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O crescimento de plantas, órgãos, tecidos e células in vitro depende do desenvolvimento de meios de cultura otimizados para a perfeita interação de componentes essenciais como fitorreguladores, fonte de carbono e nutrientes minerais. Os fatores que limitam o crescimento de órgãos ou tecido in vitro são similares a aqueles que limitam o crescimento in vivo. Com o objetivo de testar a influência do estado nutricional de plantas matrizes de cenoura Daucus carota Link em potássio na morfogênese in vitro, plantas obtidas de sementes germinadas em substrato e cultivadas em vasos com areia em condições de casa de vegetação, foram submetidas a tratamentos com soluções nutritivas contendo variáveis níveis de potássio. Decorridos 30 e 60 dias de tratamento, explantes dessas plantas (internódios) foram coletados, desinfetados e inoculados em meio de cultura sólido de MS contendo também diferentes concentrações de potássio e acrescido de 0,1mg.L -1 da auxina 2,4-D buscando indução de calogênese na ausência de luz. Diferenciação celular via embriogênese somática foi conseguida em ausência de auxina em condições de fotoperíodo de 16/8 horas (claro/escuro). A avaliação da calogênese foi feita aos 60 dias após a inoculação, com base na massa de matéria fresca e seca dos calos formados por explante. A avaliação da diferenciação celular (número de plantas/explante) e taxa de diferenciação celular (número de plantas/g de matéria seca de calos) foi realizada após 30 dias de cultivo em condições de luz. A indução de calogênese e crescimento celular nos explantes de matrizes tratadas foi influenciada pelo tratamento pelos níveis de K + na solução nutritiva e pela duração dos tratamentos. Explantes de matrizes tratadas com alta concentração de K + resultaram em indução e crescimento de calos em matéria fresca e seca inversamente proporcional à concentração de K + no meio de cultura tanto para tratamento por 30 dias como para 60 dias. Tratamentos de curta duração (30 dias) com altos níveis de K + nas soluções nutritivas e baixos níveis de K + no meio de cultura influenciaram negativamente a regeneração de plantas (nº plantas/explante) nos calos dos explantes das matrizes tratadas. No entanto, taxas mais altas de diferenciação celular (nº plantas/g de matéria seca de calos) ocorreram nos calos de explantes de matrizes tratadas por 30 dias com solução nutritiva contendo maiores níveis de potássio e inoculados em meio de cultura contendo concentrações iguais ou maiores de que a do meio MS. / The growth of plants, organs, tissues and cells in vitro culture depends on the development of optimized culture medium for the perfect interaction among essential components such as phytoregulators, carbon source and minerals nutrients. The factors limiting the growth of organs or tissues in vitro conditions are similar to those limiting growth in vivo conditions. The objective of this work was aimed at studying the influence of the potassium nutritional status of matrixes plants of carrot Daucus carota Link on the in vitro morphogenesis. Matrixes plants were obtained from seeds germinated in organic substratum and cultivated in plastic pots containing washed sand in greenhouse conditions. The matrixes plants were then submitted to treatments with nutrients solutions containing variable potassium levels. After 30 and 60 days treatment, explants (internodes) were collected, disinfested and inoculated in solid culture medium of Murashige and Skoog (MS) containing different potassium concentrations and supplemented with 0,1mg.L -1 of 2,4-D for callogenesis induction in dark conditions. Cell differentiation by somatic embryogenesis was pursued by culturing the calli in auxina-free same culture medium in growth room under photoperiod of 16/8 hours (light/dark). The evaluation of the callogenesis induction and cell growth was carried out 60 days after explants inoculation, based on the mass of fresh and dry matter accumulation on each explant. The evaluation of cell differentiation (plant formed/explant) and of cell differentiation rate (number of plants formed/g of dry matter of callus) was carried after 30 days of culturing under light conditions. Callogenesis induction and cell growth on the explants of treated matrixes plants were affected by the potassium treatment levels in the nutrient solution and by the duration of the treatments. Explants from treated plants with the higher K + concentrations showed callus induction and growth inversely proportional to the concentration of K + in the culture medium for both (30 and 60 days) treatment duration. However the callogenesis accumulated after 60 days treatment was twice as much as that of 30 days treatments. Short time treatments duration (30 days) with higher levels of K + in the nutrient solutions and low concentrations of K + in the culture medium influenced the cell differentiation negatively (nº plants/explant) in the callus of the explants from treated plants. Cells from calli induced on explants from matrixes plants for 30 days were more morphogenic than the cells in the 60 days treatment where high callogenesis was observed. Also better cell differentiation rate was observed on calli induced on explants from treated matrixes plants with nutrient solutions containing the highest potassium levels and inoculated on MS culture medium containing highest potassium concentrations.

Human tissue banks are a potential source of cellular material for the emerging cellbased therapy industry; umbilical cord tissue (UCT) private banking is increasing in such facilities as a source of mesenchymal stem cells for future therapeutic use. However, early handling of UCT is relatively uncontrolled due to the clinical demands of the birth environment and subsequent transport logistics. It is therefore necessary to develop extraction methods that are robust to real world operating conditions,rather than idealised operation. This will be critical for all processes using primary tissue or cell sources. The research work undertaken in this PhD project was initiated by the collaboration with one of the leading private cord blood banks in the UK and later driven by the prospect of expanding the cell therapy and business potential of the bank. The investigation described in this thesis has focused on: - Developing an extraction method for human mesencymal stem cells (hMSCs) from UCT. - Understanding and minimizing the noticed variability in cell yield extracted from UCT by mapping the operating environment and assessing the risk factors before empirically determining their effect on the process. - Establishing the necessary process controls in the production of high quality hMSCs, through a series of wet experiments, targeted at narrowing down the sources of variability down to sub-process level. - Finding a novel method for assessing the cell content and viability of cords prior to processing. Therefore, helping the tissue processing facility to predict the risk of suboptimal cell yield from a given cord tissue section and processing method, given different operating ranges. - Determining the tissue storage requirements and isolation method with acceptable risk of adequate cell recovery. - Characterization of cells extracted from UCT via different extraction methods and comparison to primary cells extracted from other tissue sources. - Investigation of cryopreservation method for UCT. The result of this work provides a solid example of the type of data and analysis that will be required to inform a Quality-by-Design type approach for cell product development and manufacture. It will help tissue processing facilities and banks to predict the probability of cell yields from tissue sections given different operating ranges, and to aid and inform the experimental approach of others.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-06-21T15:10:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_camila_fernanda_junkes.pdf: 1289430 bytes, checksum: c3ed40aa6f1d8b5187b0894e8ea77b9b (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-06-21T18:58:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_camila_fernanda_junkes.pdf: 1289430 bytes, checksum: c3ed40aa6f1d8b5187b0894e8ea77b9b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-21T18:58:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_camila_fernanda_junkes.pdf: 1289430 bytes, checksum: c3ed40aa6f1d8b5187b0894e8ea77b9b (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / A macieira é uma frutífera lenhosa amplamente difundida no mundo. Suas mudas são propagadas por estaquia e os porta-enxertos por mergulhia de cepa devido ao alto grau de incompatibilidade entre os genótipos e grande período de juvenilidade. Os porta-enxertos conferem diferenças no vigor e resistência a doenças à cultivar copa, sendo mais utilizadas no Brasil as cultivares M.9 (anão) e ‘Marubakaido’ (vigoroso). Devido a problemas fitossanitários e de rendimento da técnica de propagação vegetativa, a micropropagação surge como uma tecnologia útil tanto a nível de pesquisa quanto a nível comercial. No entanto, cada genótipo de macieira responde de forma diferente aos estímulos in vitro, de forma que deve-se adequar os protocolos em função da cultivar em estudo. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo traçar os primeiros estudos sobre a utilização de sistema de imersão temporária (SIT) na micropropagação de ‘Marubakaido’. Para tal, testes preliminares sobre a influência do tipo de explante (apical ou axilar) foram realizados via sistema convencional em três variações do meio MS (composição convencional; NH4NO3 e KNO3 reduzido a ¾; e formulação industrial Himedia) suplementados com 0,8 mg.L-1 de BAP, 100 mg.L-1 de mio-inositol, 30 g.L-1 de sacarose e 7 g.L-1 de ágar. Após 45 dias observou-se que o meio Himedia conferiu maior homogeneidade entre as brotações, enquanto o tipo de explante não afetou a resposta quanto ao número e comprimento médio das brotações obtidas, podendo ambos serem utilizados sem prejuízo às taxas de multiplicação. Em seguida, os mesmos meios foram empregados na comparação entre micropropagação de explantes axilares de ‘Marubakaido’ em sistema convencional e SIT. Após 4 semanas verificou-se que as taxas de hiperidricidade obtidas em SIT foram muito mais elevadas do que em sistema convencional, chegando a 100% para meio MS. Uma intensa formação de calos foi observada nos meios MS e MS ¾ neste mesmo sistema, que impediram o desenvolvimento dos explantes. Quanto ao número médio e comprimento de brotações, o meio Himedia em SIT apresentou melhores resultados quando comparado a todos os tratamentos para meio e sistema (6,3 brotações por explante e 3,7 cm). O enraizamento das brotações produzidas em SIT com meio Himedia foi maior quando as brotações foram destacadas se comparadas com brotações mantidas em tufos (74,1% e 62,5% respectivamente), e a aclimatização das microestacas enraizadas resultou em 88,5% de sobrevivência após 21 dias. Embora os resultados tenham sido promissores, novos estudos ainda precisam ser realizados na tentativa de aperfeiçoar estes protocolos para ‘Marubakaido’, como alterações na composição hormonal, tempo e frequência de passagem do meio para os explantes ou enraizamento ao abrigo de luz. / The apple tree is a woody fruit widespread in the world. Your plants are propagated by cuttings and rootstocks by layering strain due to the high level of incompatibility between the genotypes and great period of juvenility. Rootstocks confer differences in vigor and disease resistance to scion, being more used in Brazil the cultivars M.9 (dwarf) and 'Marubakaido' (vigorous). Due to phytosanitary problems and yield of vegetative propagation technique, micropropagation appears as a useful technology at level of research or commercially. However, each apple genotype responds differently to in vitro stimuli, so the protocols must be adapted according to cultivar in study. Herewith, the present research aimed to draw the first studies about the use of temporary immersion system (TIS) in ‘Marubakaido's micropropagation. For this purpose, preliminary tests about the influence of the type of explant (apical or axillary) were performed via conventional system in three variations of the MS media (conventional composition; NH4NO3 and KNO3 reduced to ¾, and industrial formulation Himedia) supplemented with 0.8 mg.L-1 BAP, 100 mg L-1 myo-inositol, 30 g L-1 sucrose and 7 g L-1 agar. After 45 days it was observed that the Himedia conferred greater homogeneity among the shoots, while the type of explant did not affect the response in the average of number and length of shoots obtained, and both can be used without prejudice to the multiplication rates. Then, the same media were used in the comparison of micropropagation of ‘Marubakaido’ axillary explants between conventional system and TIS. After 4 weeks it was found that the hyperhydricity rates obtained with TIS were much higher than in conventional system, reaching 100% at MS medium. An intense callus formation was observed in MS and MS ¾ media at same system, which stopped the development of the explants. For the mean of number and length shoots, the Himedia composition in TIS showed better results when compared to all treatments for media and system (6.3 shoots per explant and 3.7 cm). Rooting of shoots produced in TIS with Himedia was higher when the shoots were separated compared with shoots kept in tufts (74.1% and 62.5% respectively), and acclimatization of the rooted microcutting resulted in 88.5% of survival after 21 days. Although the results have been promising, further studies still need to be performed to improve these protocols to ‘Marubakaido’, as changes in hormonal composition, time and frequency for passage of media to the explants or rooting under darkness.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:54:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaKOA_DISSERT.pdf: 1986200 bytes, checksum: d86826aeca9a3190905fe12b68562cd9 (MD5) Previous issue date: 2010-02-25 / The anthropical action caused destruction of great part of the Atlantic forest remaining today around 7% to 8% of the original portion. A classical example of the degradation is the situation of the Pau-Brasil (Caesalpinia echinata Lam.) which appellant exploration summarized abruptly decreased the wild occurrence of the species. Besides the economic exploration and the threat of extinction, the plant shows some characteristics that its own physiology makes difficult the survival in natural conditions. For this reason, any strategy developed to conserve it should also guarantee ways for its multiplication. In these conditions, the only reasonable technology is micropropagation in vitro based on immature segments of Catullus (explants or internodes). However, in virtue of the threat of extinction, extractivism and fenology, the disponibility of the sources of explants are reduced. Then, to turn this around, the present research showed the hypothesis that arrange these explants would have as a solution to elaborate a bank of matrixes and the utilization of produced seedlings as source of explant. Then, assuming that the soil is a fundamental element for a good formation of the seedlings, there were tests in a greenhouse on the Laboratory of plant biotechnology at UFRN, from May to June of 2008 that showed the influence of the four different soils on the production of Pau-Brasil. The objective of this work was to make possible the seedlings production of the specie and from them to establish a bank of matrixes as source of explant to guarantee the continuity of the process of micropropagation, contributing with the preservation of the specie / A a??o antr?pica causou a destrui??o de grande parte da Mata Atl?ntica restando hoje apenas cerca de 7% a 8% da sua por??o original. Um exemplo cl?ssico dessa degrada??o ? a situa??o do Pau-Brasil (Caesalpinia echinata Lam.) cuja explora??o recorrente resumiu drasticamente a ocorr?ncia silvestre da esp?cie. Al?m da explora??o econ?mica e da amea?ada de extin??o, a planta apresenta ainda caracter?sticas de sua pr?pria fisiologia que dificultam a sobreviv?ncia em condi??es naturais. Por esse motivo, qualquer estrat?gia desenvolvida para conserv?-la deve tamb?m garantir meios para sua multiplica??o. Nessas condi??es, a ?nica tecnologia plaus?vel ? a micropropaga??o in vitro a partir de segmentos imaturos de caule (os explantes). Entretanto, em virtude da amea?a de extin??o, do extrativismo e da fenologia, a disponibilidade das fontes de explante ? reduzida. Ent?o, para contornar esse contratempo, a presente pesquisa trabalhou a hip?tese de que para dispor desses explantes a solu??o seria elaborar um banco de matrizes e utilizar as mudas produzidas como fonte de explante. Ent?o, partindo do pressuposto de que o substrato ? um elemento fundamental para boa forma??o de mudas, testou-se em casa de vegeta??o do Laborat?rio de Biotecnologia Vegetal da UFRN, no per?odo de maio a junho de 2008, a influ?ncia de quatro diferentes substratos sobre a produ??o plantas de Pau-Brasil. O objetivo aqui foi viabilizar a produ??o de mudas da esp?cie e a partir das mesmas estabelecer um matrizeiro como fonte de explante para garantir a continuidade do processo de micropropaga??o, contribuindo assim com a preserva??o da esp?cie

La richesse de la peau en cellules présentatrices d'antigènes fait de ce tissu un site prometteur pour la vaccination. Des différences dans les réponses humorales et cellulaires induites par voie transcutanée et intradermique, en comparaison des voies conventionnelles, sont observées in vivo chez l'Homme. Ces observations mettent en évidence la mauvaise compréhension des mécanismes immunitaires induits dans la peau. Un modèle ex vivo d'explant de peau humaine nous a permis d'étudier les évènements précoces de l'immunité innée induits suite à l'administration d'un antigène par voie cutanée. Nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme induit en réponse à une stimulation par des agonistes de TLRs. Nous montrons que la production de la cytokine IL- 32 par les kératinocytes contribue à l'activation des cellules de Langerhans. Une analyse protéomique des modifications induites dans le micro-environnement cutané, suite à l'administration intradermique d'un vaccin Influenza, nous a permis d'établir une signature de la réponse inflammatoire cutanée. Nous observons l'expression de protéines impliquées dans l'immunité cutanée mais également dans l'adhésion cellulaire, le métabolisme des glucides et des lipides. Enfin, nous avons observé la capacité de la méthode de rupture de la barrière cutanée « Cyanoacrylate Skin Surface Stripping » (CSSS), utilisée par la voie transcutanée, à induire la surexpression de cytokines et chimiokines cruciales pour la mise en place d'une réponse immunitaire cutanée. Ces données sont importantes pour l'amélioration de la compréhension des mécanismes immunitaires induits dans la peau et pour la mise en place de nouvelles stratégies vaccinales. / Skin richness in immune cells in antigen presenting cells make the skin a promising site for vaccination strategies. Differences in humoral and cellular responses induced in vivo were observed in humans, between studies using intradermal and transcutaneous vaccine administration compared to conventional routes. Theses results highlight that immune molecular mechanism induced in the skin remains poorly understood. An ex vivo human skin explant model was used to analyze early immune events induced after cutaneous antigen administration. We have demonstrated, for the first time, the role of IL-32 produced by keratinocytes in Langerhans cell activation, after TLRs agonists skin cells stimulation. A proteomic analysis of modifications induced in skin microenvironment, after intradermal Influenza vaccine administration, showed the detection of new protein biomarkers from cells adhesion signalling and carbohydrates and lipids metabolism associated with known protein biomarkers from cutaneous inflammatory. In addition, we have observed the ability of the Cyanoacrylate Skin Surface Stripping (CSSS) method, a mild skin disruption method, to promote cytokines and chemokines overexpression by epidermal cells, which are crucial in cutaneous immune response establishment. Theses results allow the better comprehension in immune molecular and cellular mechanism induced in the skin and the development of new vaccination strategies.

O crescimento de plantas, órgãos, tecidos e células in vitro depende do desenvolvimento de meios de cultura otimizados para a perfeita interação de componentes essenciais como fitorreguladores, fonte de carbono e nutrientes minerais. Os fatores que limitam o crescimento de órgãos ou tecido in vitro são similares a aqueles que limitam o crescimento in vivo. Com o objetivo de testar a influência do estado nutricional de plantas matrizes de cenoura Daucus carota Link em potássio na morfogênese in vitro, plantas obtidas de sementes germinadas em substrato e cultivadas em vasos com areia em condições de casa de vegetação, foram submetidas a tratamentos com soluções nutritivas contendo variáveis níveis de potássio. Decorridos 30 e 60 dias de tratamento, explantes dessas plantas (internódios) foram coletados, desinfetados e inoculados em meio de cultura sólido de MS contendo também diferentes concentrações de potássio e acrescido de 0,1mg.L -1 da auxina 2,4-D buscando indução de calogênese na ausência de luz. Diferenciação celular via embriogênese somática foi conseguida em ausência de auxina em condições de fotoperíodo de 16/8 horas (claro/escuro). A avaliação da calogênese foi feita aos 60 dias após a inoculação, com base na massa de matéria fresca e seca dos calos formados por explante. A avaliação da diferenciação celular (número de plantas/explante) e taxa de diferenciação celular (número de plantas/g de matéria seca de calos) foi realizada após 30 dias de cultivo em condições de luz. A indução de calogênese e crescimento celular nos explantes de matrizes tratadas foi influenciada pelo tratamento pelos níveis de K + na solução nutritiva e pela duração dos tratamentos. Explantes de matrizes tratadas com alta concentração de K + resultaram em indução e crescimento de calos em matéria fresca e seca inversamente proporcional à concentração de K + no meio de cultura tanto para tratamento por 30 dias como para 60 dias. Tratamentos de curta duração (30 dias) com altos níveis de K + nas soluções nutritivas e baixos níveis de K + no meio de cultura influenciaram negativamente a regeneração de plantas (nº plantas/explante) nos calos dos explantes das matrizes tratadas. No entanto, taxas mais altas de diferenciação celular (nº plantas/g de matéria seca de calos) ocorreram nos calos de explantes de matrizes tratadas por 30 dias com solução nutritiva contendo maiores níveis de potássio e inoculados em meio de cultura contendo concentrações iguais ou maiores de que a do meio MS. / The growth of plants, organs, tissues and cells in vitro culture depends on the development of optimized culture medium for the perfect interaction among essential components such as phytoregulators, carbon source and minerals nutrients. The factors limiting the growth of organs or tissues in vitro conditions are similar to those limiting growth in vivo conditions. The objective of this work was aimed at studying the influence of the potassium nutritional status of matrixes plants of carrot Daucus carota Link on the in vitro morphogenesis. Matrixes plants were obtained from seeds germinated in organic substratum and cultivated in plastic pots containing washed sand in greenhouse conditions. The matrixes plants were then submitted to treatments with nutrients solutions containing variable potassium levels. After 30 and 60 days treatment, explants (internodes) were collected, disinfested and inoculated in solid culture medium of Murashige and Skoog (MS) containing different potassium concentrations and supplemented with 0,1mg.L -1 of 2,4-D for callogenesis induction in dark conditions. Cell differentiation by somatic embryogenesis was pursued by culturing the calli in auxina-free same culture medium in growth room under photoperiod of 16/8 hours (light/dark). The evaluation of the callogenesis induction and cell growth was carried out 60 days after explants inoculation, based on the mass of fresh and dry matter accumulation on each explant. The evaluation of cell differentiation (plant formed/explant) and of cell differentiation rate (number of plants formed/g of dry matter of callus) was carried after 30 days of culturing under light conditions. Callogenesis induction and cell growth on the explants of treated matrixes plants were affected by the potassium treatment levels in the nutrient solution and by the duration of the treatments. Explants from treated plants with the higher K + concentrations showed callus induction and growth inversely proportional to the concentration of K + in the culture medium for both (30 and 60 days) treatment duration. However the callogenesis accumulated after 60 days treatment was twice as much as that of 30 days treatments. Short time treatments duration (30 days) with higher levels of K + in the nutrient solutions and low concentrations of K + in the culture medium influenced the cell differentiation negatively (nº plants/explant) in the callus of the explants from treated plants. Cells from calli induced on explants from matrixes plants for 30 days were more morphogenic than the cells in the 60 days treatment where high callogenesis was observed. Also better cell differentiation rate was observed on calli induced on explants from treated matrixes plants with nutrient solutions containing the highest potassium levels and inoculated on MS culture medium containing highest potassium concentrations.

Eucalyptus benthamii tem se mostrado especialmente vantajoso como alternativa ao cultivo em regiões frias, justificando esforços para o estabelecimento de protocolos para sua micropropagação. Porém, as matrizes são preferencialmente selecionadas quando adultas (material apresenta menor competência morfogênica), tornando a micropropagação dependente de maior número de subcultivos e maior tempo para se reverter o material ao rejuvenescimento. Assim, a redução das perdas in vitro tem merecido atenção, como por exemplo, as manifestações endofíticas, que exigem maximização da eficiência da cultura e adequações no protocolo, visando minimizá-las, possibilitando melhorar o entendimento das relações estabelecidas e mantidas entre os endófitos e seu hospedeiro durante a micropropagação. Dessa maneira, foram utilizadas minicepas provenientes de duas fontes de miniestacas coletadas a partir do brotamento de gemas epicórmicas de megaestacas da base da copa e de brotamentos do anelamento da base do tronco, de uma matriz de E. benthamii com 13 anos de idade, estabelecidas em minijardim clonal sob condição de casa de vegetação, com o objetivo de avaliar como se dá a multiplicação, sob diferentes condições de cultivo, das duas fontes de explantes (minicepas); analisar se a frequência e intensidade das manifestações endofíticas são afetadas pelas diferentes condições de cultivo; investigar a ocorrência de alterações na comunidade bacteriana endofítica devido à alteração das condições de cultivo e fase da micropropagação (in vivo = minicepas, e in vitro = microcepas, material alongado e enraizado). Visando atender estes objetivos, a pesquisa se dividiu em duas partes. Na primeira (capitulo 3) o desenvolvimento, os aspectos morfofisiológicos, histoquímicos e a manifestação endofítica foram avaliados na multiplicação das duas fontes de explante sob diferentes meios e condições de cultivo. Na segunda (capítulo 4) as comunidades bacterianas endofíticas foram analisadas por meio de PCR-DGGE, baseada na região V6 do gene 16S DNAr. Os resultados mostraram que as microcepas provenientes de megaestaca tiveram melhor desenvolvimento independentemente do tratamento e maior frequência de manifestações endofíticas, comparando-se com as de anelamento. As comunidades bacterinas endofíticas foram distintas entre as amostras in vivo e in vitro, e se alteraram ao longo dos subcultivos e nas amostras alongadas e enraizadas. As diferenças existentes no desenvolvimento das microcepas podem ser inerentes à totipotencialidade do material, mas também podem ser afetadas, tanto pela ocorrência de manifestação, quanto pela comunidade bacteriana endofítica mais ou menos sensível ao processo de micropropagação, auxiliando ou prejudicando o desenvolvimento in vitro de seus hospedeiros. Cabe destacar, ainda, que mesmo em um sistema asséptico e ambientalmente controlado, os microrganismos endofíticos que resistiram a todo processo de desinfestação e cultivo, não estão \"adormecidos\", muito pelo contrário podem se alterar em quantidade à medida que seu hospedeiro é submetido a um novo sistema de cultivo (introdução) ou uma nova fase dentro da micropropagação (multiplicação → alongamento e enraizamnento) ou, ainda, ao longo dos subcultivos. Sendo assim, a complexa rede de relações das plantas com seus endófitos não cessa durante o cultivo in vitro, ao contrário mantém-se dinâmica. / Eucalyptus benthamii has proven to be especially advantageous as an alternative culture in cold regions, justifying efforts to establish protocols for micropropagation. However, the matrices are preferably selected when adults (material with lower morphogenic efficiency), making micropropagation more dependent of subcultures and too longer to reverse the material to rejuvenation. Thus, reduction of losses in vitro has deserved attention, such for example the endophytic manifestations that require the maximization of efficiency culture and adjustments to the Protocol, in order to minimize them, enabling better understanding of the relations established and maintained between endophytes and its host along micropropagation. For this, mini-stumps were used from two sources of mini-cuttings collected from the epicormic shoots of mega-cuttings from the treetop base and shoots from girdling from the trunk base, both of one E. benthamii matrix with 13 years of age established in clonal mini garden under greenhouse condition, aimed to evaluate how is the multiplication of two sources of explants (mini-stumps) under different growing conditions; analyze how the endophytic manifestations frequency and intensity are affected by different conditions; investigate the changes to occurrence in the endophytic bacterial community due to the variation of culture conditions and micropropagation phase (in vivo = mini-stumps, and in vitro = micro-stumps, elongated and rooted materials). In order to meet these objectives, the research was divided in two parts. In the first (chapter 3) the development, morphophysiological aspects, histochemical and endophytic manifestation were evaluated in the multiplication of the two explants sources from different media and culture conditions. In the second (chapter 4) endophytic bacterial communities were analyzed by PCR-DGGE based on the V6 region of 16S rDNA gene. The results showed that micro-stumps from mega-cuttings had better development regardless of treatment and increased frequency of endophytic events, comparing with the girdling. Endophytic bacterial communities were different between samples in vivo and in vitro, and have changed over the subcultures and the elongated and rooted samples. The differences in the development of micro-stumps can be explained by the totipotentiality inherent to the material, but may also be affected by both the manifestation occurrence and the endophytic bacterial community more or less sensitive to the micropropagation, helping or harming the in vitro development of their hosts. We also highlight that even in an aseptic and environmentally controlled system, the endophytic microorganisms that resisted the whole process of disinfection and cultivation, are not \"asleep\", quite the opposite may change in quantity when your host is subjected to a new cultivation system (in vitro establishment) and a new phase within the micropropagation (multiplication → stretching and enraizamnento), or even along the subcultures. This way, the complex network of relationships of the plant with their endophyte does not cease during the in vitro culture, unlike remains dynamic.

L'adiponectine (ApN) est une adipokine de 30 KDa produite abondamment par le tissu adipeux qui a été décrite pour la première fois en 1995. Dès lors qu'une corrélation inverse entre les taux circulants d'ApN et l'adiposité a été mise en évidence, de très nombreuses études ont été initiées pour chercher à établir un lien avec les pathologies liées au syndrome métabolique. Ainsi, chez les patients obèses et diabétiques, une perte de poids induite par un traitement médicamenteux ou un régime hypocalorique s'accompagne d'une augmentation des taux circulants d'ApN et d'une amélioration des paramètres biochimiques. Il ressort de ces études que des taux élevés d'ApN sont corrélés à une amélioration de la sensibilité à l'insuline, des paramètres lipidiques et une diminution du risque cardiovasculaire. Cependant, les mécanismes d'action conduisant à l'amélioration du métabolisme lipidique et glucidique restent encore mal connus. Au cours de cette étude, nous avons, dans un premier temps, cherché à déterminer les conséquences d'une variation de la masse grasse sur la production de l'ApN chez la souris. Pour cela, différentes stratégies nutritionnelles et pharmacologiques, conduisant à une fonte ou à une augmentation de la masse grasse, ont utilisées. Les résultats obtenus suggèrent que la production d'ApN n'est pas dépendante de la taille des adipocytes mais plutôt de leur état inflammatoire. Dans un second temps, grâce à un modèle d'explants de foie en culture, nous avons cherché à déterminer les effets directs de l'ApN sur le métabolisme lipidique du foie. Une première approche a consisté à tester les effets à long terme c'est à dire susceptibles de correspondre à des modifications d'expression génique et de synthèse protéique en incubant les explants pendant 21h dans un milieu de culture contenant de l'ApN en présence ou non d'insuline. Les résultats suggèrent que l'ApN accentue les effets de l'insuline, ce qui se traduit par une meilleure utilisation du glucose avec en contre partie une stimulation de la lipogenèse et une réduction de la ß-oxydation en présence d'insuline. De plus, l'ApN apparaît exercer un effet sur les voies de catabolisme des HDL. Par une seconde approche, nous avons testé les effets à court terme de l'ApN sur les capacités β-oxydatives en traitant les explants pendant 45 min. Dans ces conditions plus appropriées pour mettre en évidence l'activation des voies de régulation rapides, la présence d'ApN entraine une stimulation de la ß-oxydation qui s'accompagne d'une augmentation de la p- AMPK. En conclusion, ces résultats suggèrent que l'ApN exerce des effets directs sur le métabolisme hépatique du glucose compatible avec l'effet insulino-sensibilisateur observé in vivo. En revanche, les résultats ne permettent pas, à ce stade, d'établir une relation entre une induction par l'ApN de l'activité ß-oxydative des acides gras dans le foie et ces effets bénéfiques sur les paramètres lipidiques.

Eucalyptus benthamii tem se mostrado especialmente vantajoso como alternativa ao cultivo em regiões frias, justificando esforços para o estabelecimento de protocolos para sua micropropagação. Porém, as matrizes são preferencialmente selecionadas quando adultas (material apresenta menor competência morfogênica), tornando a micropropagação dependente de maior número de subcultivos e maior tempo para se reverter o material ao rejuvenescimento. Assim, a redução das perdas in vitro tem merecido atenção, como por exemplo, as manifestações endofíticas, que exigem maximização da eficiência da cultura e adequações no protocolo, visando minimizá-las, possibilitando melhorar o entendimento das relações estabelecidas e mantidas entre os endófitos e seu hospedeiro durante a micropropagação. Dessa maneira, foram utilizadas minicepas provenientes de duas fontes de miniestacas coletadas a partir do brotamento de gemas epicórmicas de megaestacas da base da copa e de brotamentos do anelamento da base do tronco, de uma matriz de E. benthamii com 13 anos de idade, estabelecidas em minijardim clonal sob condição de casa de vegetação, com o objetivo de avaliar como se dá a multiplicação, sob diferentes condições de cultivo, das duas fontes de explantes (minicepas); analisar se a frequência e intensidade das manifestações endofíticas são afetadas pelas diferentes condições de cultivo; investigar a ocorrência de alterações na comunidade bacteriana endofítica devido à alteração das condições de cultivo e fase da micropropagação (in vivo = minicepas, e in vitro = microcepas, material alongado e enraizado). Visando atender estes objetivos, a pesquisa se dividiu em duas partes. Na primeira (capitulo 3) o desenvolvimento, os aspectos morfofisiológicos, histoquímicos e a manifestação endofítica foram avaliados na multiplicação das duas fontes de explante sob diferentes meios e condições de cultivo. Na segunda (capítulo 4) as comunidades bacterianas endofíticas foram analisadas por meio de PCR-DGGE, baseada na região V6 do gene 16S DNAr. Os resultados mostraram que as microcepas provenientes de megaestaca tiveram melhor desenvolvimento independentemente do tratamento e maior frequência de manifestações endofíticas, comparando-se com as de anelamento. As comunidades bacterinas endofíticas foram distintas entre as amostras in vivo e in vitro, e se alteraram ao longo dos subcultivos e nas amostras alongadas e enraizadas. As diferenças existentes no desenvolvimento das microcepas podem ser inerentes à totipotencialidade do material, mas também podem ser afetadas, tanto pela ocorrência de manifestação, quanto pela comunidade bacteriana endofítica mais ou menos sensível ao processo de micropropagação, auxiliando ou prejudicando o desenvolvimento in vitro de seus hospedeiros. Cabe destacar, ainda, que mesmo em um sistema asséptico e ambientalmente controlado, os microrganismos endofíticos que resistiram a todo processo de desinfestação e cultivo, não estão \"adormecidos\", muito pelo contrário podem se alterar em quantidade à medida que seu hospedeiro é submetido a um novo sistema de cultivo (introdução) ou uma nova fase dentro da micropropagação (multiplicação → alongamento e enraizamnento) ou, ainda, ao longo dos subcultivos. Sendo assim, a complexa rede de relações das plantas com seus endófitos não cessa durante o cultivo in vitro, ao contrário mantém-se dinâmica. / Eucalyptus benthamii has proven to be especially advantageous as an alternative culture in cold regions, justifying efforts to establish protocols for micropropagation. However, the matrices are preferably selected when adults (material with lower morphogenic efficiency), making micropropagation more dependent of subcultures and too longer to reverse the material to rejuvenation. Thus, reduction of losses in vitro has deserved attention, such for example the endophytic manifestations that require the maximization of efficiency culture and adjustments to the Protocol, in order to minimize them, enabling better understanding of the relations established and maintained between endophytes and its host along micropropagation. For this, mini-stumps were used from two sources of mini-cuttings collected from the epicormic shoots of mega-cuttings from the treetop base and shoots from girdling from the trunk base, both of one E. benthamii matrix with 13 years of age established in clonal mini garden under greenhouse condition, aimed to evaluate how is the multiplication of two sources of explants (mini-stumps) under different growing conditions; analyze how the endophytic manifestations frequency and intensity are affected by different conditions; investigate the changes to occurrence in the endophytic bacterial community due to the variation of culture conditions and micropropagation phase (in vivo = mini-stumps, and in vitro = micro-stumps, elongated and rooted materials). In order to meet these objectives, the research was divided in two parts. In the first (chapter 3) the development, morphophysiological aspects, histochemical and endophytic manifestation were evaluated in the multiplication of the two explants sources from different media and culture conditions. In the second (chapter 4) endophytic bacterial communities were analyzed by PCR-DGGE based on the V6 region of 16S rDNA gene. The results showed that micro-stumps from mega-cuttings had better development regardless of treatment and increased frequency of endophytic events, comparing with the girdling. Endophytic bacterial communities were different between samples in vivo and in vitro, and have changed over the subcultures and the elongated and rooted samples. The differences in the development of micro-stumps can be explained by the totipotentiality inherent to the material, but may also be affected by both the manifestation occurrence and the endophytic bacterial community more or less sensitive to the micropropagation, helping or harming the in vitro development of their hosts. We also highlight that even in an aseptic and environmentally controlled system, the endophytic microorganisms that resisted the whole process of disinfection and cultivation, are not \"asleep\", quite the opposite may change in quantity when your host is subjected to a new cultivation system (in vitro establishment) and a new phase within the micropropagation (multiplication → stretching and enraizamnento), or even along the subcultures. This way, the complex network of relationships of the plant with their endophyte does not cease during the in vitro culture, unlike remains dynamic.