questionnaire), intestinal habits and laboratory tests were performed. At time 2 a new consultation was conducted to discuss the results and to provide individualized nutritional guidance. For the correlations analysis the Pearson test was used, for associations the Fisher test and for comparison of means the Mann-Whitney test. RESULTS: 39 patients were evaluated, 22 (56.4%) female; 33 (84.6%) >= 60 years; Time after surgery 14.1 ± 6.8 years; Biochemical tests: at all dosages most patients present results within the reference values, but there is a high prevalence of fat-soluble vitamins deficiency; The patients have good nutritional status since a great part presents eutrophy according to the BMI (46.1%) and according to the percentage of body fat (35.9%); In general they do not report adverse gastrointestinal symptoms: 61.5% with feces formed, 53.8% without abdominal pain, 84.6% without steatorrhea; Adequacy in macronutrient consumption: 51.3% adequate consumption of carbohydrates and lipids, and 64.1% excessive consumption of proteins; Positive correlations: enzyme dose correlates with pain (p = 0.004) and BMI (p = 0.009); that is, patients who report more pain and who weigh more are those who receive the highest doses of pancreatic enzymes; Negative correlations: functional capacity and nutritional assessment parameters such as BMI (p = 0.004), and body fat percentage (p = 0.028), as well as clinical parameters such as enzyme dose (p = 0.022) and number of bowel movements per day p=0.024); Associations: the dietary lipid consumption inadequacy is associated with important gastrointestinal symptoms such as soft stool consistency (p=0.005) and flatulence (p=0.012), and emphasizes the importance of nutritional guidance to patients on pancreatic enzyme replacement therapy. CONCLUSION: Most patients presented good results of biochemical tests, quality of life, macronutrient consumption, nutritional status and gastrointestinal symptoms. Significant correlations and associations have been observed that evidence that nutritional status, food intake and enzyme dose interferes with gastrointestinal symptoms and self-perceived quality of life of patients. Therefore, the current protocol is valid, but should be associated with individualized nutritional guidance

A Mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), é uma doença lisossômica de depósito ocasionada pela degradação deficiente dos glicosaminoglicanos (GAG) queratan sulfato e condroitin-6-sulfato devido à deficiência da enzima N-acetilgalactosamina 6-sulfatase. Como a fisiopatologia desta doença ainda não está totalmente elucidada e muitos estudos vêm demonstrando o envolvimento do estresse oxidativo e inflamação na patogênese de outros tipos de mucopolissacaridoses, o objetivo principal deste trabalho foi investigar os parâmetros de estresse oxidativo e mediadores inflamatórios em pacientes MPS IVA sob terapia de reposição enzimática (TRE). Foram analisadas amostras de urina e sangue de pacientes MPS IVA sob TRE (n=17) e controles saudáveis pareados por idade (n=10-14). Os pacientes apresentaram diminuição significativa nos níveis de defesas antioxidantes, medida através dos níveis de glutationa reduzida (GSH), e aumento da enzima superóxido dismutase (SOD) em eritrócitos. Em relação ao dano a biomoléculas, foi observado nos pacientes um aumento de lipoperoxidação (aumento dos níveis de isoprostanos urinários) e de dano oxidativo a proteínas (aumento dos níveis urinários de di-tirosina e diminuição dos grupamentos sulfidrila no plasma) comparativamente aos controles. Nossos resultados também mostraram que os pacientes MPS IVA sob TRE apresentaram maior dano ao DNA, sendo este dano de origem oxidativa e atingindo bases purínicas e pirimidínicas. Além disso, os pacientes apresentaram níveis significativamente aumentados de interleucina-6 e esta, por sua vez, apresentou correlação negativa com GSH, mostrando uma possível relação entre inflamação e estresse oxidativo nesta doença. Considerando que os níveis de GAG urinários ainda se encontravam elevados nos pacientes em comparação com o grupo controle, pode-se supor que os mesmos estejam, pelo menos em parte, correlacionados com os danos oxidativos encontrados nestes pacientes. Os dados encontrados no presente trabalho sugerem que pacientes MPS IVA sob TRE apresentam uma condição pró-inflamatória e oxidativa e que a suplementação com antioxidantes em combinação com a TRE deve ser investigada com o intuito de melhorar a qualidade de vida dos pacientes. Cabe ressaltar que este é o primeiro estudo em pacientes que relaciona MPS IVA com estresse oxidativo e inflamação. / The Mucopolysaccharidosis type IVA (MPS IVA) is a lysosomal storage disease caused by impaired degradation of keratan sulfate and chondroitin-6-sulfate glycosaminoglycans (GAG), due to a deficiency on the enzyme N-acetylgalactosamine-6-sulfatase. Since the pathophysiology of this disease is still not totally elucidated and many studies demonstrated the involvement of oxidative stress and inflammation in the pathogenesis of other mucopolysaccharidoses types, the principal objective of this study was to investigate oxidative stress parameters and inflammatory mediators in MPS IVA patients under enzyme replacement therapy (ERT). Urine anda blood samples of MPS IVA patients under ERT (n= 17) and healthy age-matched controls (n= 10-14) were evaluated. Patients presented a significant decrease in antioxidant defenses levels, assessed by reduced glutathione (GSH), and increased superoxide dismutase (SOD) activity in erythrocytes. With regard to the biomolecules damage, was observed that patients presented lipid peroxidation (increase of isoprostanes urinary levels) and protein damage (increase of di-tyrosine urinary levels and decrease of sulfhydryl groups in plasma), when compared to controls. Our results showed higher DNA damage levels in MPS IVA patients compared to control group, in both pyrimidines and purines bases. The pro-inflammatory cytokine interleukin 6 (IL-6) was significantly increased in patients and showed an inverse correlation with GSH levels, showing a possible link between inflammation and oxidative stress in MPS IVA disease. Considering that GAG urinary level were still high in ERT patients compared to the control group, we propose that GAG are, at least in part, related with oxidative damage found in MPS IVA patients. The data presented suggest that pro-inflammatory and pro-oxidant states occur in MPS IVA patients under ERT, and the supplementation of antioxidants in combination with ERT can be investigated with the purpose of improving the patient’s life quality. To the best of our knowledge, this is the first study in patients relating MPS IVA with oxidative stress and inflammation.

Introdução: As Mucopolissacaridoses (MPS) são doenças lisossômicas causadas pela deficiência de enzimas envolvidas na degradação dos glicoaminoglicanos. O acúmulo anormal dessa molécula compromete a função celular e orgânica, levando a um espectro de manifestações clínicas, de caráter multissistêmico e progressivo. Manifestações gastrointestinais, tais como episódios frequentes de fezes amolecidas e diarréia, têm sido frequentemente evidenciadas e relatadas por pacientes com MPS. Ainda que os sintomas gastrointestinais sejam frequentemente ofuscados pelos fenótipos neurológicos graves, eles podem afetar a qualidade de vida dos pacientes e de seus familiares. Objetivo: Avaliar as manifestações gastrointestinais em pacientes com MPS que estavam ou não recebendo Terapia de Reposição Enzimática (TRE). Adicionalmente, para melhor compreender o assunto, avaliamos a histologia da mucosa intestinal em camundongos com MPS I. Métodos: Estudo transversal com amostragem de conveniência. Foram incluídos no estudo pacientes com diagnóstico de qualquer tipo de MPS que estavam ou não em TRE. Os sujeitos foram avaliados através de inquérito alimentar, questionamentos quanto ao aparecimento de sintomas gastrointestinais e realização de uma série de exames bioquímicos. Adicionalmente, foram realizados testes de bioimpedância elétrica (para avaliação da composição corporal) e teste molecular para hipolactasia primária a partir de amostras de DNA dos pacientes, assim como análise da histologia da mucosa intestinal em um modelo de camundongo com MPS I. Resultados: Foram incluídos 27 pacientes com diferentes tipos de MPS, sendo 15 (55,6%) do sexo feminino e 12 (44,4%) do sexo masculino, com mediana de idade de 12 (1-28) anos. Os sintomas gastrointestinais mais prevalentes foram flatulência, distensão abdominal, dor abdominal e fezes amolecidas. Houve diferença significativa na prevalência de flatulência entre os tipos de MPS (p=0,004). A prevalência de flatulência e de distensão abdominal foi significativamente maior no grupo dos que não recebiam TRE, em comparação ao grupo dos que recebia TRE (p = 0,04 e 0,03, respectivamente). A maioria dos exames bioquímicos realizados para investigação e/ou exclusão de alguma patologia específica apresentaram resultados normais, sugerindo que o aparecimento de sintomas gastrointestinais nesses pacientes possa ser decorrente da própria MPS através de mecanismo fisiopatológico independente. A análise da histologia do intestino delgado de camundongos MPS I identificou células aumentadas de volume, sugerindo algum tipo de acúmulo intracelular. Em relação ao Teste Molecular para Hipolactasia, 58,8% dos pacientes apresentaram genótipo CC, o qual é compatível com intolerância à lactose. Os exames de Bioimpedância Elétrica sugerem que, os pacientes em TRE apresentam menor proporção de massa gorda (MG) em relação aos pacientes que não estavam em TRE. Conclusão: Este foi o primeiro estudo sobre manifestações gastrointestinais de pacientes brasileiros com MPS realizado em nosso meio. Inúmeros sinais e sintomas foram observados, com maior prevalência relativa nas MPS I, II, III e IV do que na MPS VI. O sintoma mais frequentemente relatado foi flatulência. Embora não tenha sido estatisticamente significativo a diferença, a proporção de pacientes com sintomas gastrointestinais foi menor nos pacientes que estavam em TRE. A Intolerância à lactose observada em maior proporção nos pacientes com MPS com manifestações gastrointestinais, a avaliação da composição corporal e as alterações observadas na mucosa intestinal do camundongo com MPS I devem ser levadas em consideração na interpretação dos resultados. Acreditamos que mais estudos, dirigidos para as manifestações gastrointestinais, devam ser realizados para comprovar esses achados e melhor compreender os mecanismos fisiopatológicos dos sintomas relacionados nos pacientes aferidos. / Introduction: The mucopolysaccharidoses (MPS) are lysosomal storage disorders characterized by a deficiency in enzymes involved in glycosaminoglycan degradation. Abnormal accumulation of this molecule compromises cellular and organic function, leading to a spectrum of progressive, multisystem clinical manifestations. Gastrointestinal manifestations, such as frequent episodes of loose stools and diarrhea, are often reported by patients with MPS. Although these gastrointestinal symptoms are often overshadowed by severe neurological phenotypes, they can have a negative impact on the quality of life of patients and their family members. Objective: To assess gastrointestinal manifestations in patients with MPS who were or not receiving enzyme replacement therapy (ERT). Furthermore, we sought to assess bowel mucosa histology in a mouse model of MPS I. Methods: Cross-sectional study with a convenience sampling strategy. The sample comprised patients with a diagnosis of MPS of any type and regardless of ERT status. Patients were assessed by means of a dietary recordatory and an interview focused on gastrointestinal symptoms, as well as a battery of biochemical tests. Bioelectrical Impedance was performed for body composition assessment.Patient DNA samples were also tested by molecular tests for primary lactase hypolactasia, and bowel mucosa specimens from MPS I mice underwent histological examination. Results: A total of 27 MPS patients were included, 15 (55.6%) female and 12 (44.4%) male, with a median age of 12 (1-28) years. The most prevalent gastrointestinal symptoms were flatulence, abdominal distension, abdominal pain, and loose stools. A significant difference in the prevalence of flatulence was observed among different MPS types (p=0.004). The prevalence of flatulence and abdominal distension was significantly higher in the non-ERT group than in the ERT group (p = 0.04 and 0.03 respectively). Most biochemical tests performed to work up and/or rule out specific conditions were within normal limits, which suggests that the development of gastrointestinal systems in these patients may be due to MPS itself through an independent pathophysiological mechanism. Histological analysis of smallbowel tissue from MPS I mice found increased cell volume indicative of some form of intracellular accumulation. On molecular testing for lactase deficiency, 58.8% of patients had the CC genotype, which is consistent with lactose intolerance. Bioelectrical Impedance analysis suggest that patients with TRE have lower proportion of fat mass (FM) compared to patients who were not on ERT. Conclusion: This was the first study to assess gastrointestinal manifestations in Brazilian patients with different MPS subtypes.Several signs and symptoms were observed with higher relative prevalence in MPS I, II, III and IV to that in MPS VI. The most frequently reported symptom was flatulence. Although was no statistical difference the proportion of patients with gastrointestinal symptoms was lower in patients on ERT.The lactose intolerance observed in a higher proportion of MPS patients with gastrointestinal manifestations, body composition assessment and observed changes in the bowel mucosa of MPS I mice should be taken into account when interpreting the results. Further studies focusing on the gastrointestinal manifestations of MPS are warranted to corroborate our findings and provide a better understanding of the pathophysiological mechanisms associated with these symptoms in affected patients.

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There is an unmet medical need in the treatment of gout. This type of inflammatory arthritis can be efficiently alleviated by the enzyme uricase. This enzyme breaks down uric acid, the causative agent of gout, so it can be flushed from the body. In humans and the other great apes, uricase is a pseudogene and as such is inactive. Research on therapeutic uricases has focused on using enzymes from naturally occurring sources; however, these foreign proteins can be very antigenic and present a potentially life-threatening safety risk to patients. We address the challenges of developing a safer uricase therapeutic by exploiting evidence that, while inactive, the human pseudogene is expressed in the human body and may be recognized as self by the immune system. To develop a ﾓhuman-likeﾔ? uricase we apply the hybrid computational and experimental approach of Ancestral Sequence Reconstruction to search functional sequence space of uricase proteins to engineer an enzyme with high sequence identity to the human pseudogene, and possessing therapeutic levels of activity for the breakdown of uric acid. This dissertation describes the development and characterization of several uricase leads. The most active ancestral uricase possesses both enhanced in vitro and in vivo stability (in healthy rats) when assayed head-to-head Pegloticase, the only FDA approved uricase for the treatment of gout.

A Mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), é uma doença lisossômica de depósito ocasionada pela degradação deficiente dos glicosaminoglicanos (GAG) queratan sulfato e condroitin-6-sulfato devido à deficiência da enzima N-acetilgalactosamina 6-sulfatase. Como a fisiopatologia desta doença ainda não está totalmente elucidada e muitos estudos vêm demonstrando o envolvimento do estresse oxidativo e inflamação na patogênese de outros tipos de mucopolissacaridoses, o objetivo principal deste trabalho foi investigar os parâmetros de estresse oxidativo e mediadores inflamatórios em pacientes MPS IVA sob terapia de reposição enzimática (TRE). Foram analisadas amostras de urina e sangue de pacientes MPS IVA sob TRE (n=17) e controles saudáveis pareados por idade (n=10-14). Os pacientes apresentaram diminuição significativa nos níveis de defesas antioxidantes, medida através dos níveis de glutationa reduzida (GSH), e aumento da enzima superóxido dismutase (SOD) em eritrócitos. Em relação ao dano a biomoléculas, foi observado nos pacientes um aumento de lipoperoxidação (aumento dos níveis de isoprostanos urinários) e de dano oxidativo a proteínas (aumento dos níveis urinários de di-tirosina e diminuição dos grupamentos sulfidrila no plasma) comparativamente aos controles. Nossos resultados também mostraram que os pacientes MPS IVA sob TRE apresentaram maior dano ao DNA, sendo este dano de origem oxidativa e atingindo bases purínicas e pirimidínicas. Além disso, os pacientes apresentaram níveis significativamente aumentados de interleucina-6 e esta, por sua vez, apresentou correlação negativa com GSH, mostrando uma possível relação entre inflamação e estresse oxidativo nesta doença. Considerando que os níveis de GAG urinários ainda se encontravam elevados nos pacientes em comparação com o grupo controle, pode-se supor que os mesmos estejam, pelo menos em parte, correlacionados com os danos oxidativos encontrados nestes pacientes. Os dados encontrados no presente trabalho sugerem que pacientes MPS IVA sob TRE apresentam uma condição pró-inflamatória e oxidativa e que a suplementação com antioxidantes em combinação com a TRE deve ser investigada com o intuito de melhorar a qualidade de vida dos pacientes. Cabe ressaltar que este é o primeiro estudo em pacientes que relaciona MPS IVA com estresse oxidativo e inflamação. / The Mucopolysaccharidosis type IVA (MPS IVA) is a lysosomal storage disease caused by impaired degradation of keratan sulfate and chondroitin-6-sulfate glycosaminoglycans (GAG), due to a deficiency on the enzyme N-acetylgalactosamine-6-sulfatase. Since the pathophysiology of this disease is still not totally elucidated and many studies demonstrated the involvement of oxidative stress and inflammation in the pathogenesis of other mucopolysaccharidoses types, the principal objective of this study was to investigate oxidative stress parameters and inflammatory mediators in MPS IVA patients under enzyme replacement therapy (ERT). Urine anda blood samples of MPS IVA patients under ERT (n= 17) and healthy age-matched controls (n= 10-14) were evaluated. Patients presented a significant decrease in antioxidant defenses levels, assessed by reduced glutathione (GSH), and increased superoxide dismutase (SOD) activity in erythrocytes. With regard to the biomolecules damage, was observed that patients presented lipid peroxidation (increase of isoprostanes urinary levels) and protein damage (increase of di-tyrosine urinary levels and decrease of sulfhydryl groups in plasma), when compared to controls. Our results showed higher DNA damage levels in MPS IVA patients compared to control group, in both pyrimidines and purines bases. The pro-inflammatory cytokine interleukin 6 (IL-6) was significantly increased in patients and showed an inverse correlation with GSH levels, showing a possible link between inflammation and oxidative stress in MPS IVA disease. Considering that GAG urinary level were still high in ERT patients compared to the control group, we propose that GAG are, at least in part, related with oxidative damage found in MPS IVA patients. The data presented suggest that pro-inflammatory and pro-oxidant states occur in MPS IVA patients under ERT, and the supplementation of antioxidants in combination with ERT can be investigated with the purpose of improving the patient’s life quality. To the best of our knowledge, this is the first study in patients relating MPS IVA with oxidative stress and inflammation.

A Mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), é uma doença lisossômica de depósito ocasionada pela degradação deficiente dos glicosaminoglicanos (GAG) queratan sulfato e condroitin-6-sulfato devido à deficiência da enzima N-acetilgalactosamina 6-sulfatase. Como a fisiopatologia desta doença ainda não está totalmente elucidada e muitos estudos vêm demonstrando o envolvimento do estresse oxidativo e inflamação na patogênese de outros tipos de mucopolissacaridoses, o objetivo principal deste trabalho foi investigar os parâmetros de estresse oxidativo e mediadores inflamatórios em pacientes MPS IVA sob terapia de reposição enzimática (TRE). Foram analisadas amostras de urina e sangue de pacientes MPS IVA sob TRE (n=17) e controles saudáveis pareados por idade (n=10-14). Os pacientes apresentaram diminuição significativa nos níveis de defesas antioxidantes, medida através dos níveis de glutationa reduzida (GSH), e aumento da enzima superóxido dismutase (SOD) em eritrócitos. Em relação ao dano a biomoléculas, foi observado nos pacientes um aumento de lipoperoxidação (aumento dos níveis de isoprostanos urinários) e de dano oxidativo a proteínas (aumento dos níveis urinários de di-tirosina e diminuição dos grupamentos sulfidrila no plasma) comparativamente aos controles. Nossos resultados também mostraram que os pacientes MPS IVA sob TRE apresentaram maior dano ao DNA, sendo este dano de origem oxidativa e atingindo bases purínicas e pirimidínicas. Além disso, os pacientes apresentaram níveis significativamente aumentados de interleucina-6 e esta, por sua vez, apresentou correlação negativa com GSH, mostrando uma possível relação entre inflamação e estresse oxidativo nesta doença. Considerando que os níveis de GAG urinários ainda se encontravam elevados nos pacientes em comparação com o grupo controle, pode-se supor que os mesmos estejam, pelo menos em parte, correlacionados com os danos oxidativos encontrados nestes pacientes. Os dados encontrados no presente trabalho sugerem que pacientes MPS IVA sob TRE apresentam uma condição pró-inflamatória e oxidativa e que a suplementação com antioxidantes em combinação com a TRE deve ser investigada com o intuito de melhorar a qualidade de vida dos pacientes. Cabe ressaltar que este é o primeiro estudo em pacientes que relaciona MPS IVA com estresse oxidativo e inflamação. / The Mucopolysaccharidosis type IVA (MPS IVA) is a lysosomal storage disease caused by impaired degradation of keratan sulfate and chondroitin-6-sulfate glycosaminoglycans (GAG), due to a deficiency on the enzyme N-acetylgalactosamine-6-sulfatase. Since the pathophysiology of this disease is still not totally elucidated and many studies demonstrated the involvement of oxidative stress and inflammation in the pathogenesis of other mucopolysaccharidoses types, the principal objective of this study was to investigate oxidative stress parameters and inflammatory mediators in MPS IVA patients under enzyme replacement therapy (ERT). Urine anda blood samples of MPS IVA patients under ERT (n= 17) and healthy age-matched controls (n= 10-14) were evaluated. Patients presented a significant decrease in antioxidant defenses levels, assessed by reduced glutathione (GSH), and increased superoxide dismutase (SOD) activity in erythrocytes. With regard to the biomolecules damage, was observed that patients presented lipid peroxidation (increase of isoprostanes urinary levels) and protein damage (increase of di-tyrosine urinary levels and decrease of sulfhydryl groups in plasma), when compared to controls. Our results showed higher DNA damage levels in MPS IVA patients compared to control group, in both pyrimidines and purines bases. The pro-inflammatory cytokine interleukin 6 (IL-6) was significantly increased in patients and showed an inverse correlation with GSH levels, showing a possible link between inflammation and oxidative stress in MPS IVA disease. Considering that GAG urinary level were still high in ERT patients compared to the control group, we propose that GAG are, at least in part, related with oxidative damage found in MPS IVA patients. The data presented suggest that pro-inflammatory and pro-oxidant states occur in MPS IVA patients under ERT, and the supplementation of antioxidants in combination with ERT can be investigated with the purpose of improving the patient’s life quality. To the best of our knowledge, this is the first study in patients relating MPS IVA with oxidative stress and inflammation.

Introdução: As Mucopolissacaridoses (MPS) são doenças lisossômicas causadas pela deficiência de enzimas envolvidas na degradação dos glicoaminoglicanos. O acúmulo anormal dessa molécula compromete a função celular e orgânica, levando a um espectro de manifestações clínicas, de caráter multissistêmico e progressivo. Manifestações gastrointestinais, tais como episódios frequentes de fezes amolecidas e diarréia, têm sido frequentemente evidenciadas e relatadas por pacientes com MPS. Ainda que os sintomas gastrointestinais sejam frequentemente ofuscados pelos fenótipos neurológicos graves, eles podem afetar a qualidade de vida dos pacientes e de seus familiares. Objetivo: Avaliar as manifestações gastrointestinais em pacientes com MPS que estavam ou não recebendo Terapia de Reposição Enzimática (TRE). Adicionalmente, para melhor compreender o assunto, avaliamos a histologia da mucosa intestinal em camundongos com MPS I. Métodos: Estudo transversal com amostragem de conveniência. Foram incluídos no estudo pacientes com diagnóstico de qualquer tipo de MPS que estavam ou não em TRE. Os sujeitos foram avaliados através de inquérito alimentar, questionamentos quanto ao aparecimento de sintomas gastrointestinais e realização de uma série de exames bioquímicos. Adicionalmente, foram realizados testes de bioimpedância elétrica (para avaliação da composição corporal) e teste molecular para hipolactasia primária a partir de amostras de DNA dos pacientes, assim como análise da histologia da mucosa intestinal em um modelo de camundongo com MPS I. Resultados: Foram incluídos 27 pacientes com diferentes tipos de MPS, sendo 15 (55,6%) do sexo feminino e 12 (44,4%) do sexo masculino, com mediana de idade de 12 (1-28) anos. Os sintomas gastrointestinais mais prevalentes foram flatulência, distensão abdominal, dor abdominal e fezes amolecidas. Houve diferença significativa na prevalência de flatulência entre os tipos de MPS (p=0,004). A prevalência de flatulência e de distensão abdominal foi significativamente maior no grupo dos que não recebiam TRE, em comparação ao grupo dos que recebia TRE (p = 0,04 e 0,03, respectivamente). A maioria dos exames bioquímicos realizados para investigação e/ou exclusão de alguma patologia específica apresentaram resultados normais, sugerindo que o aparecimento de sintomas gastrointestinais nesses pacientes possa ser decorrente da própria MPS através de mecanismo fisiopatológico independente. A análise da histologia do intestino delgado de camundongos MPS I identificou células aumentadas de volume, sugerindo algum tipo de acúmulo intracelular. Em relação ao Teste Molecular para Hipolactasia, 58,8% dos pacientes apresentaram genótipo CC, o qual é compatível com intolerância à lactose. Os exames de Bioimpedância Elétrica sugerem que, os pacientes em TRE apresentam menor proporção de massa gorda (MG) em relação aos pacientes que não estavam em TRE. Conclusão: Este foi o primeiro estudo sobre manifestações gastrointestinais de pacientes brasileiros com MPS realizado em nosso meio. Inúmeros sinais e sintomas foram observados, com maior prevalência relativa nas MPS I, II, III e IV do que na MPS VI. O sintoma mais frequentemente relatado foi flatulência. Embora não tenha sido estatisticamente significativo a diferença, a proporção de pacientes com sintomas gastrointestinais foi menor nos pacientes que estavam em TRE. A Intolerância à lactose observada em maior proporção nos pacientes com MPS com manifestações gastrointestinais, a avaliação da composição corporal e as alterações observadas na mucosa intestinal do camundongo com MPS I devem ser levadas em consideração na interpretação dos resultados. Acreditamos que mais estudos, dirigidos para as manifestações gastrointestinais, devam ser realizados para comprovar esses achados e melhor compreender os mecanismos fisiopatológicos dos sintomas relacionados nos pacientes aferidos. / Introduction: The mucopolysaccharidoses (MPS) are lysosomal storage disorders characterized by a deficiency in enzymes involved in glycosaminoglycan degradation. Abnormal accumulation of this molecule compromises cellular and organic function, leading to a spectrum of progressive, multisystem clinical manifestations. Gastrointestinal manifestations, such as frequent episodes of loose stools and diarrhea, are often reported by patients with MPS. Although these gastrointestinal symptoms are often overshadowed by severe neurological phenotypes, they can have a negative impact on the quality of life of patients and their family members. Objective: To assess gastrointestinal manifestations in patients with MPS who were or not receiving enzyme replacement therapy (ERT). Furthermore, we sought to assess bowel mucosa histology in a mouse model of MPS I. Methods: Cross-sectional study with a convenience sampling strategy. The sample comprised patients with a diagnosis of MPS of any type and regardless of ERT status. Patients were assessed by means of a dietary recordatory and an interview focused on gastrointestinal symptoms, as well as a battery of biochemical tests. Bioelectrical Impedance was performed for body composition assessment.Patient DNA samples were also tested by molecular tests for primary lactase hypolactasia, and bowel mucosa specimens from MPS I mice underwent histological examination. Results: A total of 27 MPS patients were included, 15 (55.6%) female and 12 (44.4%) male, with a median age of 12 (1-28) years. The most prevalent gastrointestinal symptoms were flatulence, abdominal distension, abdominal pain, and loose stools. A significant difference in the prevalence of flatulence was observed among different MPS types (p=0.004). The prevalence of flatulence and abdominal distension was significantly higher in the non-ERT group than in the ERT group (p = 0.04 and 0.03 respectively). Most biochemical tests performed to work up and/or rule out specific conditions were within normal limits, which suggests that the development of gastrointestinal systems in these patients may be due to MPS itself through an independent pathophysiological mechanism. Histological analysis of smallbowel tissue from MPS I mice found increased cell volume indicative of some form of intracellular accumulation. On molecular testing for lactase deficiency, 58.8% of patients had the CC genotype, which is consistent with lactose intolerance. Bioelectrical Impedance analysis suggest that patients with TRE have lower proportion of fat mass (FM) compared to patients who were not on ERT. Conclusion: This was the first study to assess gastrointestinal manifestations in Brazilian patients with different MPS subtypes.Several signs and symptoms were observed with higher relative prevalence in MPS I, II, III and IV to that in MPS VI. The most frequently reported symptom was flatulence. Although was no statistical difference the proportion of patients with gastrointestinal symptoms was lower in patients on ERT.The lactose intolerance observed in a higher proportion of MPS patients with gastrointestinal manifestations, body composition assessment and observed changes in the bowel mucosa of MPS I mice should be taken into account when interpreting the results. Further studies focusing on the gastrointestinal manifestations of MPS are warranted to corroborate our findings and provide a better understanding of the pathophysiological mechanisms associated with these symptoms in affected patients.