Submitted by CARLOS EDUARDO GAMERO AGUILAR (kadugamero@hotmail.com) on 2018-06-10T16:48:07Z No. of bitstreams: 2 Tese Final - Corrigida.pdf: 1023064 bytes, checksum: d4d8bbb2e4f336192b04f878d0224be3 (MD5) Tese Final - Corrigida.doc: 3348480 bytes, checksum: bd9bbd6f82d4e2dc607526653a130694 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-06-12T17:38:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 aguilar_ceg_dr_jabo.pdf: 1023064 bytes, checksum: d4d8bbb2e4f336192b04f878d0224be3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-12T17:38:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 aguilar_ceg_dr_jabo.pdf: 1023064 bytes, checksum: d4d8bbb2e4f336192b04f878d0224be3 (MD5) Previous issue date: 2018-05-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As espécies do grupo do Bacillus cereus estão na cadeia produtiva do leite associadas a problemas tecnológicos por produzirem metaloproteínases. O controle deste microrganismo se faz necessário devido aos prejuízos causados por perdas. Com o objetivo de verificar a presença do gene npr (produção de metaloproteínases), Plcr (regulador pleitrópico) e cspa (assinatura psicrotrófica), avaliar fenotipicamente os isolados quanto à capacidade proteolítica e mensurar a atividade deteriorante da mencionada enzima sobre a kappa-caseína, foram isolados da cadeia produtiva de lácteos, identificados e sequenciados genomicamente, microrganismos pertencentes ao grupo do Bacillus cereus que comprovadamente possuiam características proteolíticas e psicrotróficas. De 466 amostras, obteve-se 69 isolados de Bacillus cereus, sendo que o gene npr, fenótipo proteolítico e Plcr estavam presentes em, respectivamente, 97,1%, 92,7% (64) e 88,4% (61) das amostras. O gene cspa foi identificado em 100% das amostras. Entretanto, fenotipicamente apenas um isolado comportou-se como tal, sugerindo a existência de outros fatores para expressão desta característica. A concentração de ácido siálico elevou-se durante o tempo de prateleira do produto, na média, de 3,99 µg/mL para 4,45 µg/mL no primeiro e último dia, respectivamente. Assim, devido a ampla distribuição do Bacillus cereus associada a sua resistência térmica e a elevada frequência de características proteolíticas, faz-se necessário a obtenção higiênica do leite, minimizando contaminações, para que produtos de qualidade possam ser elaborados. / The species included in Bacillus cereus group are widespread in the dairy production chain and are often associated with technological failures in dairy products, due to the production of metalloproteinases. Controlling this microorganism is necessary due to economic losses. In order to assess the presence of npr gene (metalloproteinases production), Plcr (pleiotropic regulator) and cspa (psychotropic signature), proteolytic activity on plates and the spoilage potential of the enzyme on kappa-casein, Bacillus cereus samples which had proteolytic and psychotropic characteristics were isolated from dairy production chain and sequenced. A set of 69 isolates were obtained from 466 samples and the frequency of npr gene, proteolytic activity and Plcr were observed in, respectively, 97.1%, 92,7% and 88,4% of the samples. The cspa gene was present in all samples. However, only one sample demonstrated the psychotropic phenotype, suggesting the existence of other factors involved in the expression of this characteristic. Concentration of free sialic acid during the shelf life of pasteurized milk ranged from 3,99 µg/ml to 4.45 µg/ml in the first and last days of the storage period, respectively. Therefore, due to the wide distribution of Bacillus cereus associated with thermal resistance and high frequency of proteolytic features, hygienic milking practice is critical to decrease contamination and produce milk with higher quality. / FAPESP: 15/20874-0

Orientador: Ana Maria Centola Vidal / Resumo: As espécies do grupo do Bacillus cereus estão na cadeia produtiva do leite associadas a problemas tecnológicos por produzirem metaloproteínases. O controle deste microrganismo se faz necessário devido aos prejuízos causados por perdas. Com o objetivo de verificar a presença do gene npr (produção de metaloproteínases), Plcr (regulador pleitrópico) e cspa (assinatura psicrotrófica), avaliar fenotipicamente os isolados quanto à capacidade proteolítica e mensurar a atividade deteriorante da mencionada enzima sobre a kappa-caseína, foram isolados da cadeia produtiva de lácteos, identificados e sequenciados genomicamente, microrganismos pertencentes ao grupo do Bacillus cereus que comprovadamente possuiam características proteolíticas e psicrotróficas. De 466 amostras, obteve-se 69 isolados de Bacillus cereus, sendo que o gene npr, fenótipo proteolítico e Plcr estavam presentes em, respectivamente, 97,1%, 92,7% (64) e 88,4% (61) das amostras. O gene cspa foi identificado em 100% das amostras. Entretanto, fenotipicamente apenas um isolado comportou-se como tal, sugerindo a existência de outros fatores para expressão desta característica. A concentração de ácido siálico elevou-se durante o tempo de prateleira do produto, na média, de 3,99 µg/mL para 4,45 µg/mL no primeiro e último dia, respectivamente. Assim, devido a ampla distribuição do Bacillus cereus associada a sua resistência térmica e a elevada frequência de características proteolíticas, faz-se necessário a obtenção higiênic... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The species included in Bacillus cereus group are widespread in the dairy production chain and are often associated with technological failures in dairy products, due to the production of metalloproteinases. Controlling this microorganism is necessary due to economic losses. In order to assess the presence of npr gene (metalloproteinases production), Plcr (pleiotropic regulator) and cspa (psychotropic signature), proteolytic activity on plates and the spoilage potential of the enzyme on kappa-casein, Bacillus cereus samples which had proteolytic and psychotropic characteristics were isolated from dairy production chain and sequenced. A set of 69 isolates were obtained from 466 samples and the frequency of npr gene, proteolytic activity and Plcr were observed in, respectively, 97.1%, 92,7% and 88,4% of the samples. The cspa gene was present in all samples. However, only one sample demonstrated the psychotropic phenotype, suggesting the existence of other factors involved in the expression of this characteristic. Concentration of free sialic acid during the shelf life of pasteurized milk ranged from 3,99 µg/ml to 4.45 µg/ml in the first and last days of the storage period, respectively. Therefore, due to the wide distribution of Bacillus cereus associated with thermal resistance and high frequency of proteolytic features, hygienic milking practice is critical to decrease contamination and produce milk with higher quality. / Doutor

O complexo distrofina-glicoproteínas associadas (DGC) localiza-se no sarcolema das células musculares esqueléticas e cardíacas e tem como função principal proporcionar ligação mecânica entre o citoesqueleto intracelular e a matriz extracelular. Estudos prévios realizados em nosso laboratório, focalizando o complexo DGC, demonstraram perda de proteínas importantes desse complexo. As situações avaliadas anteriormente foram: infecção experimental por Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e sépsis experimental. Em ambas as situações verificou-se a perda da distrofina acompanhada por disfunção contrátil e aumento nos níveis da calpaína, protease dependente de cálcio implicada na proteólise da distrofina. Todavia, o mecanismo responsável pela ativação das calpaínas e proteólise da distrofina na infecção experimental por T. cruzi e na sépsis experimental não está totalmente definido. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro o mecanismo responsável pela ativação das calpaínas nas culturas de cardiomiócitos desafiadas com o soro dos animais infectados experimentalmente com T. cruzi ou com o soro dos animais submetidos à sépsis grave experimental. Camundongos C57BL/6 foram submetidos à sépsis grave ou infectados com a cepa Y de T. cruzi. No pico de expressão das citocinas pró-inflamatórias, 12 dias após inoculação do parasito ou 6 horas após a indução da sépsis, o sangue foi coletado e o soro separado. Corações de camundongos recém-nascidos foram isolados para o cultivo dos cardiomiócitos. No quinto dia após o início das culturas, as células foram estimuladas com 10% do soro de animais infectados com T. cruzi ou o soro de animais submetidos à sépsis grave durante 24 horas. Após, as células foram coletadas para análises de Western blotting e imunofluorescência para verificar a expressão da distrofina e calpaína-1. Avaliou-se também, por imunofluorescência, a expressão do NF-B. Os cardiomiócitos foram estimulados e tratados com o dantrolene, inibidor da liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático, ou ALLN, inibidor da calpaína-1, e após coletados para verificar a expressão da distrofina e calpaína-1 por Western blotting e imunofluorescência. Nossos resultados mostraram uma redução significativa na expressão da distrofina com desarranjo das miofibrilas contráteis e formação de bolhas citoplasmáticas, além de um aumento nos níveis da calpaína-1 e do NF-B. O tratamento com dantrolene nas culturas estimuladas com o soro de animais infectados experimentalmente com T. cruzi ou com o soro dos animais submetidos à sépsis grave, recuperou a expressão da distrofina e reduziu os níveis da calpaína-1. O tratamento com ALLN nos cardiomiócitos estimulados com o soro de animais infectados experimentalmente com T. cruzi recuperou a expressão da distrofina e não alterou os níveis da calpaína-1. Nas culturas estimuladas com o soro dos animais submetidos à sépsis grave, o tratamento com o ALLN recuperou a expressão da distrofina e reduziu os níveis da calpaína-1. Nossos resultados demonstraram que citocinas pró-inflamatórias presentes no soro dos animais infectados experimentalmente com T. cruzi como também no soro dos animais submetidos à sépsis grave induziriam um aumento no influxo de cálcio com consequente ativação das calpaínas, as quais atuariam na ativação do NF-B e na degradação da distrofina. Esse mecanismo poderia ser responsável pela proteólise da distrofina cardíaca observada na infecção experimental por Trypanosoma cruzi como também sépsis experimental. Mais estudos são necessários para elucidar este mecanismo, principalmente em relação a inibidores dos canais de cálcio, das citocinas pró-inflamatórias e das calpaínas, com o objetivo de fornecer novas vias de intervenção na prevenção de alterações cardíacas observadas na doença de Chagas e na sépsis. / The dystrophin-glycoprotein complex (DGC), located in the sarcolemma of cardiac and skeletal muscle cells and concentrated along the plasma membrane in costameric structures provides a framework that connects the intracellular cytoskeleton to the extracellular matrix. Previous studies from our laboratory clearly demonstrated disruption of DGC proteins in experimentally-induced T. cruzi infection and experimental sepsis. Both situation presented dystrophin disruption associated with contractile dysfunction and increased calpain levels, calcium dependent protease responsible for dystrophin proteolysis. However, the mechanism responsible for calpain activation and dystrophin proteolysis in experimentally-induced T. cruzi infection and experimental sepsis is not totally understood. The aim of this study was to evaluate in vitro the mechanism responsible for calpain activation in cultured cardiomyocytes challenged with serum from animals experimentally infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis. Mice C57BL/6 were subjected to sepsis induction or infected with Y strain from T. cruzi. At the peak of proinflammatory cytokines expression, 12 days after parasite inoculation or 6 hours after sepsis induction, the blood was collected and the serum separated. Hearts from newborn mice were isolated for culture of cardiomyocytes. After 5 days of incubation, the cardiac cells were stimulated with 10% of serum from animals experimentally infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis during 24 hours, and collected for Western blotting and immunofluorescence analysis to verify dystrophin and calpain-1 expression. The expression of NF-B was evaluated by immunofluorescence. The treatments with dantrolene, inhibitor of calcium release from sarcoplasmic reticulum, or ALLN, calpain-1 inhibitor, were performed in cultured cardiomyocytes stimulated during 24 hours with serum from animals infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis, and dystrophin and calpain-1 expression were analyzed by Western blotting and immunofluorescence. Our results demonstrated loss of dystrophin associated with myofibers derangement and presence of cytoplasmic blebs as well increase of calpain-1 and NF-B expression. The dantrolene treatment in cultures stimulated with serum from animals infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis recovey dystrophin expression and reduced calpain-1 levels. The ALLN treatment in cardiomyocytes stimulated with serum from animals infected with T. cruzi recovery dystrophin expression and preserved calpain-1 levels. In cultures stimulated with serum from animals subjected to severe sepsis, the ALLN treatment recovery dystrophin expression and decreased calpain-1 levels. Our results demonstrated that proinflammatory cytokines in serum from mice infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis could induce an increase calcium influx with calpain activation, which could act in NF-B activation and dystrophin disruption. Possibly, this mechanism could be responsible to dystrophin proteolysis observed in experimentally-induced acute T. cruzi infection and experimental sepsis. More studies are needed to elucidate this mechanism, especially in relation to calcium channel blockers and inhibitors of pro-inflammatory cytokines and calpains, which may provide new routes for intervention to prevent cardiac damage in Chagas disease and sepsis.

O complexo distrofina-glicoproteínas associadas (DGC) localiza-se no sarcolema das células musculares esqueléticas e cardíacas e tem como função principal proporcionar ligação mecânica entre o citoesqueleto intracelular e a matriz extracelular. Estudos prévios realizados em nosso laboratório, focalizando o complexo DGC, demonstraram perda de proteínas importantes desse complexo. As situações avaliadas anteriormente foram: infecção experimental por Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e sépsis experimental. Em ambas as situações verificou-se a perda da distrofina acompanhada por disfunção contrátil e aumento nos níveis da calpaína, protease dependente de cálcio implicada na proteólise da distrofina. Todavia, o mecanismo responsável pela ativação das calpaínas e proteólise da distrofina na infecção experimental por T. cruzi e na sépsis experimental não está totalmente definido. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro o mecanismo responsável pela ativação das calpaínas nas culturas de cardiomiócitos desafiadas com o soro dos animais infectados experimentalmente com T. cruzi ou com o soro dos animais submetidos à sépsis grave experimental. Camundongos C57BL/6 foram submetidos à sépsis grave ou infectados com a cepa Y de T. cruzi. No pico de expressão das citocinas pró-inflamatórias, 12 dias após inoculação do parasito ou 6 horas após a indução da sépsis, o sangue foi coletado e o soro separado. Corações de camundongos recém-nascidos foram isolados para o cultivo dos cardiomiócitos. No quinto dia após o início das culturas, as células foram estimuladas com 10% do soro de animais infectados com T. cruzi ou o soro de animais submetidos à sépsis grave durante 24 horas. Após, as células foram coletadas para análises de Western blotting e imunofluorescência para verificar a expressão da distrofina e calpaína-1. Avaliou-se também, por imunofluorescência, a expressão do NF-B. Os cardiomiócitos foram estimulados e tratados com o dantrolene, inibidor da liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático, ou ALLN, inibidor da calpaína-1, e após coletados para verificar a expressão da distrofina e calpaína-1 por Western blotting e imunofluorescência. Nossos resultados mostraram uma redução significativa na expressão da distrofina com desarranjo das miofibrilas contráteis e formação de bolhas citoplasmáticas, além de um aumento nos níveis da calpaína-1 e do NF-B. O tratamento com dantrolene nas culturas estimuladas com o soro de animais infectados experimentalmente com T. cruzi ou com o soro dos animais submetidos à sépsis grave, recuperou a expressão da distrofina e reduziu os níveis da calpaína-1. O tratamento com ALLN nos cardiomiócitos estimulados com o soro de animais infectados experimentalmente com T. cruzi recuperou a expressão da distrofina e não alterou os níveis da calpaína-1. Nas culturas estimuladas com o soro dos animais submetidos à sépsis grave, o tratamento com o ALLN recuperou a expressão da distrofina e reduziu os níveis da calpaína-1. Nossos resultados demonstraram que citocinas pró-inflamatórias presentes no soro dos animais infectados experimentalmente com T. cruzi como também no soro dos animais submetidos à sépsis grave induziriam um aumento no influxo de cálcio com consequente ativação das calpaínas, as quais atuariam na ativação do NF-B e na degradação da distrofina. Esse mecanismo poderia ser responsável pela proteólise da distrofina cardíaca observada na infecção experimental por Trypanosoma cruzi como também sépsis experimental. Mais estudos são necessários para elucidar este mecanismo, principalmente em relação a inibidores dos canais de cálcio, das citocinas pró-inflamatórias e das calpaínas, com o objetivo de fornecer novas vias de intervenção na prevenção de alterações cardíacas observadas na doença de Chagas e na sépsis. / The dystrophin-glycoprotein complex (DGC), located in the sarcolemma of cardiac and skeletal muscle cells and concentrated along the plasma membrane in costameric structures provides a framework that connects the intracellular cytoskeleton to the extracellular matrix. Previous studies from our laboratory clearly demonstrated disruption of DGC proteins in experimentally-induced T. cruzi infection and experimental sepsis. Both situation presented dystrophin disruption associated with contractile dysfunction and increased calpain levels, calcium dependent protease responsible for dystrophin proteolysis. However, the mechanism responsible for calpain activation and dystrophin proteolysis in experimentally-induced T. cruzi infection and experimental sepsis is not totally understood. The aim of this study was to evaluate in vitro the mechanism responsible for calpain activation in cultured cardiomyocytes challenged with serum from animals experimentally infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis. Mice C57BL/6 were subjected to sepsis induction or infected with Y strain from T. cruzi. At the peak of proinflammatory cytokines expression, 12 days after parasite inoculation or 6 hours after sepsis induction, the blood was collected and the serum separated. Hearts from newborn mice were isolated for culture of cardiomyocytes. After 5 days of incubation, the cardiac cells were stimulated with 10% of serum from animals experimentally infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis during 24 hours, and collected for Western blotting and immunofluorescence analysis to verify dystrophin and calpain-1 expression. The expression of NF-B was evaluated by immunofluorescence. The treatments with dantrolene, inhibitor of calcium release from sarcoplasmic reticulum, or ALLN, calpain-1 inhibitor, were performed in cultured cardiomyocytes stimulated during 24 hours with serum from animals infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis, and dystrophin and calpain-1 expression were analyzed by Western blotting and immunofluorescence. Our results demonstrated loss of dystrophin associated with myofibers derangement and presence of cytoplasmic blebs as well increase of calpain-1 and NF-B expression. The dantrolene treatment in cultures stimulated with serum from animals infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis recovey dystrophin expression and reduced calpain-1 levels. The ALLN treatment in cardiomyocytes stimulated with serum from animals infected with T. cruzi recovery dystrophin expression and preserved calpain-1 levels. In cultures stimulated with serum from animals subjected to severe sepsis, the ALLN treatment recovery dystrophin expression and decreased calpain-1 levels. Our results demonstrated that proinflammatory cytokines in serum from mice infected with T. cruzi or subjected to severe sepsis could induce an increase calcium influx with calpain activation, which could act in NF-B activation and dystrophin disruption. Possibly, this mechanism could be responsible to dystrophin proteolysis observed in experimentally-induced acute T. cruzi infection and experimental sepsis. More studies are needed to elucidate this mechanism, especially in relation to calcium channel blockers and inhibitors of pro-inflammatory cytokines and calpains, which may provide new routes for intervention to prevent cardiac damage in Chagas disease and sepsis.