Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA168.pdf: 311594 bytes, checksum: e09666d73e41b74adb26b60363213c88 (MD5) Previous issue date: 2015-04-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Condensed tannins can reduces the ruminal degradation of protein, increasing N-duodenal flow and improving animal performance with lower environmental impacts. The aim of this work was to assess if the supplementation with condensed tannins (CT) extracted from black wattle (Acacia mearnsii) could reduce the N urinary excretion and improve milk yield and milk composition of dairy ewes. The treatments fed were two protein levels (16.4 and 22.3% of crude protein) with or without CT extract (0 and 8 g/kg fresh). Eight Texel × Lacaune lactating ewes at mid lactation was assigned in a Latin square 4×4 with four periods of 19 days, 14 for adaptation and a five days measurement period. The N urinary excretion increased in animals receiving high-protein level diet compared with lowprotein level diet and decreased with extract supplementation. However, milk yield and milk solids yield were similar between treatments. The CT extract supplementation was not able to improve animal performance, but reduce the N urinary excretion and environmental impact / Os taninos condensados podem reduzir a degradação proteica no rúmen, aumentando o fluxo duodenal de proteína metabolizável com melhorias no desempenho animal e redução do impacto ambiental. Objetivou-se avaliar o efeito do extrato tanífero de acácia negra (Acacia mearnsii) em ovelhas lactantes recebendo ração totalmente misturada (RTM) com dois níveis de proteína bruta. Os tratamentos experimentais constituíramse de RTM com 16,4 e 22,3% de PB na MS, com ou sem a adição de extrato tanífero de Acacia mearnsii na proporção de 8 g/kg na matéria natural. A quantidade de extrato foi calculada para permitir a ingestão de aproximadamente 15 g/animal/dia. Foram utilizadas oito ovelhas cruza da raça Texel × Lacaune no terço médio de lactação distribuídas num delineamento experimental em Quadrado latino 4 × 4, com quatro períodos de 19 dias, sendo 14 de adaptação e cinco de coleta. A excreção urinária de N aumentou nos animais recebendo a dieta com maior nível de proteína em comparação aos que receberam a dieta com menor nível de proteína. Entretanto, a produção de leite e de sólidos não variou entre tratamentos. A suplementação com extrato tanífero de Acacia mearnsii não foi suficiente para melhorar o desempenho animal, mas reduziu a excreção urinária de N e o impacto ambiental

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-30Bitstream added on 2014-06-13T18:58:50Z : No. of bitstreams: 1 fruhvald_e_me_botfmvz.pdf: 332018 bytes, checksum: e9ea4cd232ff2adc94ec7372c75727e1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As aves da família Psittacidae são muito visadas pelo tráfico de animais selvagens. O papagaio-verdadeiro (Amazona aestiva) é uma das espécies mais traficadas. Os animais provenientes do tráfico são transportados em espaço restrito, sem alimento ou água e as aves adoecem ou morrem devido ao estresse ou brigas, antes mesmo de chegarem ao consumidor final. O estresse leva a secreção de glicocorticoides que possui diversas funções nos vertebrados além de sofrerem flutuações dos seus níveis basais para preparar o organismo para o início das atividades diárias. Fatores ambientais e necessidades fisiológicas interagem para a manutenção do relógio biológico, que é responsável por determinar essas alterações endócrinas. As análises hormonais através de técnicas não-invasivas têm sido usadas em estudos da biologia da conservação, comportamentais e fisiológicos em aves cativas ou de vida livre devido a sua facilidade de coleta e por não causarem prejuízos ao indivíduo. Os níveis de metabólitos de glicocorticoides presentes nas excretas refletem as concentrações plasmáticas desses hormônios. Com objetivo de determinar o perfil de excreção urofecal de metabólitos de glicocorticoides nos excrementos de A. aestiva, ao longo do dia e relacionar esses achados com as atividades diária desses animais, foram utilizados 22 animais (12 machos e 10 fêmeas) alojados em gaiolas individuais, e suas excretas foram colhidas a cada três horas, por 24 horas consecutivas. Foi observado um pico nas concentrações de metabólitos de glicocorticóides nas primeiras horas do dia, quando também se inicia as atividades diárias das aves; e as concentrações diminuíram gradualmente até atingirem seus níveis basais no final da tarde e se mantiveram baixos até a manhã seguinte / The birds of the Psittacidae family are highly targeted for wildlife trafficking. The Blue-fronted parrot (Amazona aestiva) is one of the most trafficked species. The animals are transported in restricted spaces, without food or water and the birds get sick or die due to stress or fights, before arriving to the final consumer. Stress leads to secretion of glucocorticoids that has several functions in vertebrates and suffer fluctuations of baseline levels to prepare the organism for the start of daily activities. Physiological and environmental factors interact to maintain the biological clock, which is responsible for determining these endocrine changes. The hormonal assays employing non-invasive techniques have been used in studies of conservation biology, behavioral and physiological studies of captive or free-living birds because of the ease of collection and lack of harm to the individual. Levels of glucocorticoid metabolites in feces reflect plasma concentrations of these hormones. In order to define the profile of excretion of glucocorticoids metabolites in A. aestiva droppings throughout the day and correlate these findings with the daily activities of these animals, we used 22 animals (12 males and 10 females) housed individually in cages, and their droppings were collected every three hours for 24 consecutive hours. A peak in the concentration of glucocorticoids metabolites was observed in the first hours of the day at the start of the birds’ daily activities, and the concentrations decreased gradually to basal levels in the late afternoon and remained low until the next morning

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da suplementação de Zn (na forma de ZnO nanoparticulado) em dietas para leitões recém-desmamados sobre o desempenho, a ocorrência de diarreia, a digestibilidade dos nutrientes, a excreção de Zn nas fezes, os parâmetros sanguíneos, a histologia do epitélio intestinal, a morfometria de órgãos e a contagem bacteriana no conteúdo intestinal em comparação ao uso de dose farmacológica de Zn (na forma de ZnO). Foram utilizados 192 leitões desmamados aos 21 dias, em um experimento em blocos casualizados, com 6 tratamentos, 8 repetições (blocos) e 4 animais por unidade experimental (baia). Os tratamentos foram: controle negativo - dieta basal com 100 mg de Zn/kg de ração (na forma de ZnO); controle positivo - dieta basal com 2400 mg de Zn/kg de ração (na forma de ZnO), e dieta basal com 12, 24, 48 ou 96 mg de Zn/kg de ração (na forma de ZnO-N). Os leitões foram alimentados com as dietas experimentais, durante os primeiros 21 dias de experimento. Dos 22 aos 35 dias, todos os animais foram alimentados com uma única dieta, com níveis basais de Zn. A ocorrência de diarreia foi registrada diariamente. Amostras de fezes foram coletadas para determinação da digestibilidade dos nutrientes da dieta e quantificação do Zn excretado. Amostras de sangue foram coletadas no 19° dia do experimento para análise dos parâmetros sanguíneos. No 21º dia, um animal de cada baia foi abatido para a realização da morfometria dos órgãos, histologia do epitélio intestinal e contagem bacteriana. Os dados foram submetidos à análise de variância e à regressão polinomial. Contrastes ortogonais foram utilizados para comparar o tratamento controle positivo com cada um dos níveis de Zn (na forma de ZnO-N). Não foram observados efeitos dos níveis de Zn (ZnO-N) sobre o desempenho, a excreção de Zn nas fezes, o hemograma, a morfometria de órgãos, a histologia do epitélio intestinal e a contagem bacteriana no conteúdo intestinal. O aumento dos níveis de Zn (ZnO-N) aumentou linearmente a digestibilidade aparente dos nutrientes da dieta. Foi observado efeito quadrático dos níveis de Zn (ZnO-N) sobre a frequência da ocorrência de diarreia entre os dias 1 e 7 e sobre a concentração plasmática de Zn. No período de 1 a 21 dias foi observado um menor consumo diário de ração para os níveis de Zn (ZnO-N) em comparação ao controle positivo. Não foram observados diferenças entre o controle positivo e os níveis de Zn (ZnO-N) para as variáveis de desempenho e a frequência da ocorrência de diarreia durante o período de 21 a 35 dias. Foi observada uma menor excreção de Zn nas fezes, e uma menor concentração plasmática de Zn para os níveis de Zn (ZnO-N) em comparação ao controle positivo. A suplementação de Zn, na forma de ZnO-N, não foi capaz de substituir a dose farmacológica de Zn (ZnO) no controle da diarreia após o desmame. Os níveis de Zn, na forma de ZnO-N, não ocasionaram toxicidade nos animais e propiciaram uma redução na excreção de Zn nas fezes. / The purpose of this study was to evaluate the effects of dietary Zn (as ZnO nanoparticles) on performance, diarrhea occurrence, nutrient digestibility, Zn excretion in the feces, blood parameters, histology of gut epithelium, organs morphometry and intestinal bacterial count of weanling pigs compared to the use of pharmacological doses of Zn (as ZnO). One hundred and ninety-two 21d-weaned pigs (5.90±0.83 kg BW) were used in a randomized complete block design experiment with 6 treatments, 8 replications per treatment, and 4 animals per experimental unit (pen). The treatments were: negative control (NC): basal diet (based on corn, soybean meal, dried whey and dried plasma) with 100 mg Zn (as ZnO)/kg diet; positive control (PC): basal diet with 2,400 mg Zn(as conventional ZnO, 150nm)/kg diet and basal diet with 12, 24, 48 or 96 mg Zn (as ZnO-N, 70nm)/kg diet. Pigs were fed dietary treatments from 1 to 21 d feeding period followed by a common diet (same diet for all treatments) from 22 to 35 d feeding period. Diarrhea occurrence was recorded daily. Feces samples were collected to determine the digestibility of the diet and to quantify the Zn excreted. Blood samples were collected on the 19th day of the experiment for analysis of blood parameters. On the 21th day one pig per pen was slaughtered for the analyses of organs morphometry, intestinal epithelium histology and bacterial count. ANOVA and polynomial regression analysis (for levels of Zn as ZnO-N) were performed. Orthogonal contrasts were used to compare positive control with each level of Zn (as ZnO-N). No effects of Zn levels (as ZnO-N) were observed on performance, Zn excretion on feces, blood count, organs morphometry, intestinal epithelium histology and intestinal bacterial count. Increased levels of Zn (as ZnO-N) linearly increased the apparent digestibility of nutrients. It was observed a quadratic effect of Zn levels (as ZnO-N) on the frequency of diarrhea occurrence between 1 and 7 d and on the Zn plasma concentration. From 1 to 21 d of experimental period, lower daily feed intake for Zn levels (as ZnO-N) was observed compared to positive control. No differences were observed among the positive control and levels of Zn (as ZnO-N) for performance and diarrhea occurrence during the period 21 to 35 d. Lower Zn excretion in feces and lower Zn plasma concentration were observed for Zn levels (as ZnO-N) compared to the positive control. Zn supplementation, as ZnO-N, could not to replace the pharmacological dose of Zn (ZnO) to control diarrhea after weaning. The levels of Zn, as ZnO-N, did not cause toxicity of weanling pigs and reduced Zn excretion in the feces.

Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2008. / Submitted by Cristiane Silva (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2012-07-10T01:17:13Z No. of bitstreams: 1 cristina.pdf: 271225 bytes, checksum: 628c0fc9b0dce68e19ce8e7d60297c5e (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-11-06T17:04:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cristina.pdf: 271225 bytes, checksum: 628c0fc9b0dce68e19ce8e7d60297c5e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-06T17:04:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cristina.pdf: 271225 bytes, checksum: 628c0fc9b0dce68e19ce8e7d60297c5e (MD5) Previous issue date: 2008 / A alimentação é um dos principais custos da piscicultura, sendo importante desenvolver estudos que busquem uma maior eficiência alimentar para o aumento do sucesso da atividade e também para a redução do impacto da emissão de nutritientes ao meio ambiente. Levando em conta o potencial de criação da tainha Mugil platanus na região Sudeste e Sul do Brasil e a carência de informações sobre suas exigências nutricionais, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de determinar a exigência protéica para seus juvenis. As tainhas foram alimentadas com cinco dietas com três repetições cada, sendo cada unidade composta por um tanque de 50L com 50 juvenis com peso inicial 1,17 ± 0,02 g e 4,34 ± 0,03 cm (média ± EP). As cinco dietas isocalóricas foram formuladas para conter níveis crescentes de proteína bruta (PB) de 30% , 35%, 40%, 45% e 49% e 18,7 MJ/Kg de dieta (energia metabolizável). As dietas foram oferecidas até a saciedade 5 vezes ao dia durante 35 dias. As dietas não apresentaram diferenças significativas (P>0,05) para sobrevivência, eficiência alimentar e composição corporal.Os resultados indicaram que o nível de 35% PB foi statisticamente superior (P > 0,05) com relação ao ganho em peso, ingestão de alimento e taxa de crescimento específico do que de tainhas alimentas com o maior nível protéico. A necessidade de proteína para os juvenis de tainha foi estimada em 35,8% PB. / Feed is one of the main costs for fish culture. Studies looking for higher feed efficiency are important to increase the success of aquaculture and reduce impacts of nutrient emission into the environment. Considering the potential of the mullet Mugil platanus for aquaculture, as well as the lack of information on its nutritional demands, the main goal of the present work was to determine the dietary protein requirement of juvenile mullets. Five isocaloric diets were formulated in order to contain increasing levels (30, 35, 40, 45,and 50%) of crude protein (CP) corresponding to 18.7 MJ metabolizable energy/Kg. All diets were tested in triplicate. Each experimental unit was composed of a 50 L tank with 50 juveniles (mean ± SE initial weight and length equal to 1.17 ± 0.02 g and 4.34 ± 0.03cm, respectively). Diets were offered five times a day until apparent satiation for 35 days. No significant difference (P > 0.05) was observed in survival rate, feed efficiency and body composition between treatments. However, weight increase, feed ingestion and specific growth rate was higher in fish fed the 35% CP level than those fed the highest protein content diet (50% CP). The amount of postprandial ammonia excreted by mullet was linearly related to protein intake. Intestinal tryptic activity was inversely proportional to the percentage of dietary CP. The dietary protein requirement of juvenile mullet was estimated as 34.28% CP with a P:E ratio of 18.7 g/MJ.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-09T12:55:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9379467 bytes, checksum: 3d00842f5ce615ad92103a3787053deb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-09T12:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9379467 bytes, checksum: 3d00842f5ce615ad92103a3787053deb (MD5) Previous issue date: 2018-06-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho foi desenvolvido com os objetivos de avaliar a excreção de creatinina para validação da coleta spot de urina, bem como as excreções de derivados de purinas (DP) e compostos nitrogenados (CN) e suas relações com a creatinina em novilhas Nelore suplementadas a pasto (Capítulo 1); objetivou-se também avaliar a recuperação da creatinina em função do tempo e de diferentes temperaturas de armazenamento (Capítulo 2). O experimento referente ao Capítulo 1, foi conduzido no setor de gado de corte da Universidade Federal de Viçosa/MG, utilizando-se cinco novilhas Nelore com peso corporal (PC) médio de 400 ± 15kg, distribuídas em quadrado latino 5x5. Os cinco tratamentos experimentais se basearam na suplementação proteico-energética (concentrado com 22% de proteína bruta na matéria seca (MS), fornecido às12h), baseada no PC (0, 3, 6, 9 e 12 g/kg PC (PC0, PC3, PC6, PC9 e PC12, respectivamente)). Os animais receberam sal mineral ad libitum. Cada período experimental teve duração de 16 dias, sendo 12 de adaptação à dieta e quatro de coleta. A coleta total de urina e amostral de fezes, foi realizada em três dias, nos horários das 0h00-4h00, 4h00-8h00, 8h00-12h00, 12h00-16h00, 16h00-20h00 e 20h00-24h00. A coleta de spot de urina, foi realizada a cada 4 horas, assim como as coletas de líquido ruminal e sangue nos horários das 0, 4, 8, 12, 16, 20 horas. Para a coleta total de urina, utilizou-se sonda de Folley no26, acoplada a mangueira de polietileno que conduziu a urina até uma bolsa coletora de urina por sistema fechado, que foi esvaziada a cada quatro horas. A amostragem da urina coletada foi realizada a cada 4 horas, nos mesmos horários descritos para a coleta de sangue, medindo- se o volume e retirando-se duas amostras, uma diluída com solução H2SO4 0,036N e outra não diluída. Para determinação da excreção fecal, utilizou-se o dióxido de titânio, fornecido na quantidade total diária de 15g, entre os dias 8o e 16o de cada período. Para estimativa do consumo de pasto, utilizou-se a fibra indigestível em detergente neutro (FDNi) como indicador interno. Realizou-se coleta de pasto pela técnica do quadrado para determinação da MS potencialmente digestível (MSpd) no terceiro dia de cada período experimental. Nos dias 13o e 16o de cada período, realizou-se simulação de pastejo para estimar a composição do pasto ingerido. Nas amostras de urina foram determinadas as concentrações de creatinina, nitrogênio total urinário (NU), ureia (NUreia), ácido úrico (AU) e alantoína (AL). Para análise estatística utilizou-se o programa estatístico Proc Mixed do SAS 9.4. A avaliação da adequação da melhor forma de coleta de urina foi realizada utilizando a raiz quadrada do quadrado médio do erro da predição (QMEP) entre as amostras de urina obtidas por meio da coleta spot. O experimento, referente ao Capítulo 2, foi realizado no Departamento de Zootecnia da UFV. Foram utilizadas urina de vinte e cinco animais, dez provenientes da raça Nelore e quinze da raça Holandesa. As urinas (10 de Nelore e 10 de Holandês) foram diluídas em solução de H2SO4 0,036N, fracionadas e conservadas em temperatura ambiente, resfriadas (4oC) e congeladas (-20oC e a -40oC), analisadas em diferentes dias após a coleta (1, 3, 7, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 dias). Imediatamente após a coleta, a urina foi diluída e seu pH corrigido para valor inferior a 3, e a urina foi analisada, dando origem ao valor de creatinina, resultado utilizado como valor de referência da concentração de creatinina na amostra. Este valor referência, foi utilizado como divisor dos valores de creatinina obtidos nos dias da análise, por amostra, obtendo-se o valor de creatinina relativa, o que permite a observação do aumento ou diminuição da concentração de creatinina ao longo do tempo. Para avaliar a conversão de creatina em creatinina na urina de bovinos, utilizou-se urina proveniente de cinco bovinos da raça Holandesa. Estas urinas também foram diluídas e tiveram seu pH corrigido para valor inferior a 3. Para avaliar o efeito da adição de creatina na urina, adicionou-se solução de creatina (concentrações de 20, 40 e 60 mg/dL) nos eppendorf contendo urina diluída. Estas urinas foram analisadas em diferentes dias após a coleta (1, 3, 7, 15, 30 e 45 dias), sendo armazenadas nas mesmas temperaturas descritas anteriormente. No capítulo 1 observou-se efeito linear positivo (P=0,001) sobre o consumo de MS total devido ao aumento nas quantidades de suplemento fornecido aos animais, porém observou-se efeito quadrático (P=0,018) sobre a ingestão de MS proveniente do pasto. A ingestão de N diferiu entre os tratamentos (P<0,05), causado pelo aumentou na ingestão de suplemento, o que possibilitou aumento (P=0,001) na ingestão de CN. O fornecimento de suplementação possibilitou efeito sobre a concentração de N amoniacal ruminal (P<0,05). A concentração de N uréico no soro (NUS) foi afetada (P<0,05) pelo fornecimento de concentrado no período de 24 horas, porém o tratamento PC0 não apresentou variação na concentração de NUS (P>0,05), em função da ausência de suplementação. A excreção de creatinina diária foi de 23,01 ± 0,19 (22,82 – 23,2) mg/kgPC. As excreções de AL, AU e DP, em mmol, foram influenciadas linearmente pelos tratamentos (P=0,002; P=0,004; P=0,003, respectivamente). A síntese de nitrogênio microbiano (NM) foi influenciada, assim como as excreções de DP, linearmente (P=0,001) pelos tratamentos. As relações entre AL, AU e DP com a creatinina, não foram influenciadas pelos dias de coleta, períodos de coleta, tratamentos e suas interações (P>0,05), apresentando média de relações de 1,36 para AL:creatinina, 0,121 para AU:creatinina e 1,48 para PD:creatinina. Além do efeito de tratamento sobre a excreção de NU e NUrea, a excreção de CN na urina foi influenciada (P<0,05) também pelos períodos de coleta. As relações NU:creatinina e NUreia:creatinina na urina não apresentaram efeito (P>0,05) de tratamento, dias e períodos de coleta. A avaliação comparativa da excreção de creatinina observada nas amostras obtidas a partir da coleta total de urina, a cada 4 horas por 3 dias, com as amostras spot de urina obtidas em momentos pontuais (às 12, 16, 20, 0, 4 e 8 horas), demonstrou não haver diferença (P>0,05) entre as duas formas de coleta estudadas. A observação das relações AL:creatinina e AU:creatinina, nos métodos de coleta avaliados neste estudo, possibilitou a observação de que não houve variação (P>0,05) entre as amostras obtidas na forma de coleta total ou spot de urina. Na análise das relações NU:creatinina e NUreia:creatinina, observou-se que os horários das amostras obtidas às 4, 8, 12, 16 e 20 horas, foram similares (P>0,05) independentemente do método de amostragem. Entretanto, no horário da meia noite (amostragem 20h00-24h00, coleta total/0 hora, coleta spot de urina), observou-se variação na excreção de NU (inclinação, P=0,03) e de NUreia (inclinação, P=0,01; e intercepto, P=0,03), indicando que coletas spot de urina realizadas neste horário, não representariam a excreção de CN ao longo do período de 24 horas. Conclui- se que a excreção de creatinina é constante em 24h e estima adequadamente o volume urinário em bovinos mantidos em pastejo; e que uma única amostra spot de urina obtida no pasto, em qualquer horário do dia, pode ser usada para estimar a excreção de derivados de purinas. Para a estimativa da excreção de CN na urina são necessárias duas amostras spot de urina, uma quatro horas antes e outra quatro após a suplementação, em bovinos em pastejo. Os principais resultados do capítulo 2 foram que, a recuperação da creatinina foi constante (P>0,05) até o décimo quinto dia de armazenamento, independente da temperatura utilizada. A partir do 30o dia de armazenamento houve efeito de tempo e/ou temperatura (P<0,05) na recuperação de creatinina na urina de bovinos. As amostras armazenadas em temperatura ambiente e a 4oC apresentaram aumento na concentração da creatinina relativa com o passar dos dias (P<0,05). As amostras congeladas (-20oC e a -40oC) mantiveram a recuperação constante (P>0,05). A adição de creatina na urina causou aumento (P<0,05) nas concentrações de creatinina nas amostras armazenadas a temperatura ambiente e em refrigeração, a partir de 30 dias de armazenamento. Nas amostras armazenadas em temperaturas de congelamento, não houve alteração na concentração de creatinina (P>0,05). Amostras de urina podem ser armazenadas em qualquer temperatura estudada até quinze dias após a coleta para determinação da concentração de creatinina. Amostras que necessitem tempos de armazenamentos superiores a quinze dias devem ser congeladas a -20oC ou -40oC. / Aimed to evaluate the creatinine excretion to validate the urine spot sampling technique, as well as the excretions of purine derivatives (PD) and nitrogen compounds (NC) and their relationship with creatinine in Nelore heifers supplemented on pasture (Chapter 1); Were also aimed evaluate the recovery of creatinine as a function of time and different storage temperatures (Chapter 2). The experiment related to Chapter 1 were conducted in the beef cattle department of the Federal University of Viçosa/MG, using five Nelore heifers with mean body weight (BW) of 400 ± 15 kg, distributed in 5x5 Latin square. The five experimental treatments were based on protein-energy supplementation (concentrate with 22% crude protein in dry matter (DM) bases) offered based on BW (0, 3, 6, 9 and 12 g/kg BW (BW0, BW3, BW6, BW9 and BW12, respectively)). Each experimental period had a duration of 16 days, 12d to diet adaptation and four to sampling of urine, feces, blood and ruminal fluid. The total collection of urine and spot of feces sample was performed in three days, from 0:00-4:00, 4:00-8:00, 8:00-12:00, 12:00-16:00, 16:00- 20:00 and 20:00-24:00. Sampling spot of urine was performed for 24 hours, as well as the collection of ruminal fluid and blood at the times of 0, 4, 8, 12, 16, 20 hours. For total urine collection, a Folley no26 probe was used, coupled with a polyethylene hose that carried the urine to a closed urine collection bag, which was emptied every four hours. Sampling of the urine was performed every 4 hours, at the same times as described for blood sampling, by measuring the volume and taking two samples, one diluted with 0.036N H2SO4 and one undiluted. To determine fecal excretion, titanium dioxide, supplied in the total daily amount of 15 g, was used between days 8th and 16th of each period. In order to estimate pasture consumption, indigestible neutral detergent fiber (iNDF) was used as the internal marker. Pasture was collected by the square technique to determine the potentially digestible DM (pdDM) on the third day of each experimental period. On the 13th and 16th days of each period, manual grazing simulation was performed to estimate the composition of the pasture. In the urine samples, the concentrations of creatinine, total urinary nitrogen (UN), urea (UreaN), uric acid (UA) and allantoin (AL) were determined. Statistical analysis was performed using SAS's 9.4 Proc Mixed statistical software. The evaluation of the adequacy of the best form of urine collection was performed using the square root of the mean square of the prediction error (MSPE) among the urine samples obtained through spot sampling. The experiment, referring to Chapter 2, was carried out at the Animal Science Department of the UFV. Urine of twenty-five animals, ten from the Nelore and fifteen from the Holstein, were used. Urine samples (10 from Nelore and 10 from Holstein) were diluted in 0.036N H2SO4, fractionated and stored at room temperature, cooled (4°C) and frozen (-20°C and -40°C), being analyzed different days after sampling (1, 3, 7, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 days). Immediately after sampling, the urine was diluted, and its pH corrected to less than 3, and the urine was analyzed, giving a result used as a reference value of the creatinine concentration in the sample. This reference value was used as a divider of the creatinine values obtained on the days of the analysis, per sample, obtaining the relative creatinine value, which allows the observation of increase or decrease in creatinine concentration over time. To evaluate the conversion of creatine to creatinine in the urine of cattle, urine from five Holstein cows was used. These urines were also diluted and had their pH corrected below 3. To evaluate the effect of adding creatine to the urine, creatine solution (concentrations of 20, 40 and 60 mg/dL) was added to eppendorf containing diluted urine. These urines were analyzed on different days after sampling (1, 3, 7, 15, 30 and 45 days), being stored at the same temperatures described previously. In Chapter 1, a positive linear effect (P=0.001) was observed on the total DM intake due to the increase in the amount of supplementation provided to the animals. However, a quadratic effect (P=0.018) was observed on DM intake from pasture. Intake of N differed among treatments (P<0.05), caused by increased supplement intake, which allowed an increase (P=0.001) on the intake of N NC. The supply of supplementation influenced the ruminal ammoniacal N concentration (P<0.05). Serum urea N concentration (SUN) was affected (P<0.05) by the supply of concentrate in the 24-hour period, once the BW0 treatment did not show a variation in the SUN (P>0.05), as a function absence of supplementation. The creatinine excretion daily was 23.01 ± 0.19 (22.82 - 23.2) mg/kgBW. Excretions of AL, UA and PD, in mmol, were influenced by treatments (P=0.002, P=0.004, P=0.003, respectively). Microbial N synthesis (NM) was influenced, as well as the excretions of PD (P=0.001) by the treatments. The ratios between AL, UA and PD with creatinine were not influenced by collection days, collection periods, treatments and their interactions (P>0.05), with an average ratios of 1.36 for AL:creatinine, 0.121 for UA:creatinine and 1.48 for PD:creatinine. In addition to the treatment effect on UN and UreaN excretion, urine excretion of NC was also influenced (P<0.05) by collection periods. The UN:creatinine and UreaN:creatinine ratios showed no treatment effect (P>0.05), days and collection periods. The comparative evaluation of creatinine excretion observed in the samples obtained from the total collection of urine, sampling every 4 hours per 3 days, with the urine spot samples obtained at punctual moments (at 12, 16, 20, 0, 4 and 8 hours), showed no difference (P>0.05) between the two techniques of sampling. The observation of AL:creatinine and UA:creatinine of the two methods evaluated in this study allowed the observation that there was no variation (P>0.05) between the samples obtained in the form of total collection or urine spot. The analysis of the UN:creatinine and UreaN:creatinine ratios, it was observed that the sample times obtained at 4, 8, 12, 16 and 20 hours were similar (P>0.05) regardless of the sampling method. However, at midnight (sampling 20h00-24h00, total collection/0h, urine spot collection), there was variation in the excretion of UN (slope, P=0.03) and UreiaN (slope, P=0.01, and intercept, P=0.03), indicating that urine spot collections performed at this time would not represent NC excretion over the 24-hour period. Concluded that creatinine excretion is constant in 24 hours and adequately estimates the urinary volume in beef cattle kept in pasture; and that a single urine spot sample obtained in the pasture, at any time of the day, can be used to estimate the purine derivatives excretion. However, two urine spot samples, one obtained four hours before and other four hours after supplementation, are required for the estimation of excretion of CN in urine in grazing cattle. The main results of Chapter 2 were that the creatinine recovery was constant (P>0.05) until the 15th day of storage, regardless of the temperature used. From the 30th day of storage there was a time and/or temperature effect (P<0.05) on the recovery of creatinine in bovine urine. Samples stored at room temperature and at 4oC showed an increase in relative creatinine concentration with the passage of days (P<0.05). Frozen samples (-20oC and -40oC) maintained the constant recovery (P>0.05). The addition of creatine in the urine caused an increase (P<0.05) on creatinine recovery in the samples stored at room temperature and in refrigeration, after 30 days of storage. In samples stored at freezing temperatures, there was no change in creatinine recovery (P>0.05). Urine samples can be stored at any temperature evaluated to 15 days after collection for determination of creatinine concentration. Samples requiring storage times greater than 15 days should be frozen at - 20°C or -40°C.

A (Na+,K+)-ATPase presente no tecido branquial dos crustáceos osmorreguladores é um componente essencial de seu sistema de regulação iônica e osmótica. Esta enzima também apresenta um papel relevante no processo de excreção ativa de NH4+ através do tecido branquial dos crustáceos. Uma fração microsomal rica em (Na+, K+)ATPase foi preparada por centrifugação diferencial a partir de um homogeneizado do tecido branquial de Callinectes ornatus. A centrifugação em gradiente de sacarose revelou a presença de um unico pico de proteina com atividade ATPase, mas a eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes revelou a presença de várias bandas protéicas. O uso do anticorpo monoclonal 5 contra a subunidade da (Na+, K+) ATPase, revelou a presença de uma única banda proteica de 110 kDa com atividade (Na+, K+)?ATPase. A (Na+, K+) ATPase hidrolisou o PNPP (V= 52,0 ± 2,0 U/mg e K0,5 = 1,1 ± 0,1 mM) através de interações sítio-sítio (nH= 1,6). A modulação da enzima pelos íons magnésio (V= 52,3 ± 1,3 U/mg e K0,5 = 1,1 ± 0,05 mM), potássio (V= 51,4 ± 1,5 U/mg e K0,5 = 2,3 ± 0,1 mM) e amônio (V= 56,7 ± 2,6 U/mg e K0,5 = 9,8 ± 0,4 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio. Os íons sódio atuaram como inibidores da atividade K+-fosfatase da enzima (Ki= 1,7 ± 0,1 mM) e a ouabaína inibiu cerca de 80% a atividade PNPPase independentemente da presença de íons amônio. A (Na+, K+) ATPase hidrolisou o ATP de acordo com cinética de Michelis-Menten, com KM= 0,16 0,01 mM e V= 116,3 5,6 U/mg, enquanto a modulação da atividade da enzima pelos íons magnésio (V= 111,0 ± 5,4 U/mg e K0,5= 0,54 ± 0,03 mM), sódio (V= 110,6 ± 5,3 U/mg e K0,5= 6,3 ± 0,3 mM), potássio (V= 116,0 ± 5,5 U/mg e K0,5= 1,5 ± 0,1 mM) e amônio (V= 173,3 ± 5,4 U/mg e K0,5= 5,4 ± 0,3 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio. Também foi observado que na presença de concentrações crescentes de ions amonio, a estimulação da atividade (Na+,K+)-ATPase pelo íons potássio acarretou um aumento de 50% na atividade específica da enzima. A ouabaína inibiu cerca de 86% a atividade (Na+,K+)-ATPase com Ki= 74,5 ?M, sugerindo a presença de 14% de fosfatases e/ou outras ATPase contaminantes. Este é o primeiro trabalho onde se observa uma estimulação sinergística da atividade K-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase de crustáceo pelos íons potássio e amônio. Os resultados cinéticos obtidos para a (Na+,K+)-ATPase branquial de Callinectes ornatus, analisados em conjunto com os já descritos para outras espécies de crustáceos poderão abrir novas perspectivas em relação ao papel dessa enzima na adaptação fisiológica-bioquímica, bem como para a sobrevivência desses animais em diferentes ambientes. / (Na+, K+)-ATPase present on branchial tissue osmoregulatory crustaceans is an essential component of their osmotic and ionic regulation system. Apparently, this enzyme also have a relevant role in the active excretion de NH4+ through the branchial crustacean tissue. A (Na+, K+) ATPase-rich microsomal fraction was prepared by differential centrifugation from Callinectes ornatus homogenized branchial tissue. The sucrose gradient sucrose centrifugation showed the presence of a single protein peak with ATPase activity, and SDS-PAGE revealed the presence of several proteins bands. The use of the 5 monoclonal antibody, against the ? subunit, revealed the presence of a unique protein band of 110 kDa corresponding to the (Na+, K+) ATPase. (Na+, K+) ATPase hydrolyzed the PNPP (V= 52.0 2.0 U/mg and K0.5= 1.1 0.1 mM) through the site-site interactions (nH= 1.6). The modulation of (Na+, K+) ATPase by magnesium (V= 52.3 1.3 U/mg and K0.5= 1.1 ? 0.05 mM), potassium (V= 51.4 1.5 U/mg and K0.5= 2.3 0.1 mM) and ammonia ions (V= 56.7 2.7 U/mg and K0.5= 9.8 ? 0.4 mM) followed cooperative kinetics. However, sodium ions inhibited PNPPase activity of (Na+, K+)?ATPase with Ki= 1.7 0.1 mM. Ouabain also inhibited up to 80% the total activity PNPPase independent of the presence of ammonium ions. The hydrolysis of ATP by (Na+, K+) ATPase followed Michaelis-Menten kinetics with Km= 0.16 0.01 mM and V= 116.3 5.6 U/mg, while enzyme modulation by magnesium (V= 111.0 5.4 U/mg and K0.5= 0.54 0.03 mM), sodium (V= 110.6 5.3 U/mg and K0.5= 6.3 0.3 mM), potassium (V= 116.0 5.5 U/mg and K0.5= 1.5 ? 0.1 mM) and ammonium ions (V= 173.3 . Interestingly, the stimulation of (Na+, K+)-ATPase activity by potassium ions in the presence of increasing concentration of ammonium ions to K+ resulted in a 50% higher specific activity. Ouabain inhibited approximately 86% the activity (Na+, K+) ATPase with (Ki= 74.5 M), suggesting the presence of about 14% of phosphatases and/or other ATPases. This is the first work showing synergistic stimulation of crustacean (Na+, K+) ATPase by potassium and ammonium ions when PNPP is used a substrate. The results reported herein for Callinectes ornatus branchial (Na+, K+) ATPase might open new perspectives concerning the physiological adaption and the survival of these animals in different environmental.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-18T16:07:09Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1100891 bytes, checksum: 18978520d759dffce0de87efc4296c6e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-18T16:07:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1100891 bytes, checksum: 18978520d759dffce0de87efc4296c6e (MD5) Previous issue date: 2015-07-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O nitrogênio presente em dejetos da pecuária leiteira pode contribuir para a poluição do ambiente através de amônia volatilizada para a atmosfera e nitrato lixiviado para as águas subterrâneas. Adicionalmente, a deposição de nitrogênio fecal e urinário no solo é fonte para a nitrificação microbiana e emissão do gás óxido nitroso, que é considerado um dos gases envolvidos no aquecimento global. A melhoria da eficiência de utilização de nitrogênio por animais domésticos diminui as perdas e a excreção de nitrogênio em fazendas. Portanto, é importante avaliar a eficiência de utilização do nitrogênio pelo animal, de forma a otimizar a produção e reduzir sua excreção, proporcionando ganhos econômicos e ambientais. A predição da excreção de N por vacas em lactação contribui com a melhoria dos inventários ambientais e são úteis para a avaliação da eficiência do sistema de produção. Neste estudo foram desenvolvidas equações de predição, obtidas pelo método da metanálise, que integram parâmetros nutricionais e de manejo para quantificar o nitrogênio excretado por vacas leiteiras. Foram coletados dados de teses, dissertações e artigos científicos publicados relacionados com perdas de compostos nitrogenados por vacas em lactação, e através destes dados, foram desenvolvidos os cálculos estatísticos para a elaboração de equações. A escolha das equações foi feita através dos critérios de avaliação AIC e BIC e a validação das mesmas foi realizada em banco de dados independente pela análise de CCC, MSEP e RMSEP. A excreção urinária de N foi melhor estimada na equação múltipla tendo como variáveis independentes o consumo diário de N e matéria seca. A excreção fecal de N e a excreção total de N foi melhor estimada através do consumo diário de N. A quantidade total de N excretada na urina e fezes de vacas lactantes apresentou relação linear positiva com a ingestão de N. A eficiência de N-leite diminuiu à medida que N- ingerido aumentou. / The nitrogen in dairy cattle manure can contribute to environmental pollution through volatilized ammonia to the atmosphere and nitrate leaching to groundwater. Additionally, deposition of urinary and fecal nitrogen in the soil is a source for microbial nitrification and emission of nitrous oxide gas, which is considered one of global warming gases involved. Improving the efficiency of nitrogen utilization by livestock reduces losses and nitrogen excretion in farms. Therefore, it is important to evaluate the efficiency of utilization of nitrogen by the animal in order to optimize production and reduce its excretion, providing economic and environmental gains. The prediction of N excretion by lactating cows contributes to the improvement of environmental inventories and are useful for evaluating the efficiency of the production system. This study developed prediction equations obtained by the method of meta-analysis, which integrate nutrition and management parameters to quantify the nitrogen excreted by dairy cows. Data were collected in theses, dissertations and published scientific papers related losses of nitrogen compounds for dairy cows, and through these data, statistical calculations to elaborate equations were developed. The choice of the equation was made through the evaluation criteria AIC and BIC and validation of the same was carried out in different database by CCC, MSEP and RMSEP analysis. Urinary N excretion was better estimated in multiple equation having as independent variables the daily consumption of nitrogen and dry matter. The fecal N excretion and total N excretion was better estimated by daily consumption of N. The total amount of N excreted in the urine and feces of lactating cows showed a positive linear relationship with the intake of N. The N-milk efficiency decreased as N-intake increased.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-13T17:34:42Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 379696 bytes, checksum: 46f9fb8516076224a79ac2f1a3dcf06e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-13T17:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 379696 bytes, checksum: 46f9fb8516076224a79ac2f1a3dcf06e (MD5) Previous issue date: 2004-02-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O presente trabalho foi desenvolvido a partir de quatro experimentos. No primeiro foram utilizados quatro animais de grau de sangue predominantemente Holandês, fistulados no rúmen, com peso médio de 259 kg, objetivando-se avaliar o efeito dos níveis de casca de algodão na dieta de bovinos sobre os consumos e digestibilidades totais e parciais da matéria seca (MS), matéria orgânica (MO), extrato etéreo (EE), proteína bruta (PB), fibra em detergente neutro corrigida para cinzas e proteína (FDNcp), carboidratos não-fibrosos (CNF), o consumo de nutrientes digestíveis totais (NDT), a produção de proteína microbiana, a concentração de nitrogênio uréico no soro (NUS) e de amônia no rúmen e a excreção de compostos nitrogenados na urina. O delineamento experimental utilizado foi o quadrado latino 4X4, sendo quatro animais, quatro períodos experimentais e quatro tratamentos (níveis crescentes de casca de algodão peletizada: 0, 10, 20 e 30%, em substituição na base da matéria seca à silagem de capim-elefante como volumoso), sendo a dieta total constituída de 60% de volumoso. Verificou-se que os níveis de casca de algodão aumentaram linearmente o consumo diário de todos os nutrientes, tanto em kg quanto em % do peso vivo. As análises de variância não evidenciaram influência dos diferentes tratamentos sobre o pH e concentrações de amônia ruminais, as digestibilidades totais e parciais dos nutrientes e conseqüentemente, não houve efeito sobre o teor NDT das dietas que foi em média 59,53%. O NDT calculado da casca de algodão foi de 55,52%. A concentração de NUS e a excreção de uréia (em mg/kgPV) na urina diminuíram enquanto a excreção urinária de derivados de purinas (DP) na urina aumentou linearmente com a inclusão de casca de algodão nas dietas. A casca de algodão mostrou-se um bom volumoso alternativo, podendo ser fornecida até o nível de 30% na MS total na dieta de novilhos de origem leiteira. No segundo Experimento, objetivou-se avaliar o efeito do nível de produção de leite sobre os consumos e as digestibilidades da MS, MO, EE, PB, FDNcp e CNF, o consumo de NDT e de proteína degradável no rúmen (PDR), a produção de proteína microbiana, a concentração de amônia no rúmen e a excreção de compostos nitrogenados na urina. Avaliaram-se as concentrações de N uréico no soro (NUS) e no leite (NUL), de animais de diferentes produções de leite. Foram comparadas as metodologias de coleta de urina spot e total para a quantificação do fluxo de N microbiano. Foram utilizadas 15 vacas da raça Holandesa, puras e mestiças, alocadas em delineamento inteiramente casualizado, com três tratamentos em função do nível de produção de leite (produção de leite média de 5,88, 18,54 e 32,6 kg/dia para os tratamentos ALTA, MÉDIA e BAIXA). A dieta foi constituída de silagem de milho à vontade e um kg de concentrado para cada três kg da média de leite produzido. Os consumos de todos os nutrientes, exceto de FDNcp, foram influenciados pela produção de leite. As digestibilidades da MS e da MO e o teor de NDT não diferiram entre os tratamentos, enquanto as digestibilidades da PB e da FDNcp, foram influenciadas pelo nível de produção sendo maior e menor, respectivamente, no tratamento ALTA. A presença de cinzas e proteína na FDN subestimou a digestibilidade da FDN e superestimou a dos CNF. Os teores de NUS e NUL e a excreção de compostos nitrogenados na urina foram altamente correlacionados e superiores nos animais mais produtivos, indicando que a concentração ótima varia com o nível de produção de leite. A produção microbiana não diferiu entre as metodologias de coleta de urina spot e total, sendo inferior nos animais menos produtivos. No terceiro, 22 novilhas com diferentes pesos, foram distribuídas em delineamento inteiramente casualizado com cinco tratamentos (peso médio de 523, 453, 315, 235 e 118 kg para os tratamentos I, II, III, IV e V, respectivamente). A alimentação foi constituída de silagem de milho a vontade e 1,5 kg de concentrado por dia para as novilhas dos tratamentos I, II, III e IV, e dois kg de concentrado para as novilhas do tratamento V. Os objetivos foram similares aos do segundo Experimento. Quando expresso em relação ao peso das novilhas, o consumo de MS foi negativamente correlacionado com o peso dos animais. As digestibilidades da MS e da MO e o teor de NDT não diferiram entre os tratamentos, enquanto as digestibilidades da PB e da FDNcp, foram distintas entre os tratamentos, sendo maior e menor, respectivamente, no tratamento V. A presença de cinzas e proteína na FDN subestimou a digestibilidade da FDN e superestimou a dos CNF. Os teores de NUS e a excreção de N e de uréia na urina (em mg/kgPV) foram altamente correlacionados e superiores nas novilhas menores, e variaram com o peso vivo e com o teor de PB e PDR na dieta. A produção microbiana não diferiu entre as metodologias de coleta de urina spot e total, sendo inferior nas novilhas menores. No quarto Experimento, foram utilizadas 15 vacas lactantes com produção de leite média de 24 kg/dia, em blocos ao acaso, objetivando-se avaliar quatro tempos de duração da coleta total de urina (seis, 12, 18 e 24 horas) sobre a estimativa da excreção diária de creatinina. Não foram encontradas diferenças entre a estimativa da excreção de creatinina, obtida pelos tempos de coleta de seis, 12 e 18 horas e a observada em 24 horas, logo a excreção nos períodos diurno e noturno foi similar. A excreção de creatinina pelas vacas do Experimento IV foi, em média, de 24,07 mg/kgPV. Também foram avaliadas as excreções de creatinina nos demais experimentos. Os níveis de casca de algodão não influenciaram a excreção de creatinina nos novilhos do primeiro Experimento, que foi em média de 27,99 mg/kgPV. A excreção de creatinina pelas vacas do segundo Experimento não foi influenciada pela produção de leite, apresentando valor médio de 24,04 mg/kgPV. No terceiro Experimento a excreção de creatinina (EC, em mg/KgPV) aumentou linearmente com a diminuição no peso das novilhas, de acordo com a seguinte equação: EC(mg/kgPV) =32,27 - 0,01093*PV(kg). / This work was developed based on four experiments. In the first it was utilized four predominantly Holstein steers, fitted with rumen cannulae, with average weight of 259 kg, aiming to evaluate the effect of cottonseed hulls levels in the diet on intakes and total and partial digestibilities of the dry matter (DM), organic matter (OM), ether extract (EE), crude protein (CP), neutral detergent fiber corrected to ashes and protein (NDFap) and non-fiber carbohydrates (NFC), on the intake of total digestible nutrients (TDN), on the microbial protein synthesis, on the serum urea nitrogen (SUN) and ruminal ammonia concentration and on the urinary nitrogenous compounds excretion. The design was in 4x4 square lattice, with four animals, four periods and four treatments (increasing levels of peletized cottonseed hulls: 0, 10, 20 and 30% in dry matter basis in substitution of elephantgrass silage as roughage), being the total diet constituted of 60% roughage. It was verified that the cottonseed hulls levels increased linearly the daily intake of all nutrients, in kg and in % of the live weight. The variance analyses didn't evidence influence of the treatments on ruminal pH and ruminal ammonia xiiiconcentrations, on total and partials nutrients digestibilities and consequently there wasn’t effect on TDN of the diets, which was, in average, 59.53%. The calculated TDN of cottonseed hulls was 55.52%. The SUN concentration and urinary urea excretion (in mg/kgLW) decreased while the urinary purine derivatives (PD) excretion increased linearly with the cottonseed hulls inclusion on the diets. The cottonseed hulls was a good alternative roughage, could be supplied until 30% (DM) of the dairy steer’s diet. In the second experiment, it was aimed to evaluate the effect of the milk production level on intakes and digestibilities of the DM, OM, EE, CP, NDFap, NFC, on the TDN and ruminally degraded protein (RDP) intakes, on the microbial protein synthesis, on the ruminal ammonia concentration and on the urinary nitrogenous compounds excretion. It was evaluated the SUN concentration and milk urea nitrogen (MUN) concentrations in cows with different milk production. The spot urine sampling and urine total collection methodologies were compared to quantify de microbial N flow. 15 Holstein cows, pure and crossbred, were allocated in a completely randomized design, with three treatments in function of the milk production level (average milk production of 5.88, 18.54 and 32.6 kg/day to treatments HIGH, MEDIUM and LOW). The diet was constituted of corn silage ad libitum and one kg of concentrate to each three kg of average milk produced. The intakes of all nutrients, except NDFap, were influenced by milk production. The DM and OM digestibilities and TDN content didn’t differ among the treatments, while the CP and NDFap digestibilities were influenced by the production level being larger and smaller in the treatment HIGH, respectively. The presence of ashes and protein in NDF underestimated the digestibilities of NDF and overestimated the digestibilities of NFC. The MUN and SUN concentrations and the urinary N excretion were highly correlated and superiors in the most productive animals, indicating that the optimum concentration varies with the milk production level. The microbial synthesis didn’t differ among the urinary sampling spot and total collection methodologies, and was smaller in the less productive cows. In the third, 22 heifers with different live weight, were allocated in a completely randomized design with five treatments (average 523, 453, 315, 235 and 118 kg to treatments I, II, III, IV and V, respectively). The diet was constituted of corn silage ad libitum and 1.5 kg/day of xivconcentrate to heifers of the treatments I, II, III and IV, and two kg/day of concentrate to heifers of the treatment V. The objectives were similar to those of the second Experiment. When expressed in relation to live weight, the DM intake was negatively correlated with the heifer’s live weight. The DM and OM digestibilities and the TDN content didn’t differ among the treatments, while the CP and NDFap digestibilities were different among the treatments, being higher and smaller in treatment V, respectively. The presence of ashes and protein in NDF underestimated the digestibilities of NDF and overestimated the digestibilities of NFC. The SUN concentration and urinary N excretion (in mg/kgLW) were highly correlated and superiors in the smaller heifers, and varied with the live weigh and with the CP and RDP content of the diet. The microbial synthesis didn’t differ among the urinary spot sampling and total collection methodologies, and was smaller in the smaller heifers. In the forth Experiment, 15 lactating cows with average milk production of 15 kg/day were distributed in randomized blocks design, aiming to evaluate four different total urine collection times (6, 12, 18 and 24 hours) on the daily creatinine excretion. There were not detected differences among the estimation of creatinine excretion, obtained by the times of collection of six, 12 and 18 hours and the observed in 24 hours, soon the excretion in the periods of the day and night was similar. The creatinine excretion by the cows of the Experiment IV was, on average, of 24.07 mg/kgLW. They were also evaluated the creatinine excretion in the others experiments. The cottonseed hulls levels didn't influence the creatinine excretion in the steers of the first Experiment, which was, on average, of 27.99 mg/kgLW. The creatinine excretion by the cows of the second Experiment was not influenced by the milk production, and was, in average, of 24.04 mg/kgLW. In the third Experiment the creatinine excretion (CE, in mg/KgLW) increased linearly with the decrease in the live weight of the heifers, in agreement with the following equation: CE(mg/kgLW) =32.27 – 0.01093*LW (kg).

A presente tese foi elaborada em três capítulos, correspondente às seções 2, 3 e 4. No primeiro objetivou-se avaliar a associação de quitosana com grão de soja integral nas dietas sobre o consumo, fermentação ruminal, digestibilidade e metabolismo de nutrientes e seus efeitos sobre a produção de leite, perfil de ácidos graxos do leite e a eficiência produtiva de vacas em lactação. Para tal, 24 vacas multíparas da raça Holandesa, oito dessas com cânula ruminal, foram distribuídas em quadrados latinos 4×4 replicados. Os tratamentos foram obtidos por esquema fatorial 2×2 pela combinação de quitosana e grão de soja integral nas dietas. De modo geral, a associação de quitosana com grão de soja aumentou a eficiência de fermentação ruminal, reduziu as populações bacterianas ligadas à biohidrogenação e aumentou o teor de ácidos graxos insaturados na gordura do leite, mas houve significativa redução do consumo e digestibilidade dos nutrientes, da síntese de proteína microbiana e da produção de leite. No entanto, a adição de quitosana em dietas sem suplementação lipídica pode ser uma boa estratégia nutricional para aumentar a retenção de N e a eficiência alimentar de vacas em lactação, e adicionalmente, aumentar o teor de ácidos graxos insaturados e de cis-9, trans-11 CLA no leite. No segundo capítulo, o objetivo geral foi avaliar os indicadores externos Cr2O3 e TiO2 e os internos MSi, FDNi e FDAi, estes analisados em diferentes sacos de incubação in situ, a partir da acurácia, precisão e robustez das estimativas de excreção fecal em ensaio de digestão com vacas leiteiras consumindo diferentes dietas. Foram utilizadas oito vacas canuladas no rúmen para a realização de coletas totais de fezes com 24, 48 e 72 h de duração. De modo geral, o Cr2O3 gerou estimativas acuradas e precisas, no entanto a recuperação fecal e a robustez foram afetadas pelo consumo de extrato etéreo das vacas. O indicador TiO2 apresentou incompleta recuperação fecal, baixa acurácia, precisão e robustez. Dentre as combinações avaliadas para os indicadores internos, a FDNi em sacos de poliéster teve completa recuperação fecal e gerou as estimativas mais acuradas, precisas e robustas. A falta de acurácia e precisão dos indicadores têm grande impacto final sobre as estimativas de digestibilidade. No terceiro capítulo, o objetivo foi avaliar o uso da creatinina como indicador do volume urinário para estimativas de excreção total de derivados de purinas como técnica de avaliação da produção microbiana ruminal em vacas leiteiras alimentadas com diferentes dietas. Também foram utilizadas as oito vacas canuladas no rúmen para a realização de coletas totais de urina com 24, 48 e 72 h de duração. De modo geral, a creatinina foi afetada pelas condições experimentais do estudo, incluindo efeito de dieta e variações conforme o período experimental e animais. Apesar da relação entre excreção observada e estimada de derivados de purinas, essa deve ser vista com cautela, em razão de que o volume urinário foi subestimado e que as estimativas não identificaram corretas diferenças entre as dietas, comprometendo as avaliações sobre a produção microbiana ruminal. / The present thesis was elaborated in three chapters, corresponding to sections 2, 3 and 4. In the first one, the aim was to evaluate the association of chitosan (C) and whole raw soybean (WRS) in diets, evaluating the intake, ruminal fermentation, digestibility and nutrient metabolism and its effects on milk production, milk fatty acids profile and the productive efficiency of lactating cows. Twenty four multiparous Holstein cows, eight of them fitted with ruminal cannula, were distributed in a replicated 4 × 4 Latin squares. The treatments were a combination of C and WRS diets arranged in a 2 × 2 factorial design. This association increased the efficiency of ruminal fermentation, reducing the bacterial population responsible for the biohydrogenation and increased the unsaturated fatty acids in milk. The C and WRS diets caused a significant reduction in DMI and nutrient digestibility, in microbial protein synthesis and milk yield. However, the addition of C in diets without a lipid supplementation may be a good nutritional strategy to increase the N retention and increase the food efficiency of lactating cows, and, indeed, to increase the unsaturated fatty acids content, mainly cis-9, trans-11 CLA. In the second chapter, the objective was to evaluate the external indicators Cr2O3 and TiO2 and the indigestible internal DM, NDF and ADF that were determined in in situ different incubation bags from the accuracy, precision and robustness of the fecal excretion estimates in a digestion assay with different dairy cow diets. Eight cows fitted with ruminal cannula were used to perform total fecal collection over 24, 48 and 72 hours. The Cr2O3 generated accurate estimates, however, the fecal recovery and robustness were affected by the ether extract intake. The TiO2 indicator showed incomplete fecal recovery, low accuracy, precision and robustness. Among the combinations for the internal indicators, the iNDF in polyester bags had a complete recovery and generated the most accurate and robust estimates. The lack of accuracy and precision of the indicators have a big impact on the digestibility estimates. In the third chapter, the aim was to evaluate the use of creatinine as an indicator of urinary volume. It would be possible to estimate the total excretion of purine derivatives to evaluate the ruminal microbial protein synthesis in different cow diets. Also, eight multiparous cows fitted with ruminal cannula were used to make total urine collection over 24, 48 and 72 hours. The creatinine was affected by the study experimental conditions, including dietary effect and variations according to period and animals. The relationship between observed and estimated excretion of purine derivatives should be viewed with caution, because the urinary volume was underestimated and the estimates did not identify the correct differences between diets, that could compromise the evaluations of ruminal microbial production.

Capítulo 1 O diclofenaco de sodio é um antiinflamatório não-esteroidal que, além de atividade antiinflamatória, apresenta também propriedades analgésica e antipirética. Seus efeitos farmacológicos estão relacionados à inibição da síntese de prostaglandinas. Vários métodos utilizando técnicas cromatográficas tem sido propostos para a determinação de diclofenaco em plasma, incluindo a cromatografia gás-líquido com detecção por captura de elétrons ou por ionização de chama, a cromatografia gás-líquido-espectrometria de massa e a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica ou no ultravioleta. Descreve-se aqui um método rápido, sensível e específico para a determinação de diclofenaco em plasma usando apenas 200 &#181;l de amostra e envolvendo extração simples e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção no ultravioleta. Extraiu-se o diclofenaco adicionando-se 200 &#181;l de plasma a tubos contendo 500 ng de padrão interno (ácido 2-(p-ciclo-hexen- 1\'-il-fenil)propiônico e 100 &#181;l de ácido ortofosfórico 2,5 N. A seguir adicionaram-se 4 ml de diclorometano e extraiu-se a mistura em agitador de tubos durante 60 segundos. Após centrifugação a 3000 rpm por 20 minutos a fase aquosa foi desprezada e a fase orgânica foi filtrada em membrana Millipore&#174; FHLP 01300 de 0,4 &#181;m e evaporada em corrente de nitrogênio a 37°C. O resÍduo foi dissolvido em 100 a 1000 &#181;l de fase móvel para injeção em CLAE. Empregou-se para a separação coluna Novapak&#174; C18, 150 x 3,9 mm, 4 &#181;m e fase móvel constituída por mistura de tampão acetato 0,75 M, pH 5,O e acetonitrila (55:45, v/v). A detecção foi feita em &#955; = 282 nm. O diclofenaco e seu padrão interno foram eluidos respectivamente a 3,3 e 6,5 minutos em fluxo de 0,9 ml/min. Os limites de confiança do método foram: 10-10000 ng/ml. linearidade; 1 ng/ml, sensibilidade; 95 %, recuperação relativa e 3,5 e 5,7 %, precisão intra e interdias, respectivamente. Este micrométodo mostrou-se suficientemente sensível, preciso e exato para estudos de disposição cinética e bioequivalêneia de fomulações contendo diclofenaco. Capítulo 2 Estudou-se a biodisponibilidade do diclofenaco nos produtos Voltaren&#174; 50 (A), Voltaren Retard&#174; 100 (B) e Artren&#174; 100 (C) após administração de dose única peroral de um comprimido a oito voluntários de ambos os sexos, adultos e sadios. As formulações foram administradas seguindo protocolo de estudo estabelecido por sorteio. Os voluntários em jejum receberam os medicamentos em dose única pela manhã e as amostras de sangue foram colhidas 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração. A concentração plasmática de diclofenaco foi determinada por técnica em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) de fase reversa com detecção no ultravioleta em &#955; = 282 nm após extração com solvente orgânico em meio ácido. Com base nas curvas \"concentração plasmática (C) vs tempo\" e \"logC vs tempo\" foram detenninados os parâmetros da fase absortiva para os três produtos, em X-&#177; EPM: Cmax= 741 &#177; 137 ng/ml e tmax = 2,6 &#177; 0,4 h para o produto A, Cmax = 1399 &#177; 326 ng/ml e tmax = 2,4 &#177; 0,2 h para o produto B, Cmax = 192 &#177; 70 ng/ml e tmax = 2,3 &#177; 0,2 h para o produto C. Os valores de AUCT, calculados pelo método dos trapezóides e extrapolação a infinito, foram, em X- &#177; EPM: 1603 &#177; 253 ng.h/ml para o produto A, 3177 &#177; 606 ng.h/ml para o produto B, 2237 &#177; 529 ng.h/ml para o produto C. A extensão da biodisponibilidade (EBA) do diclofenaco nos produtos Voltaren&#174; 50 (A) e Artren&#174; 100 (C) foi calculada usando-se como referência o produto Voltaren Retard&#174; 100 (B). Foram obtidos os seguintes valores, em X- &#177; EPM (mediana): 138 &#177; 35 (123) % para o produto A, 102 &#177; 35 (68) % para o produto C. A partir dos resultados obtidos sugere-se que o produto B, citado como de liberação prolongada e usado como referência neste trabalho, apresentou características de rápida liberação, semelhantes às do produto A, sugerindo possível falha de impermeabilização no revestimento dos núcleos contendo diclofenaco de sódio durante o processamento industrial do lote do qual provieram os comprimidos aqui avaliados. Capítulo 3 O diclofenaco é um antiinflamatório não-esteroidal indicado para o tratamento de pacientes portadores de inflamações dolorosas de origem reumática ou não. É biotransformado por reações de oxidação seguidas de conjugação glicurônica. Uma pequena porcentagem do fármaco original sofre glicuronização direta. Vários métodos têm sido propostos para a determinação de diclofenaco e seus produtos de biotransformação em fluidos biológicos, incluindo cromatografia a gás com detecção por captura de elétrons e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção eletroquímica ou no ultravioleta. Entretanto, nenhum dos métodos utilizando CLAE mostrou-se suficientemente seletivo para o uso em estudos de disposição cinética. Descreve-se aqui um método sensível e específico para a determinação de diclofenaco e seus produtos de biotransformação hidroxilados em urina por CLAE com detecção no ultravioleta precedida de hidrólise enzimática nas amostras e extração com solvente orgânico em meio ácido. Adicionaram-se 500 &#181;l de urina a tubos contendo 10 mg de mistura de &#946;-glicuronidase e aril-sulfatase e 500 &#181;l de tampão acetato 0,75 M. A mistura foi incubada a 37°C por uma hora e, em seguida, transferiram-se 800 &#181;l do hidrolisado para tubos contendo 3,3 &#181; de padrão interno para diclofenaco (ácido 2-(p-ciclo-hexen-1\'-fenil)propiônico) e 1,0 &#181; de padrão interno para produtos de biotransformação (fenacetina). Procedeu-se à extração com 2 ml de mistura de diclorometano e álcool isopropílico (9:1, v/v) e agitação seguida por centrifugação a 3000 rpm durante 30 minutos. Desprezou-se a fase aquosa e filtrou-se a fase orgânica em sistema Millipore&#174; com membrana FHLP 01300 0,4 &#181;m. O extrato orgânico foi evaporado em corrente de nitrogênio a 37°C e o resíduo, dissolvido em volumes de 500-2000 &#181;l de fase móvel e injetado em CLAE. Usaram-se dois sistemas cromatográficos independentes e consecutivos para a separação do diclofenaco e seus metabólitos hidroxilados. Inicialmente utilizou-se coluna de fase reversa ODS-Shimadzu, 150 x 6,0 mm, 5 &#181;m e fase móvel constituída por tampão acetato 0,01 M, pH 5,0, metanol e acetonitrila (50:40:5) a um fluxo de 1,0 ml/min para eluição do padrão interno (fenacetina) a 10 minutos, 4\',5-di-hidroxidiclofenaco a 12 minutos, 3\'-hidroxidiclofenaco a 34 minutos, 4\'-hidroxidiclofenaco a 40 minutos e 5-hidroxidiclofenaco a 44 minutos. Em seguida utilizou-se a coluna Novapak&#174; C18, 150 x 3,9 mm, 4 &#181;m e fase móvel constituída por tampão acetato 0,75 M, pH 5,0 e acetonitrila (55:45, v/v) e um fluxo de 0,9 ml/min para eluição do diclofenaco a 3,3 minutos e padrão interno (ácido 2-(p-ciclo-hexen-l\'-il-fenil)propiônico, a 6,5 minutos. Os limites de confiança do método foram: 0,4-10,0 &#181;g/ml, linearidade; 0,1 &#181;/ml, sensibilidade, 75 %, recuperação relativa média da extração e precisão intra e interdias variando de 1,3 a 2,2 % e de 3,3 a 5,7 %, respectivamente. O método mostrou-se suficientemente sensível, preciso, exato e específico para o uso em estudos de excreção urinária de diclofenaco e seus produtos de biotransformação hidroxilados. Capítulo 4 Avaliou-se a existência ou não de interação farmacocinética entre a ranitidina e o diclofenaco em voluntários sadios após administração de dose peroral de Voltaren&#174; 50. Selecionaram-se 15 e avaliaram-se oito voluntários adultos, de ambos os sexos, sadios, em estudo constituído por duas fases. Dos oito voluntários, um foi excluído do estudo. Na Fase I o diclofenaco foi administrado isoladamente aos voluntários em jejum pela manhã. Na Fase II, os voluntários foram submetidos a um tratamento de sete dias com ranitidina, depois do qual receberam nova dose de diclofenaco. A administração de ranitidina continuou por mais três dias. Foram colhidas amostras de sangue e urina no intervalo de 0-72 horas após a administração de diclofenaco nas duas fases do estudo. Determinou-se a concentração plasmática e urinária de diclofenaco e a concentração urinária de seus produtos de biotransformação hidroxilados por técnica de cromatografia líquida de alta eficiência, em dois perfis independentes e consecutivos para diclofenaco e produtos de biotransformação, precedida por extração com solvente orgânico em meio ácido e, no caso das amostras de urina, precedida também por hidrólise enzimática. Os valores de \"clearance\" de formação (Clf) dos produtos de biotransformação hidroxilados foram, em X &#177; EPM (mediana): 15,9 &#177; 2,9 (15,2) ml/min para o 4\',5-hidroxidiclofenaco, 3,3 &#177; 0,9 (2,6) ml/min para o 3\'-hidroxidiclofenaco, 22,1 &#177; 5,9 (23,5) ml/min para o 4\'-hidroxidiclofenaco e 8,74 &#177; 1,43 (7,4) ml/min para o 5-hidroxidiclofenaco quando se administrou diclofenaco isoladamente. Não houve alteração significativa destes valores pela associação com a ranitidina. Da mesma forma, o \"clearance\" renal (Clr) do diclofenaco, de 7,1 &#177; 2,8 (5,1) ml/min após administração de diclofenaco isolado, não sofreu alteração significativa pela associação com a ranitidina. A associação com a ranitidina provocou um aumento significativo de cerca de 43 % na meia-vida de eliminação do diclofenaco em plasma, que passou de 1,01 &#177; 0,13 h (X &#177; EPM) na Fase I (fármaco isolado) para 1,44 &#177; 0,34 h na Fase II (fármaco associado), além de causar redução da excreção urinária do produto de biotransformação 4\'-hidroxidiclofenaco, que teve sua fração eliminada total (FelT) reduzida de 5,85 &#177; 1,12 (5,06) % (X &#177; EPM (med)) na Fase I para 4,39 &#177; 0,75 (3,73) % na Fase II. Com base nestes resultados sugere-se que a ranitidina reduza a biotransformação do diclofenaco pela diminuição da excreção renal de seu principal produto de biotransformação hidroxilado (4\'-hidroxidiclofenaco) com conseqüente aumento da meia-vida de eliminação plasmática do diclofenaco. Apesar da interação farmacocinética aqui registrada, a associação diclofenaco-ranitidina é vantajosa para pacientes com história de úlcera péptica, suscetíveis a ulceração recorrente. / Capítulo 1 Diclofenac sodium is a non-steroid anti-inflammatory agent which shows a high degree of anti-inflammatory, analgesic and antipyretic activity . It inhibits prostaglandin biosynthesis in vitro and in vivo, and this inhibitory effect at least partly explains the mechanism of action of the drug. Several methods have been described for the determination of diclofenac in human plasma or serum, including gas chromatography with electron-capture or flame ionization detection, gas-chromatography-mass spectrometry, and high-performance liquid chromatography with UV-detection. We describe a rapid, sensitive and specific procedure for the determination of diclofenac in plasma, using only 200 &#181;l of biological sample, involving single extraction and high-performance liquid chromatography (HPLC) with UV-detection. An extraction with dichlormethane was performed by adding 200 &#181;l of plasma to a test tube containing 500 ng internal standard (2-(p-ciclohexen-1\'-fenil)propionic acid) and 100 &#181;l 2,5 N phosphoric acid. HPLC grade dichlormethane (4 ml) was added and the mixture was agitated with a vortex mixer and eentrifuged at 3000 rpm for 20 minutes. The aqueous phase was discarded and the organic phase filtered through a 0,4 &#181;m FHLP 01300 Millipore&#174; filter and evaporated in a stream of nitrogen at 37°C. The residue was dissolved in 100-1000 &#181;l mobile phase and injected into the liquid chromatograph. Analytical separation was performed in an isocratic system on a reverse-phase column (Novapk&#174; C18, 150 x 3,9 mm, 4 &#181;m). The mobile phase was 0,75 M acetate buffer, pH 5,0 and acetonitrile (55:45, v/v). Peaks were monitored at 955; = 282 nm. Diclofenac and its internal standard were eluted at 3,3 and 6,5 minutes, respeCtively, at a flow rate of 0,9 ml/min. Confidence limits for diclofenac measurements in plasma were: 10-10000 ng/ml, linearity; 1 ng/ml, sensitivity; 95 %, relative recovery, and intra and interassay precision of 3,5 and 5,7%, respectively. This micromethod proved to be sufficiently sensible, precise and accurate for kinetic disposition or bioequivalence studies. Capítulo 2 Bioavailability of diclofenac in two test formulations was compared to a reference after single oral dose to healthy adult volunteers of both sex. Formulations were administered after a fasting night following a randomized study protocol. Blood samples were collected at 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 and 24 hours after dose administration. Diclofenac plasma levels were measured by HPLC technique using a reversed phase system after single extraction with organic solvent in acidic medium.. Peaks were monitored at UV-282 nm. Based on \"plasma concentration vs time\" curves, parameters were determined,expressed as X-&#177; SEM: Cmax = 741 &#177; 137 ng/ml and tmaxm = 2,6 &#177; 0,4 h, product A, Cmax = 1399 &#177; 326 ng/ml and tmax = 2,4 &#177; 0,2 h, product B and Cmax = 192 &#177; 70 ng/ml and tmax = 2,3 &#177; 0,2 h, product C AUCT values, determined by trapezoidal rule and integration to infinity, were, expressed as X- &#177; SEM: 1603 &#177; 253 ng.h/ml, product A, 3177 &#177; 606 ng.h/ml, product B and 2237 &#177; 529 ng.h/ml, product C. Bioavailability (EBA) of diclofenac in test products (A, B) was calculated against reference (B). EBA, expressed as X- &#177; SEM (median), were: 138 &#177;35(123) %, product A and 102 &#177;35 (68) %, product C. Based on this data formulation A and B are bioequivalents while C and B are not bioequivalents. There is a strong evidence that product B, slow-release formulations, as described by the manufacturer, presented fast-release properties. Capítulo 3 Diclofenac is a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) advocated for use in painful and inflammatory rheumatic diseases and certain non-rheumatic conditions. Diclofenac is extensively metabolized mainly by oxidative pathways followed by glucuronide conjugation. A small percentage of the original drug is glucuronidated directly. Many methods have been described for the determination of diclofenac and its metabolites in biological fluids, including gas-chromatography with electron-capture detection and high-performance liquid chromatography (HPLC) with UV or electrochemical detection. However, none of the HPLC methods was sufficiently specific for use in kinetic disposition studies. We describe a sensitive and specific procedure for the determination of diclofenac and its hydroxy metabolites in urine, involving single extraction after enzymic hydrolysis of the glucuronic conjugates and HPLC with UV detection. The enzymic hydrolysis was performed by adding 500 &#181;l of urine to test tubes containing 10 mg of a mixture of &#946;-glucuronidase and aril-sulphatase and 500 &#181;l of acetate buffer 0,75 M, pH 5,0. This mixture was incubated at 37°C for one hour. Then, 800 &#181;l of the mixture were transferred to test tubes containing 3,3 &#181;g internal standard for diclofenac (2-(p-ciclohexen-l\'-il-phenyl)propionic acid) and 1 &#181;g internal standard for metabolites (phenacetine). Dichlormethane and isopropyl alcohol (9:1, v/v) (2 ml) was added and the mixture was agitated with a vortex mixer and centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes. The aqueous phase was discarded and the organic phase filtered through a 0,4 &#181;m FHLP 01300 Millipore&#174; filter and evaporated in a stream of nitrogen at 37°C. The residue was dissolved in 500-2000 &#181;l mobile phase and injected in the liquid chromatograph. Analytical separation was performed in two independent consecutives isocratic systems on reverse-phase column. In the first HPLC profile an ODS-Shimadzu column, 150 x 6,0 mm, 5 &#181;m and a mobile phase constituted of acetate buffer 0,01 M, pH 5,0, methanol and acetonitrile (50:40:5, v/v) at a flow rate of 1,0 <l/min were used for the elution of internal standard (phenacetine) at 10 minutes, 4\',5-dihydroxydiclofenac at 12 minutes, 3\'-hydroxydiclofenac at 34 minutes, 4\'-hydroxydiclofenac at 40 minutes and 5-hydroxydiclofenac at 44 minutes. In the secondonea Novapak&#174; C18 column, 150x 3,9 mm, 4 &#181;m and a mobile phase constituted of acetate buffer 0,75 M, pH 5,0 and acetonitrile (55:45, v/v) at a flow rate of 0,9 ml/min were used for the elution of diclofenac at 3,3 minutes and internal standard (2-(p-cyclohexen-1\'-phenyl)propionic acid) at 6,5 minutes. Confidence limits for diclofenac an its hydroxy metabolites were: 0,4-10,0 &#181;g/ml, linearity; 0.1 &#181;g/ml, sensitivity, 75 %, mean extraction recovery, and intra and interassay precision ranging from 1,3 to 2,2 % and 3,3 to 5,7 %, respectively. This method proved to be sufficiently sensitive, precise, accurate and specific for urinary excretin studies involving diclofenac and its hydroxy metabolites. Capítulo 4 The pharmacokinetic interaction between diclofenac and ranitidine was evaluated in 8 healthy volunteers after peroral single administration of Voltaren&#174; 50 in a two-phase study protocol. On phase I, diclofenac was administered alone, while on Phase II the volunteers were submitted to a chronic treatment with ranitidine for seven days; then a dose of diclofenac was administered and ranitidine continued for three days afterwards. Blood and urine samples were collected at time intervals 0-72 hours after diclofenac administration. Diclofenac and its hydroxylated metabolites in biological fluids were determined by two independent profiles using HPLC technique after a single extraction with organic solvent in acidic medium. Enzymic hydrolysis was necessary for the cleavage of conjugates in urine. Diclofenac elimination half-life was increased by 43 % ranging from 1,01&#177; 0,13 h to 1,44 &#177; 0,34 h (X &#177; SEM) when ranitidine was coadministered. Significant decrease on FelT of 4\'-OH-D ranging from 5,85 &#177; 1,12 (5,06) % to 4,89 &#177; 0,75 (3,73) % (X &#177; SEM (med)) was obtained by ranitidine association. Clf of metabolites expressed as X &#177; SEM (med) were, in ml/min: 15,9 &#177; 2,9 (15,2) for 4\',5-0H-D, 3,3 &#177; 0,9 (2,6) for 3\'-OH-D, 22,1 &#177; 5,9 (23,5) for 4\'-OH-D and 8,7&#177; 1,4 (7,4) for 5-0H-D after peroral single dose of diclofenac alone. These data showed no significant difference when ranitidine was administered. Diclofenac renal clearance (Clr), expressed as X &#177; SEM (med), was 7,1 &#177; 2,8 (5,1) ml/min after diclofenac and 5,4 &#177; 1,9 (3,5) ml/min, ranitidine. Based on these data, ranitidine decreases the biotransformation of diclofenac by inhibition of hydroxylation affecting urinary excretion of its main hydroxy metabolite, 4\'-hydroxydiclofenac. In spite of this pharmacokinetic interaction, without clinical relevance, patients with a history of peptic ulcer and more susceptible to recurrent ulceration, could benefit from the association diclofenac-ranitidine.