Los lantánidos constituyen un grupo de metales fascinante, con unas propiedades químicas muy similares. Aunque no es posible encontrarlos como constituyentes principales de los productos usados a diario, están detrás de toda la revolución tecnológica de la miniaturización electrónica actual. Debido a la similitud de sus propiedades químicas y de los procesos de formación de sus minerales, la separación de estos elementos ha constituido desde su descubrimiento un gran reto. Nuestro trabajo se enfoca en la búsqueda de métodos de separación empleando la extracción líquido-líquido en un soporte polimérico en formato tubular. Se escoge el neodimio como representante de los lantánidos y D2EHPA como agente extractante. Se estudian los parámetros que influyen en la cinética de su extracción empleando una membrana líquida de volumen. Se calculan las constantes de velocidad del transporte de neodimio y holmio a través de la membrana líquida. Se estudia la influencia del pH de la disolución cargada, la concentración inicial de metal y la presencia de una sustancia tampón en la disolución cargada que luego serán aplicados en las diversas configuraciones de membrana líquida estudiados. Se desarrolla un modulo de vidrio y PVDF con una membrana líquida soportada en una fibra hueca. Se emplea para conseguir la concentración de neodimio y en la separación de éste del holmio. Se analizan las características hidrodinámicas del sistema para maximizar el transporte empleando la permeabilidad como parámetro de seguimiento del transporte del metal. Se encuentra que para la misma velocidad lineal el transporte se ve más favorecido cuando el metal se transporta desde el interior hacia el exterior de la fibra hueca. Se observa que en las condiciones estudiadas el neodimio efectivamente se transporta mientras que el holmio se queda retenido en la membrana líquida. Con los parámetros anteriores se desarrolla un módulo concentrador en línea para determinar cantidades reducidas de neodimio en un sistema FIA. Se emplea el mismo lado de la membrana líquida soportada para la realización de los fenómenos de extracción y reextracción. Se alcanzan límites de detección del orden de 100 veces los límites atribuibles al sistema de determinación por sí solo. Es posible determinar neodimio en presencia de lantánidos pesados y algunos elementos como calcio, níquel, zinc, cobre y magnesio que también son extraidos habitualmente con D2EHPA. No es posible hacerlo cuando se trata de lantánidos del grupo de los ligeros y de hierro que presentan una interferencia muy elevada. Para poder evaluar la concentración de metal en las disoluciones acuosas, se emplearon dos métodos de análisis. Por una parte un sistema FIA con un método colorimétrico con Arsenazo III que permite el análisis de muestras con un pH muy diferente entre ellas, gracias al uso de un canal neutralizador con un tampón. Por otra un sistema HPLC con una columna modificada dinámicamente con DDS y utilizando una fase reversa con HIBA, que permite el análisis de todos los elementos lantánidos en muestras que los contienen a todos ellos. Se aplica al análisis de muestras reales de mineral de bastnasita. Se desarrolla un módulo de vidrio con una membrana líquida de volumen, contenida en una fibra hueca, que permite la concentración y separación en continuo de tierras raras empleando D2EHPA como extractante. Se produce la recuperación efectiva en un alto grado de eficacia de neodimio incluso con tiempos cortos de contacto. En las condiciones estudiadas no es posible la separación de los diferentes lantánidos. / The lanthanides are a fascinating group of metals, with very similar chemical properties. Even it is not possible to find them as main constituents of products used on a daily basis, they are behind all the technological revolution of the nowadays electronic miniaturization. Due to the similarity of their chemical properties and the processes of formation of their ores, separation of these elements has constituted a great challenge since its discovery. Our work focuses on the search for methods of separation using the liquid-liquid extraction in a polymeric support in tubular form. As representative of the lanthanides neodymium and D2EHPA as extraction agent is chosen. We study the parameters influencing the kinetics of extraction using a bulk liquid membrane. The speed constants of the transport through the liquid membrane of neodymium and holmium are calculated. It is discussed the influence of the pH, the initial concentration of metal and the presence of a buffer substance in feed solution that then will be applied in the different configurations of liquid membrane studied. It is developed a glass and PVDF module with a hollow fibre supported liquid membrane inside. It is used to achieve the concentration of neodymium and its separation from holmium. The hydrodynamic characteristics of the system are analyzed to maximize transport using the permeability as a parameter of the transport of metal tracking. It is found that, for the same linear speed, transport is favoured when metal goes from the lumen towards the shell of the hollow fibre. It is observed that in the studied conditions neodymium is actually transported while the holmium is retained in the liquid membrane. With the previous parameters an in line concentrator module is developed for determining small amounts of neodymium with a FIA system. It employs the same side of the supported liquid membrane to carry out extraction and re-extraction phenomena. It reaches limits of detection of the order of 100 times attributable to the system determination limits itself only. It is possible to determine neodymium in the presence of heavy lanthanides and some elements like calcium, nickel, zinc, copper and magnesium which are also commonly extracted with D2EHPA. It is not possible to do so with iron and the light lanthanides group that present a very high interference. Two methods of analysis were used to evaluate the concentration of metal in aqueous solutions. On the one hand a FIA system with a colorimetric method with Arsenazo III that allows the analysis of samples with a very different pH between them, thanks to the use of a buffer neutralization channel. On the other hand an HPLC system with a column dynamically modified with DDS and using a reversed phase with HIBA, which allows the analysis individual lanthanide elements in samples containing all of them. That is applied to the analysis of real samples of bastnasite ore. It is developed a glass module with a bulk liquid membrane, contained in a hollow fibre, which allows the concentration and continuous separation of rare earths using D2EHPA as extracting agent. It is achieved the effective recovery in a high degree of neodymium even with short contact times. The separation of the different lanthanides is not possible under the conditions studied.

El disseny i la caracterització de plataformes analítiques i miniaturitzades, modificades amb diferents nanomaterials (tals com nanotubs de carboni o nanocables), s’ha portat a terme per a la seva posterior aplicació en la detecció de diversos analits d’interès (com per exemple fenol, glucosa, o la captura d’oli). Cal destacar que en alguns casos les plataformes sensores s’han modificat prèviament amb entitats biològiques que aporten selectivitat i sensitivitat a l’estudi analític. Referent als processos en absència de flux (mode batch), el elèctrodes serigrafiats de capa gruixuda (screen-printed electrodes, SPE) s’han modificat amb nanotubs de carboni, demonstrant un comportament analític excepcional per a aplicacions mediambientals. La detecció de fenol, modificat amb l’enzim de Tyrosinasa, va ser caractertizat mitjançant diferents tècniques de microscòpia com SEM, TEM o microscòpia confocal (CSLM), les quals van permetre obtenir una sèrie de dades estadístiques referents a la morfologia del material, alhora que van permetre determinar la distribució de la Tyrosinasa en la matriu sensora. Es van estudiar diferents mètodes d’immobilització, a més a més de ser implementat en un sistema de d’anàlisi per injecció en flux. A més a més, els SPE modificats amb nanocables d’or i plata, donant lloc a una plataforma sensor de glucosa que treballa en absència d’enzim, mitjançant la mesura de corrent produïa per l’oxidació directa de la glucosa sobre la superfície de l’elèctrode. Els estudis es van portar a terme a partir de la implementació de tècniques de cronoimpedància. El desenvolupament de noves plataformes nanoestructurades preparades a partir de la deposició alternada de nanopartícules de Prussian Blue, prèviament modificades amb ciclodextrina, amb polyallylamine (PAH) va permetre la creació d’una estructura supramolecular microcúbica. Aquestes plataformes presenten un comportament molt interessant electroquímicament, ja que els seus pics de corrent catòdics i anòdics augmenten amb el número de bicapes, indicant que efectivament les nanopartícules estan connectades elèctricament entre les multicapes. Cal destacar també la combinació de partícules paramagnètiques en un microchip d’electroforesis. Mitjançant la combinació d’un camp magnètic extern, l’electroforesis i tècniques electroquímiques, es va aconseguir la detecció de fenol (com a indicació de la immunodetecció). En aquest cas concret la detecció de fenol es va portar a terme per a seguir la hidròlisis de la phenol phosphate portat a terme per l’enzim alkaline phosphatase (AP) (immobilitat en les partícules magnètiques). El sistema requereix molt poc volum de mostra, alhora que presenta molts avantatges per a la seva versatilitat i per ser un sistema miniaturitzat que permet la renovació del la plataforma immunoespecífica. Finalment, s’ha desenvolupat una plataforma dinàmica a partir de la implementació de motors a la nano/microescala per a aplicacions mediambientals, a partir de la creació d’una superfície exterior superhidrofòbica que interactua amb substàncies olioses capturant-les. El desenvolupament de diferents plataformes, a més a més de la posterior integració de nano/micromaterials que han millorat significativament el seu comportament a nivell analític, ha mostrat resultats excel·lents en la detecció d’analits d’interès ambiental i mediambiental, projectant-se com a un element clau en sistemes monitoritzats i altres plataformes analítiques d’interès. / The design and characterization of novel miniaturized (bio)sensing platforms and devices modified with different nanomaterials, such as carbon nanotubes or nanowires, have been achieved. These platforms and devices have been applied in the detection of various analytes (e.g. phenol, glucose, oil droplets), in some cases closely related to the previously immobilization of biological entities that confer selectivity and sensitivity to the analytical platform. Regarding batch platforms, screen-printed electrodes (SPE) modified with carbon-nanotubes has demonstrated to be a potential analytical platform for environmental purposes by being applied for phenol detection in case of being modified by tyrosinase enzyme. The characterization of modified SPE by SEM, TEM and Confocal Scanning Laser Microscopy (CSLM) has brought the necessary statistical data over the morphological properties of the nano/micromaterials treated and the distribution of tyrosinase enzyme along the sensor matrix. Several immobilization approaches have been developed and the present system has been integrated in a Flow Injection Analysis (FIA). Additionally, carbon nanotubes modified SPE with gold-silver nanowires has resulted in a non-enzymatic electrochemical glucose sensor, based on the measurement of the current response during the direct glucose oxidation on the electrode surface by chronoimpedance technique (CIT) studies. The development of novel assembled nanoplatform taking advantage of layer by layer depositions from Prussian blue (PB) - cyclodextrin (CD) nanoparticles (NPs) with polyallylamine (PAH) was designed, showing a microcubic supramolecular like organitzation. Such platforms present interesting electrochemical behaviour, as the cathodic and anodic peak currents increased with the number of bilayers, indicating that PB nanoparticles are electrically connected within multilayers. Moreover, the combination of paramagnetic particles with microchip electrophoresis, external magnetic field manipulations, and coupled to EC detection permitted the detection of phenol (as indicator for immunodetection) by using low reagent consumption, in addition to the inherent miniaturization and versatility of such miniaturized system. Phenol detection was achieved by following the hydrolysis of phenyl phosphate by alkaline phosphatase (AP) enzyme linked to the magnetic beads (MBs), which resulted in a very interesting system due to the possibility to renew the immuno-specific support. Finally, an alternative and dynamic analytical platform was developed through the implementation of artificial nano/microscale machines for environmental remediation applications based on the creation of a superhydrophobic outer surface to strongly interact and capture oily liquids has been achieved. The development of different platforms, along with the wide range of nano/micromaterials integrated on them as to improve their analytical performance, have shown good results towards the detection of analytes of interest in health and environmental issues, being envisioned future key components of monitoring systems and other analytic platforms of interest.

INTRODUCCIÓ: L’estrès oxidatiu està present en diferents patologies que poden cursar amb esterilitat femenina o amb complicacions durant l’embaràs, com per exemple l’endometriosi o la preeclàmpsia. L’augment crònic de les espècies reactives d’oxigen en el teixit endometrial i/o embrionari pot provocar dany cel·lular, inflamació local i autoimmunitat, dificultant la implantació de l’embrió i la gestació. L’ús d’antioxidants podria afavorir la implantació, ajudar al desenvolupament de l’embaràs i evitar l’avortament. OBJECTIUS: Avaluar l’acció antioxidant del n-acetilcisteïna (NAC), la quercetina, la catequina i la vitamina E en cèl·lules endometrials i en cèl·lules de trofoblast; estudiar el tractament combinat de vitamina E i pentoxifilina en dones infèrtils remeses a programes de reproducció assistida. MATERIALS I MÈTODES: S’ha avaluat l’efecte antioxidant del NAC, la quercetina, la catequina i la vitamina E inclosa en liposomes en el model d’oxidació de cèl·lules endometrials i de trofoblast, induint l’estrès oxidatiu amb diferents concentracions de peròxid d’hidrogen (H2O2). S’ha avaluat el dany oxidatiu mitjançant la viabilitat cel·lular (o citotoxicitat) pel mètode de bromur de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil-tetrazol (MTT). L’anàlisi de l’apoptosi s’ha realitzat mitjançant la valoració de l’externalització de la fosfatidilserina i l’activitat de la caspasa-3. Les fases del cicle cel·lular s’han analitzat mitjançant la quantificació del material gènic per citometria de flux. En l’estudi realitzat en un grup de dones infèrtils, s’ha analitzat l’efecte del tractament combinat de vitamina E i pentoxifilina sobre l’expressió de proteïnes reguladores del complement (CRPs), així com sobre el gruix i el volum de l’endometri d’aquestes dones. RESULTATS: S’ha establert diferents graus de citotoxicitat en cèl·lules endometrials i de trofoblast, segons la concentració del H2O2: citotoxicitat nul·la (≤1mM), moderada (1,5 i 2mM) i severa (>2mM). Un augment de citotoxicitat provoca un increment de l’apoptosi i de la necrosi en les cèl·lules endometrials. En les cèl·lules del trofoblast la mort cel·lular es realitza mitjançant la necrosi, ja que no s’ha observat apoptosi depenent de l’activitat caspasa-3. L’oxidació alenteix o atura el cicle cel·lular en la fase G2-M en ambdós tipus cel·lulars. L’administració de NAC i quercetina, en aquest model, disminueix significativament el dany oxidatiu i els seus efectes, fins i tot en condicions de citotoxicitat severa. Els agents antioxidants només tenen efecte si estan presents durant l’estrès oxidatiu. El NAC té una millor activitat antioxidant que la quercetina i inhibeix totalment l’acció de l’agent oxidant. En l’endometri de dones infèrtils, s’observa un augment de l’expressió gènica de les proteïnes reguladores del complement CD46 i CD59 si es compara amb l’endometri de dones fèrtils. Els pacients infèrtils que han rebut el tractament combinat de pentoxifilina i vitamina E mostren una lleugera disminució en la seva expressió gènica de CD46 i CD59. CONCLUSIONS: De tots els agents antioxidants estudiats en aquesta tesi, el NAC ha mostrat la major eficiència per a disminuir el dany oxidatiu en cèl·lules implicades en la implantació embrionària com les cèl·lules endometrials i de trofoblast. Les dones infèrtils tenen augmentades les proteïnes CD46 i CD59 respecte les dones fèrtils. El tractament antioxidant de vitamina E i pentoxifilina provoca una lleugera disminució d’aquestes proteïnes. / Background: Oxidative stress plays a role in several pathologies that could be involved in female sterility or pregnancy complications, like endometriosis or preeclampsia. Chronic increase of reactive oxygen species in endometrial and/or embryonic tissue could cause cellular damage, local inflammation and autoimmunity, making embryo implantation and pregnancy difficult. Antioxidant therapy could help embryo implantation, pregnancy development and help to avoid miscarriage. Objective: To evaluate the antioxidant effect of n-acetilcystein (NAC), quercetin, catechin and vitamin E in endometrial and trophoblast cells; to study the combined treatment of vitamin E and pentoxifilline in infertile women Materials and methods: Antioxidant activity of NAC, quercetin, catechin and liposome-encapsulated vitamin E has been evaluated in an oxidative model with endometrial and trophoblast cells. Oxidative stress has been induced by several concentrations of hydrogen peroxide (H2O2). Oxidative damage has been evaluated by cell viability (or cytotoxicity) using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Apoptosis analysis has been measured by the phosphatidyl serine externalization and the caspase-3 activity. Cell cycle phases have been analysed by DNA quantification using flow cytometry. In the infertile women study, we have analysed the effect of the combined treatment of vitamin E and pentoxifilline in the complement regulatory protein (CRP) expression, endometrial thickness and endometrial volume. Results: Cytotoxicity grades have been established in endometrial and trophoblast cells according to H2O2 concentration: light cytotoxicity (≤1mM), moderate cytotoxicity (1,5 i 2mM) and high cytotocixity(>2mM). Endometrial cells increase the apoptosis and the necrosis rates at a greater cytotoxicity. Trophoblast cells die through necrosis, so caspase-3-dependent apoptosis has not been observed. Oxidative stress induces cell cycle arrest at G2-M phase in both cells. Oxidative damage and its effects have been significantly decreased by NAC and quercetin, in this model, even at high cytotoxicity condition. Antioxidant activity occurs when the antioxidant is present during oxidative stress induction. NAC has better antioxidant activity than quercetin and completely avoids oxidant action. Infertile women’s endometrium has increased CD46 and CD59 gene expression compared with fertile women’s endometrium. A combined treatment of vitamin E and pentoxifilline in infertile women slightly decreases CD49 and CD59 gene expression in the endometrium. Conclusions: Among the antioxidants, NAC is the most efficient in decreasing oxidative damage in cells involved in embryo implantation like endometrial cells and trophoblast cells. CD46 and CD59 proteins are higher in infertile women than in fertile women. A combined treatment of vitamin E and pentoxifilline slightly decrease both proteins.

Actinobacillus pleuropneumoniae es una bacteria gramnegativa que provoca la pleuroneumonía porcina. En este trabajo se ha procedido a la producción y purificación, mediante técnicas de biología molecular, de antígenos proteicos de esta bacteria y a su uso en la formulación de una vacuna por subunidades y de un ELISA para diagnóstico. Los cuatro antígenos escogidos fueron dos proteínas de membrana externa (Tbp1 y Tbp2) y dos exotoxinas (ApxI y ApxIII).La primera necesidad consistía en localizar y secuenciar el gen tbp1 en el genoma de A. pleuropneumoniae. Para la detección de tbp1 se clonó el gen tbp2, situado en posición 5' respecto del gen tbp1, y se utilizó como sonda. Tras su identificación, el gen tbp1 fue clonado en el vector pUC119 y se obtuvo su secuencia completa, ésta se depositó en el Genbank con el código de acceso Z49708, habiéndose obtenido su patente europea EP0733708 y americana 08/624655. Finalmente, el resultado de este primer apartado fue publicado (Daban et al., 1996; Medrano et al., 1997) (Anexos VII.1 y VII.2).Por otro lado, para la clonación de los genes apxIa y apxIIIa se utilizó una estrategia diferente. Al estar publicadas sus secuencias, se diseñaron cebadores de PCR en los cuales se introdujeron mutaciones que creaban dianas de restricción, permitiendo así la amplificación sobre el genoma y posterior clonación en vectores de expresión.Una vez clonados los genes codificantes para las cuatro proteínas se pasó a la producción heteróloga en Escherichia coli. Para ello se utilizaron diversos vectores: pMAL, que generan como producto de expresión una proteína de fusión con la MBP (maltose binding protein) y vectores de la gama pET, con los cuales se ha desarrollado la mayor parte del trabajo. En ellos se han clonado y producido los cuatro antígenos en diversas construcciones, tanto las proteínas completas como péptidos de las mismas. A partir de los extractos obtenidos se procedió a la purificación de los antígenos por cromatografía de afinidad aprovechando fusiones con colas de histidinas.Tras producir y purificar los cuatro antígenos (ApxI, ApxIII, Tbp1 y Tbp2) a escala de laboratorio, se procedió a la elaboración de una vacuna experimental. Se desarrollaron tres protocolos de vacunación sobre cerdos libres de anticuerpos frente a A. pleuropneumoniae. Se estudió la inocuidad y efectividad de esta vacuna.Se determinó la respuesta humoral a partir de las muestras de suero obtenidas en los ensayos de vacunación mediante técnicas de transferencia Western-blot y de ELISA indirecto. Utilizando estas muestras y otras baterías de sueros de campo de animales con historias clínicas diversas se ha desarrollado un kit de ELISA indirecto para la detección de anticuerpos frente a A. pleuropneumoniae. Los antígenos que se utilizan para la preparación de este ELISA son la Tbp2 y la ApxI producidas de forma recombinante. Este kit se comercializa actualmente bajo el nombre de CIVTEST SUISAPP. / Actinobacillus pleuropneumoniae is a gramnegative bacteria responsible for the porcine pleuropneumonia. In this work we have proceeded to the production and purification, using molecular biology techniques, of proteinaceous antigens from this bacteria and to its use in the formulation of a subunit vaccine and in an ELISA for the serological diagnostic. The four chosen antigens were two outer membrane proteins (Tbp1 y Tbp2) and two exotoxins (ApxI y ApxIII).The first requisite was the localization and sequenciation of the tbp1gene in the A. pleuropneumoniae genome. The tbp2 gene was cloned to be used as a probe for the tbp1 detection, this gene is located upstream the tbp1. After its location, the tbp1 gene was cloned in the pUC119 vector and his complete sequence was obtained, this sequence was submitted to the Genbank con el accession code Z49708, the European patent number is EP0733708 and the American is 08/624655. These results were published (Daban et al., 1996; Medrano et al., 1997) (Anexos VII.1 y VII.2).On the other side, for the ApxIa y ApxIIIa genes cloning a different strategy was employed. As their sequences were already published, PCR oligonucleotides were prepared with mutations inserted in order to generate restriction sites, allowing the amplification using the genome as template followed by cloning in expression vectors.Once the four proteins coding genes cloned we proceeded to their heterologue production in E. coli. Diverse vectors were used to achieve this: pMAL, which yields a fusion protein with the MBP (Maltose Binding Protein) and pET range vectors, most of the work has been done with the late ones. The four recombinant antigens have been cloned and produced in the pET vectors, the whole antigens and also as peptides. The recombinant proteins were purified from the expression cultures by means of affinity chromatography making use of histidine fusion tags.After the expression and purification of the four antigens (ApxI, ApxIII, Tbp1 y Tbp2) on a laboratory scale, an experimental vaccine was prepared. This vaccine was tested in three experimental protocols using pigs free form antibodies against A. pleuropneumoniae. The harmlessness and immunogenicity of this vaccine were evaluated.Western-blot and ELISA were used to make a serological titration on samples obtained from the vaccination assays. Using these samples and other field sera collections obtained from swine with known diverse clinical reports, an indirect ELISA assay kit was developed for the detection of specific antibodies against A. pleuropneumoniae. The antigens used in the preparation of the assay are the recombinant proteins Tbp2 and ApxI. This assay is currently being commercialised under the brand CIVTEST SUISAPP.

L'estudi dels processos moleculars implicats en la regulació de l'osteogènesi s'ha realitzat en base a dues malalties humanes diferents, les quals estan caracteritzades per la formació ectòpica d'os de naturalesa diversa: la FOP (la fibrodisplàsia ossificadora progressiva) amb formació d'os endocondral i la POH (l'heteroplàsia òssia progressiva) amb formació d'os d'origen intramenbranós.Mitjançant un procés meticulosament regulat, l'esquelatogènesi embrionària humana transforma cèl·lules mesenquimàtiques en sistemes orgànics articulats ben definits espaialment com són el cartílag i l'os. Un dels enigmes per resoldre en la biologia de l'esquelet fa referència als senyals moleculars que són necessaris i suficients per induir una adequada formació de l'esquelet. En condicions normals d'esquelatogènesi, un augment en l'elaboració i activitat del morfogen BMP-4 es troba finament regulat per un nombrós grup de senyals negatius que inclouen -però no es limiten a- antagonistes extracel·lulars de BMP-4 com ara noggin, gremlin, follistatin i chordin, generats per mecanismes de retroalimentació complexos. A mes la formació ectopica d'os també implica altres gens com ara GNAS1, codificador de la subunitat a de les proteïnes G i responsable de la POH.Encara no ha estat identificat el gen que causa la FOP, els resultats obtinguts poden, de fet, ajudar a identificar el gen mutat mitjançant una atenció central en porcions del camí de transducció de senyal de les BMPs. Aquí és on el gen responsable de FOP té més possibilitats de recaure i ja que els nostres resultats indiquen l'existència d'un defecte en la senyalització entre l'estímul de BMP-4 i els seus cognats antagonistas noggin i gremlin, és molt probable que la mutació responsable de FOP s'ubiqui en un dels gens codificadors de proteïnes mediadores o reguladores del camí de senyalització de la BMP-4.En l'estudi relacionat amb la POH, s'ha demostrat que existeixen múltiples formes del gen GNAS1/gnas que s'expressen en cèl·lules preosteoblàstiques MC3T3-E1 de ratolí i també en LCLs humanes. Quan les cèl·lules s'orienten cap a un llinatge osteogènic, s'observen notables diferències en l'expressió dels transcrits de gnas. La inhibició de les isoformes Nesp55 i de la nova forma de Gsa i una activació progressiva de les isoformes XLalpha, antisentit i Gsa amb l'exó 3 exclòs, en conjunt, pot proporcionar un mecanisme coordinat que involucri la unitat transcripcional de gnas en el procés de diferenciació osteogènica de les cèl·lules pluripotents, suggerint que la predisposició de hMCS a dirigir-se a llinatges osteogènics o adipogènics està governada per múltiples interaccions entre els diferents transcrits de gnas. A més, els nostres resultats indiquen que els nivells reduïts fins a la meitat en individus POH podrien influir en processos "downstream" que condueixen a un fenotip osteogènic competent.Aquest treball de recerca ha permès situar en un mateix pla d'estudi processos d'osteogènesi de naturalesa diversa, els quals es desencadenen per camins de transducció alternatius. Les rutes de transducció del senyal de factors TGF-b_, com el morfogen BMP-4 _i proteïnes G s'entrecreuen les unes amb les altres (Cross-talking). Les mutacions en els gens codificadors de proteïnes mediadores o reguladores del camí de senyalització de BMP-4 i els defectes en els camins de senyalització de receptors acoblats a les proteïnes G poden contribuir directament o indirecta a la patogènesi de moltes malalties amb formació heterotòpica d'os. / The molecular processes that control the regulation of osteogenesis were studied in two different human bone disorders characterized by the formation of ectopic bone of distinct nature, FOP (fibrodysplasia ossificans progressiva) with endocondral bone formation and POH (progressive osseous heteroplasia) with bone formation of intramenbranous origin.Through a tightly regulated process, human embryonic skeletogenesis transforms mesenchymal cells into articulated organic systems well defined spatially as are bone and cartilage. One of the enigmas to solve in skeleton biology are the molecular signals that are necessary and sufficient to trigger a proper formation of the skeleton. In normal skeletogenesis, an increase in the elaboration and activity of morforgen BMP-4 is finely regulated by a number of negative signals that include- but is not limited to- extracellular antagonist of BMP-4 as noggin, gremlin, follistatin i chordin, generated by complex feedbacks mechanisms. Moreover, ectopic bone formation also results from an alteration in other genes as GNAS1, GNAS1 codifies for the a subunit of heterotrimeric G proteins which is responsible for POH.Still has not been identified the gene that causes FOP. The results obtained in this work can, in fact , help to identify the mutated gene through a central attention to some portions of the BMPs transductional pathway, here is were the gene FOP has more changes to be found since our results indicate of the existence of a defect in the signaling between the stimulus BMP-4 and its cognates antagonist noggin and gremlin, is quite probable that the mutation responsible for FOP is located in one of the genes that codifies for intermediate or regulatory proteins of the BMP-4 signaling pathway.We have shown in the study related to POH that exist multiple forms of the gene GNAS1/gnas which are expressed in mice preosteoblastic MC3T3-E1 cells. When cells are directed to an osteogenic linage, several remarkable differences are observed in the expression of the gnas transcripts. The inhibition of isoforms Nesp55 and the new form of Gsa and a progressive activation of isoforms XLalpha, antisense and Gsa without exon 3, in general could supply a coordinate mechanism that involves the GNAS1 trascriptional unit in the process of osteogenic differentiation of the pluripotent mesenchymal cells, suggesting that the commitment of hMCS to differentiated to osteogenic and adipogenic lineages is governed by multiple interactions among the gnas transcrits. In addition, our results indicate that the reduced levels of the different GNAS1 transcripts in POH individuals could somehow influence in the downstream signals that conduct that drive into a competent osteogenic phenotype.This research work has let us to situated at the same study plane two different osteogenic processes of diverse nature which are trigger by alternative transductional pathways The signal transductional pathways of TGF-b, as morphogen BMP-4, and G proteins cross talk one with the othert. Mutations at the genes that codify for intermediate and regulatory proteins of BMP-4 signaling pathways and defects in the signaling pathways of receptors coupled to G proteins can contribute directly or indirectly to the pathogenesis of several disorders of bone ectopic formation.

A fnales del siglo XVIII empieza a emplearse en la literatura alemana el término Novelle" para designar una tradición genérica supuestamente procedente de la tradición románica. Pese a que con posterioridad la Novelle ha merecido ser considerada la más importante forma narrativa de la literatura alemana, su estudio no ha sido capaz de fijar una descripción exacta y unánimemente aceptada e los elementos que la conforman, La teoría de la Novelle desarrolla durante el siglo XIX se reduce a un grupo de testimonios fragmentarios y contradictorios de los que es imposible inferir una definición coherente del género. Ya en el siglo XX, las distintas teorías planteadas por la crítica especializada han demostrado ser demasiado restrictivas o demasiado laxas como para dar cuenta del corpus textual designado por el término genérico. La presente tesis asume como presupuesto que la Novelle no constituye una excepción incómoda en la historia de los géneros literarios, sino que su problemática apunta a una de las cuestiones centrales en la actual comparatística: las relaciones entre el texto individual y la denominación genérica. En contra de lo que sostienen las teorías genéricas más divulgadas, esas relaciones distan mucho de ser homogéneas. Mientras otros nombres genéricos designan un conjunto de características temático-formales que se manifiestan en forma de marcas textuales, el término Novelle" remite a un modelo ideal, una abstracción que no llega nunca a expresarse por completo en el texto. Lo que comparten las diferentes definiciones clásicas de la Novelle no es por lo tanto el sentido concedido al término genérico, sino el modo de emplearlo. Este uso del término Novelle" pone en entredicho el valor descriptivo de las definiciones clásicas y constituye el auténtico elemento diferencial del género.La investigación parte de este horizonte teórico para plantear distintas cuestiones en torno a la historicidad de la Novelle. Ante la dificultad de fijar un criterio regulador que oriente el uso del término genérico se opta por recurrir a los textos que la tradición ha querido contemplar como realización ejemplar del género. Entre ellos figura La fuerza de la sangre de Cervantes, novela que conoce diversas versiones en la literatura alemana del XIX. El cotejo entre el original cervantino y las variantes alemanas permite mostrar cómo los textos ejemplares orientan la proyección del modelo ideal al que remite el término genérico. / The 19 century theory of the "Novelle" comes down to a group of fragmentary and contradictory testimonies from wich it is impossible to infer a coherent and final definition of the genre. The author advocates, nevetherless, for the existence of a common element shared by the different theoretical contributions of this period wich is evident, not in the sense atributed to the generic term, but rather to the way of making use of it. In the main theoretical approaches of the 19 century, the term "Novelle" designates simultaneously the artistic ideal according to wich every author encodes the ultimate objective of the genre and a type closer to the reality of the narrative production of his time. This use of the generic term deprives the classical definitions of all their descriptive function and constitutes the genuine differential element of the Novelle regarding the traditionaly called "historical genres".

Hipótesis: para la generación eficiente de tolerancia central, los repertorios de péptidos presentados por MHC en el timo debería reflejar el total del proteoma del organismo. Por lo tanto, la transcripción de antígenos periféricos en timo debería corresponder con la presentación de péptidos de estos antígenos. Diferencias cuantitativas o cualitativas entre los péptidos presentados en el timo y en la periferia pueden constituir un factor desencadenante de autoinmunidad. Por tanto, para mantener la tolerancia, los péptidos más abundantes a nivel periférico deberían encontrarse también en el timo. El trabajo presentado en la tesis describe por primera vez el repertorio peptídico asociado a HLA-DR en timo, órgano linfoide primario donde se genera el repertorio de linfocitos T maduros, y en bazo, órgano linfoide secundario donde se centra la respuesta inmunitaria a antígenos de la sangre. Ambos repertorios están enriquecidos en péptidos derivados de proteínas ubicuas, abundantes en los estromas de cada tejido. Por norma general se presenta una única región de cada proteína, en detrimento del resto de la secuencia (immunodominancia). El estudio comparativo entre tejidos con idéntico tipaje para HLA-DR demostró que los péptidos procedentes de proteínas compartidas proceden de la misma región inmunodominante, lo que sugiere que estos péptidos tolerizados en timo son presentados a nivel periférico para el mantenimiento de la homeostasis. Mediante una metodología de predicción de afinidad de los péptidos asociados a HLA-DR desarrollada en el laboratorio, hemos descrito que los repertorios peptídicos presentados en timo y bazo están compuestos mayoritariamente por ligandos con una alta afinidad hacia las moléculas de DR que la presentan. En comparación con estos repertorios, los péptidos presentados por un tejido autoinmune humano presentan un alto porcentaje de péptidos de baja y media afinidad. A su vez, se han identificado por primera vez dos péptidos derivados de antígenos periféricos presentados por HLA-DR en timos humanos. Estos péptidos proceden de proteínas que son diana de enfermedades autoinmunes humanas. La expresión génica de ambas proteínas se limita a las células del epitelio medular tímico y se asocian de forma diferente al gen AIRE, considerado como el factor de transcripción más importante en la inducción de tolerancia frente a antígenos restringidos de tejido. Muestras y metodología: en colaboración con el Hospital de la Vall d’Hebron y el servicio de trasplantes de la Corporació Sanitària Clínic, se obtuvieron y analizaron 6 muestras de timo procedentes de donantes pediátricos y 4 muestras de bazo de donantes cadavéricos sin patologías autoinmunes descritas en su historial médico. Las moléculas HLA-DR se purificaron y los péptidos se eluyeron en medio ácido. El repertorio fue analizado utilizando espectrometría de masas de alta resolución en colaboración con el laboratorio de proteómica del CSIC-UAB. / Hypothesis: As for the efficient generation of central tolerance, thymus MHC-presented peptide repertoire should reflect the whole organism proteome. Therefore, peripheral antigen transcription in the thymus should correspond with the presentation of these peptides. Quantitative or qualitative differences between the peptides presented in the thymus and in the periphery may be a trigger for autoimmunity. Thus, to maintain the tolerance, the most abundant peptides in the periphery should be found also in the thymus. The work presented in the thesis describes for the first time the peptide repertoire associated with HLA-DR in the thymus, the primary lymphoid organ where the mature T cell repertoire is generated, and in the spleen, a secondary lymphoid organ where it is focused the immune response to blood antigens. Both repertoires are enriched in peptides derived from ubiquitous proteins, which are abundant in the stroma of every tissue. As a general rule, a single region of each protein is presented at the expense of the rest of the sequence (immunodominance). The comparative study with identical tissue typing for HLA-DR showed that the peptides from shared proteins came from the same immunodominant region, suggesting that these peptides, previously tolerized in the thymus, are presented in the periphery for the maintenance of the homeostasis. An affinity prediction methodology for HLA.DR-associated peptides has been developed in the laboratory. Using this methodology, we have described that peptide repertoires presented in the thymus and the spleen are mainly composed of ligands with high affinity for the DR molecules that present them. Compared to these repertoires, the peptides presented by human autoimmune tissue have a high percentage of low and medium affinity peptides. For the first time, it has been identified two peptides derived from peripheral tissue presented by HLA-DR in human thymi. These peptides derived from proteins that are targets of human autoimmune diseases. Gene expression of both proteins is restricted to thymic medullary epithelia and they associate differently to AIRE gene, which is considered as the most important transcription factor in the induction of tolerance to tissue-restricted antigens. Samples and methodology: in collaboration with the Hospital Vall d'Hebron and the service of the transplants from the Corporació Sanitària Clínic, we obtained and analyzed six thymic samples from pediatric donors and 4 spleen samples from cadavers without autoimmune pathologies described in their medical record. HLA-DR molecules were purified and the peptides were eluted in acid medium. The repertoire was analyzed using high resolution mass spectrometry in collaboration with the proteomics laboratory from CSIC-UAB.

El plom s’ha emprat per a múltiples propòsits durant segles (canalitzacions d’aigua, pintures, bateries, etc.). Actualment, degut a la seva toxicitat i al seu caràcter bioacumulatiu, el seu ús es troba en recessió. No obstant, degut a la seva gran persistència en el medi, aquest encara es pot trobar en quantitats apreciables. La present tesi té com a objectiu principal proporcionar la informació i/o les eines necessàries per tal de conèixer si es compleix amb la legislació vigent referent a la concentració de plom en diferents medis. Aquesta tesi es divideix en dos blocs principals. Al primer bloc es monitoritza la contaminació per plom en l’aigua de consum i en sòls emprant bàsicament les tècniques analítiques clàssiques. La contaminació de l’aigua per plom és una problemàtica existent encara en algunes llars degut a l’existència de canonades de plom com a sistema de distribució domiciliaria d’aigua. En aquesta tesi, i sota un conveni de col·laboració amb l’empresa Societat d’Aigües de Barcelona i Adasa Sistemas, es dissenya i optimitza un sistema automàtic emprant l’extracció en fase sòlida i es proposa un protocol de mostreig per avaluar la ingesta de plom per l’aigua de consum seguint els requeriments de la directiva 98/83/CE. Per altre banda, s’avalua la lixiviació del plom en una canonada nova per a estudiar la ingesta de plom que es va fer en un passat per aquesta via. Una breu introducció com la descripció del desenvolupament, la caracterització i la validació de l’equip es presenten en el capítol 3. La contaminació, aquest cop en el sòl, es presenta en zones properes a la indústria metal·lúrgica. Aquesta situació queda exemplificada en aquesta tesi en el cas de la ciutat de Torreón (Mèxic). Així, en el marc d’un conveni de col·laboració amb l’empresa Met-Mex Peñoles, es monitoritza de forma periòdica (2000-2013) aquesta zona i s’avaluen les accions dutes a terme per l’empresa per tal de minimitzar les fuites fugitives i remeiar la zona afectada. La informació relativa a aquest estudi es troba al capítol 4. Degut als inconvenients (retràs en la informació, cost econòmic elevat, només operatives en ambients controlats) que presenten les tècniques analítiques clàssiques alhora de satisfer la gran demanda d’informació que seria desitjable per a la monitorització ambiental, l’objectiu del segon bloc es buscar alternatives que solucionin/minimitzen aquests inconvenients. Així, es desenvolupen sistemes de cribatge emprant sensors electroquímics (potenciomètrics i voltamperomètrics) com a sistemes de detecció tot aprofitant les avantatges que proporcionen les noves tecnologies de miniaturització. Aquests sistemes s’han desenvolupat per a ser operatius tant en condicions de flux continu com en condicions discretes (batch). Per aconseguir aquest objectiu, al capítol 5 s’avaluen diferents elèctrodes selectius de plom (comercials, sinteritzats en el Grup de Recerca), diferents transductors conductors sòlids compatibles amb la tecnologia de microfabricació LTCC (serigrafiats, modificats sota diferents condicions d’electrodeposició) i s’optimitza la configuració de la cel·la de detecció per a microsistemes de flux. Al capítol 6 s’avaluen diferents materials d’elèctrodes, alguns d’ells obtinguts per tecnologia microelectrònica, com a sensors voltamperomètrics per a la determinació de plom. / Lead has been used for multiple purposes during centuries (water pipes, paint, batteries, etc.). Currently, due to their toxicity and their bioaccumulative nature, its use is in recession. However, due to its high persistence in the environment, it can still be found in significant amounts in the environment and water sources. The main objective of the present work is to provide tools and/or information necessary to ascertain whether the legislation relating to the concentration of lead in different media is complied. This thesis is divided into two main parts. The first is the monitoring of lead contamination in drinking water and soils, basically using classical analytical techniques. Water pollution by lead is a problem that still exists in some households due to the presence of old lead pipes as domiciliary water distribution system. In this thesis, and under a contract agreement with the companies Societat d’Aigües de Barcelona and Adasa Sistemas, an automated system based on solid phase extraction is designed and optimized and a protocol to assess the sampling intake of lead for drinking water is proposed, following the requirements of Directive 98/83/EC. On the other hand, in order to assess the ingestion of lead during the use of a pipe, a study of the lead leaching of a new lead pipe has been done. A brief introduction on this field and the description of the development, characterization and validation of the equipment are presented in Chapter 3. On the other hand, soil pollution usually appears in areas close to metallurgical industry. This situation is exemplified in this thesis in the case of the city of Torreon (Mexico). Thus, in the framework of a cooperation agreement with the company Met-Mex Peñoles, the area near the company is monitored periodically during years (2000-2013) in order to evaluate the actions taken by the company to minimize fugitive emissions and leaks and to remediate the affected area. The information on this study can be found in Chapter 4. Due to the problems (information delay, high cost, and operability only in controlled environments) that classical analytical techniques present to meet the desired high information demands for environmental monitoring, the main goal of the second part of this thesis is focused into finding alternatives to solve/minimize these drawbacks. Thus, screening systems have been developed using electrochemical sensors (potentiometric and voltammetric) as detection systems, while taking advantage of the features that miniaturization technologies can offer. These systems have been developed to operate in both continuous flow and discrete (batch) conditions. To achieve this goal, different selective lead electrodes (commercial and synthesized in the GSB research group) as well as various solid conductor transducers, compatible with the microfabrication technology and the LTCC technology (screen printed, modified under different electroplating conditions) have been evaluated. Moreover, the configuration of the detection cell in microfluidic systems has been optimized. All this information is detailed in Chapter 5. After that, different electrode materials, some of them obtained by microelectronics (for instance voltammetric sensors) have been tested for lead determination. All this work is described in Chapter 6.

La presència de metalls de transició a la natura no ve donada per la mà de l’home. De fet, les propietats electròniques i estructurals d’aquestes peces centrals de la taula periòdica són clau per la regulació dels processos biològics tals com el transport d’oxigen en animals o la fotosíntesi a les plantes. Les àrees de la farmacologia, la química, la medicina i la biotecnologia han après les lliçons d’organometàl·lica impartides per la natura, fent evolucionar la seva recerca cap a processos més específics. En aquesta tesi, titulada “Predicció d’interaccions biometàl·liques: reptes i aplicacions” (“Prediction of biometallic interactions: challenges and applications”), s’han centrat tots els esforços per descriure els diferents efectes estructurals i electrònics del acoblament d’un compost organometàl·lic sobre un sistema biològic (ADN, proteïnes i pèptids) aplicant tècniques de modelització molecular. Existeix un gran ventall de tècniques de modelització molecular. Escollir una o altre no només depèn del sistema sobre el qual s’ha d’aplicar, sinó que també s’ha de tenir en compte la interacció química que succeeix. Bàsicament, les tècniques de modelització molecular es poden dividir en dos: aquelles basades en els principis de la mecànica quàntica i les que es descriuen segons els fonaments de la mecànica molecular. Els mètodes de mecànica quàntica son capaços de descriure de forma precisa els efectes electrònics dels metalls, però consumeixen més temps de computació que els de mecànica molecular, essent aquests la millor opció per estudiar sistemes grans. Aquesta tesi està composta per quatre capítols de resultats que mostren la feina feta durant els últims anys dedicats a la recerca. En tots quatre s’han fet servir diferents tècniques de modelització molecular per estudiar diferents processos químics i biològics que involucren la participació de metalls de transició. En aquests capítols s’ha investigat en 1) l’ús de tècniques d’acoblament proteïna-lligand fent servir lligands organometàl·lics, 2) la descripció de l’estat de repòs i del procés d’activació d’un metal·loenzim artificial fent servir el mètode híbrid de Mecànica Quàntica/Mecànica Molecular, 3) l’estudi dels efectes a curt i llarg abast de la coordinació de cisplatí en ADN i proteïnes combinant les tècniques de mecànica quàntica i anàlisi de modes normals, i 4) en les idees inicials sobre la formació enantioselectiva de metal·lopèptids artificials combinant coneixements teòrics i experimentals. Escollir la millor tècnica a cada punt va ser la clau per descriure el sistema químic i descriure el corresponent procés biològic de forma satisfactòria. / The presence of transition metals in nature is not a man-made fact. In fact, the structural and electronic properties provided by that particular pieces of the periodic table are key in the regulation of biological processes such as the oxygen transport in animals or the photosynthesis in plants. Pharmacology, chemistry, medicine and biotechnological fields learned the lessons of organometallic chemistry given by Nature, evolving their research to more specific processes. In this thesis, titled “Prediction of biometallic interactions: challenges and applications”, all the efforts have been focused in the description of the structural and electronic effects of the binding of an organometallic compound to a biological host (DNA, proteins and peptides), by the application of molecular modelling techniques. The molecular modeller’s toolbox includes a huge variety of methods to choose. The election of one of other not only depends on the system where it has to be applied, but also the chemical interaction is an important variable to take into account. Molecular modelling techniques can be divided in two fields: those based in the principles of quantum mechanics, and the other which are described using the fundamentals of molecular mechanics. Quantum mechanics methods accurately describes the electronic effect of the metal, but are more time consuming that molecular mechanics ones, which are the best option to study large systems. This thesis is composed by four chapters presenting the results obtained during the last years of research. In all four, different chemical and biological processes involving the interaction of transition metals and biological hosts have been studied using different computational tools. In these chapters we investigated on 1) the use of protein-ligand docking with organometallic ligands, 2) the description of the resting state and activation process of an artificial metalloenzyme using the hybrid Quantum Mechanics/Molecular Mechanics approach, 3) the study of the short and long range effects of the coordination of cisplatin in DNA and proteins mixing Quantum Mechanics and Normal Mode Analysis, and 4) on the clues on the enantioselective formation of artificial metallopeptides combining theoretical and experimental knowledge. The election of the best technique at each stage of research was key to describe the chemical system and succeed on the description of the involved biological process.

Las investigaciones recogidas en esta memoria versan sobre el desarrollo de nuevos materiales y membranas con propiedades mejoradas preparados mediante la técnica de Reactivos Incorporados en Fase Sólida (Solid-Phase Incorporated Reagents, SPHINER.). Esta técnica se basa en la incorporación de reactivos en una fase sólida mediante diferentes procedimientos como un primer paso para la preparación de materiales compuestos. Por este medio, se han preparado Membranas Compuesta Activadas (Activated Composite Membranes, ACM) con ácido di-(2-etilhexil)ditiofosfórico como transportador de iones metálicos. Este tipo de membranas son membranas bicapa formadas por un soporte microporoso de polisulfona y una capa densa y delgada de poliamida en la parte superior. En el interior se atrapa el reactivo incorporado que es capaz de formar complejos estables con los metales de interés. En este sentido, las ACM han demostrado su capacidad para el transporte selectivo y efectivo de varios iones metálicos como cinc, cadmio, bismuto, cobre, estaño e indio. A partir de los datos recogidos en el transcurso de las investigaciones, se ha confeccionado un modelo semicuantitativo para predecir el flujo de los iones en un sistema específico en la función de las constantes de equilibrio de las especies implicadas. Además, se ha realizado una caracterización morfológica exhaustiva para asociar los parámetros estructurales de la membrana con sus propiedades de transporte. Esta caracterización ha revelado que la formación de la capa de poliamida sobre soportes de polisulfona comercial produce unas membranas poco satisfactorias sin las propiedades de transporte requeridas. Además, se han preparado nuevos materiales que incorporan en su interior nanopartículas metálicas (Metal Nanoparticles, MNP) mediante el procedimiento de síntesis intermatricial tanto en polímeros funcionalizados como no funcionalizados. De esta manera se ha logrado sintetizar nanopartículas metálicas macizas y también nanopartículas mixtas con estructura "core-shell". Las nanopartículas formadas han sido caracterizadas por diferentes técnicas microscópicas para saber su tamaño, su distribución y su grado cristalino. Todos los parámetros determinados han sido considerados satisfactorios. Finalmente, los nanoobjetos desarrollados han sido incorporados como membranas sensoras en sensores amperométricos y, como resultado, su eficiencia ha aumentado considerablemente. / The research reported in this is memory deals with the development of new membranes and materials with enhanced properties prepared by using the SPHINER technique. This technique consists in the incorporation of reagents in solid phase as a first step to prepare composite materials. By these means, Activated Composite Membranes (ACM) containing di(2-ethylhexyl) dithiophosphoric acid as a carrier have been prepared. This type of membrane are bilayer membranes with a microporous support of polysulfone and a thin dense layer of polyamide in the top. Inside, the incorporated reagent is an extracting agent capable to complex metal ions of interest. The ACM have demonstrated their capacity to selective and effective transport several metal ions such as zinc, cadmium, bismuth, copper, tin and indium. From the data collected in the course of the investigations, a semiquantitative model has been obtained to predict the ion flux for a specific system in function of the equilibrium constant of the involved spices. Moreover, an exhaustive morphological characterization has been carried out in order to link the membrane structure parameters with their transport properties. This characterization has revealed that the formation of the polyamide layer onto commercial polysulfone supports yields to an unsatisfactory composite membranes without transport properties. In addition, new materials containing metal nanoparticles (MNP) have been prepared by inter-matrix synthesis in both functionalized and non-functionalized polymers that behave as synthetic nanoreactors. It has been possible to synthesise bulk metal nanoparticles and core-shell ones. The formed nanoparticles have been characterized by microscopic techniques in order to know their size, distribution, and crystalline degree. All the parameters have been found satisfactory. In addition, the developed nanoobjects have been incorporated in the sensing membranes of amperometric sensors and, as a results, their efficiency has increased considerably.