In this Doctoral Thesis the study of the influence of the operating parameters of the activated sludge process on the physical and chemical characteristics of the mixed liquor, from different membrane bioreactors (MBR), has been carried out. In addition, an optical characterization of the mixing liquor has been performed. In order to achieve the above mentioned aim, samples of the mixed liquor from an MBR treating municipal wastewater were first analysed and then, the characteristics of two MBR mixed liquors treating the leachates from two treatment plants of the organic fraction of municipal solid waste (OFMSW) were evaluated. It is noteworthy that the difference between the two industrial MBR lies on the feeding (inlet) to the MBR, which is determined by the treatment performed to the OFMSW, since one of them consists of a wet anaerobic digestion (MBR-LS) and the other of a dry anaerobic digestion (MBR-HS), so that the latter leachate contains higher concentration of suspended solids in its composition. For the chemical characterization of the mixture liquor, the extracellular polymeric substances (EPS) have been analysed. EPS are formed by the sum of extracted extracellular polymeric substances (eEPS) and soluble microbial products (SMP). These substances are considered the main cause of membranes fouling in MBRs and are basically formed by proteins and polysaccharides, which can be both attached to the cell wall and outside the cell, in form of eEPS or SMP. Regarding the physical characterization, in particular it has been analysed and studied the effect on the membrane fouling of the total and volatile suspended solids, the viscosity, the capillary suction time and the particle size, measured through the resistance to filtration. Finally, in the municipal MBR, cell viability with epifluorescence microscopy has been studied, as well as the main components of EPS have been stained by two different methods. In addition, a statistical study has evaluated the effect of the main operating parameters of the MBR on the characterization parameters of the mixed liquor. By means of least squares regression, the operational parameters that influence SMP production in industrial MBR have been studied. The study was completed by evaluating the fouling of an ultrafiltration membrane with proteins extracted from EPS and subsequently purified with ammonium sulphate at different pH values. To this end, different synthetic proteins (bovine serum albumin, casein, haemoglobin and lysozyme) were first analysed and then compared with the proteins extracted from the mixed liquor. Membrane fouling with purified eEPS proteins has also been studied along with sodium alginate added in the same concentration as the proteins. The results obtained demonstrate, firstly, that SMP play an important role in the membrane fouling. The concentration of proteins has been considerably higher than that of carbohydrates both in SMP and in eEPS, although SMP influenced to a greater extent on the filtration of the activated sludge. In addition, it is shown that bacteria under stress conditions, caused for example by increase in conductivity, increase the production of SMP, and therefore, membrane fouling increases. On the other hand, it is concluded that a low hydraulic retention time favours a high carbohydrates concentration and consequently drives to an increase in the viscosity and capillary suction time, also increasing the membrane fouling. / En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el estudio de la influencia de los parámetros de operación del proceso de fangos activos en las características físicas y químicas de los licores de mezcla, procedentes de diferentes biorreactores de membrana (MBR). Además, se ha realizado una caracterización óptica del licor de mezcla. Para ello, en primer lugar se tomaron muestras del licor de mezcla de un MBR que trata aguas residuales urbanas y, a continuación, se evaluaron las características de los licores de mezcla de dos MBR que tratan los lixiviados procedentes de dos plantas de tratamiento de la fracción orgánica de los residuos sólidos urbanos (FORSU). Cabe destacar que la diferencia entre los dos MBR industriales radica en la alimentación (afluentes) al MBR, que viene determinada por el tratamiento que se realiza a la FORSU, ya que uno de ellos consiste en una digestión anaerobia en vía húmeda (MBR-LS) y, el otro, en una digestión anaerobia en vía seca (MBR-HS), por lo que este último lixiviado contiene mayor concentración de sólidos en suspensión en su composición. Para la caracterización química del licor de mezcla, se han analizado las sustancias poliméricas extracelulares (EPS), formadas por la suma de las sustancias poliméricas extracelulares extraídas (eEPS) y los productos solubles microbianos (SMP). Estas sustancias se consideran las principales causantes del ensuciamiento de las membranas del MBR y están formadas básicamente por proteínas y polisacáridos, los cuales pueden estar tanto adheridos a la pared celular como fuera de la célula, en forma de eEPS o SMP. En cuanto a la caracterización física, en concreto se ha analizado y estudiado el efecto en el ensuciamiento de las membranas de los sólidos en suspensión totales y volátiles, la viscosidad, el tiempo de succión capilar y el tamaño de partícula, medido a través de las resistencias a la filtración. Finalmente, en el MBR urbano se ha estudiado la viabilidad celular con microscopía de epifluorescencia, así como se han teñido para su caracterización óptica los principales componentes de las EPS por dos métodos distintos. Además, mediante un estudio estadístico se ha evaluado el efecto de los principales parámetros de operación de los MBR sobre los parámetros de caracterización del licor de mezcla. Mediante regresión por mínimos cuadrados se han estudiado los parámetros operacionales que influyen en la producción de SMP en los MBR industriales. El estudio se ha completado evaluando el ensuciamiento de una membrana de ultrafiltración con proteínas extraídas de las EPS y posteriormente purificadas con sulfato amónico, a diferentes valores de pH. Para ello, en primer lugar se han caracterizado diferentes proteínas sintéticas (albúmina de suero bovino, caseína, hemoglobina y lisozima) para compararlas con las proteínas extraídas del licor de mezcla. También se ha estudiado el ensuciamiento de la membrana con las proteínas purificadas de las eEPS junto con alginato de sodio en la misma proporción. Los resultados obtenidos demuestran en primer lugar que los SMP juegan un papel importante en el ensuciamiento de las membranas. Tanto en su composición como en la de las eEPS, la concentración de proteínas determinada ha sido considerablemente mayor que la de carbohidratos, si bien éstos influyen incluso en mayor medida en la filtrabilidad del fango activo. Además, se demuestra que las bacterias bajo condiciones de estrés, causado por ejemplo por aumento de conductividad, aumentan la producción de SMP, y por tanto, se incrementa el ensuciamiento de las membranas. Por otro lado, se concluye que un tiempo de retención hidráulico bajo favorece una concentración elevada de carbohidratos y consecuentemente provoca un aumento de la viscosidad y el tiempo de succión capilar, aumentando también el ensuciamiento de la membrana. / En la present Tesi Doctoral s'ha dut a terme l'estudi de la influència dels paràmetres d'operació del procés de fangs actius en les característiques físiques i químiques de licors de mescla, procedents de diferents biorreactors de membrana (MBR). A més, s'ha realitzat una caracterització òptica del licor de mescla. Per a això, en primer lloc es van prendre mostres del licor de mescla d'un MBR que tracta aigües residuals urbanes i, a continuació, es van avaluar les característiques dels licors de mescla de dos MBR que tracten els lixiviats procedents de dues plantes de tractament de la fracció orgànica dels residus sòlids urbans (FORSU). Cal destacar que la diferència entre els dos MBR industrials radica en l'alimentació (afluents) al MBR, que ve determinada pel tractament que es realitza a la FORSU, ja que un d'ells consisteix en una digestió anaeròbia en via humida (MBR-LS) i, l'altre, en una digestió anaeròbia en via seca (MBR-HS), per la qual cosa este últim lixiviat conté major concentració de sòlids en suspensió en la seua composició. Per a la caracterització química del licor de mescla, s'han analitzat les substàncies polimèriques extracel¿lulars (EPS), formades per la suma de les substàncies polimèriques extracel¿lulars extretes (eEPS) i els productes solubles microbians (SMP). Estes substàncies es consideren les principals causants de l'embrutiment de les membranes del MBR i estan formades bàsicament per proteïnes i polisacàrids, els quals poden estar tant adherits a la paret cel¿lular com fora de la cèl¿lula, en forma d'eEPS o SMP. Quant a la caracterització física, en concret s'ha analitzat i estudiat l'efecte en l'embrutiment de les membranes dels sòlids en suspensió totals i volàtils, la viscositat, el temps de succió capil¿lar i la grandària de partícula, mesurat a través de les resistències a la filtració. Finalment, en el MBR urbà s'ha estudiat la viabilitat cel¿lular amb microscòpia d'epifluorescència, així com s'han tenyit per a la seua caracterització òptica els principals components de les EPS per dos mètodes distints. A més, per mitjà d'un estudi estadístic s'ha avaluat l'efecte dels principals paràmetres d'operació dels MBR sobre els paràmetres de caracterització del licor de mescla. Per mitjà de regressió per mínims quadrats s'han estudiat els paràmetres operacionals que influeixen en la producció de SMP en els MBR industrials. L'estudi s'ha completat avaluant l'embrutiment d'una membrana d'ultrafiltració amb proteïnes extretes de les EPS i posteriorment purificades amb sulfat amònic, a diferents valors de pH. Per a això, en primer lloc s'han caracteritzat diferents proteïnes sintètiques (albúmina de sèrum boví, caseïna, hemoglobina i lisozima) per a comparar-les amb les proteïnes extretes del licor de mescla. També s'ha estudiat l'embrutiment de la membrana amb les proteïnes purificades de les eEPS junt amb alginat de sodi en la mateixa proporció. Els resultats obtinguts demostren en primer lloc que els SMP juguen un paper important en l'embrutiment de les membranes. Tant en la seua composició com en la de les eEPS, la concentració de proteïnes determinada ha sigut considerablement major que la de carbohidrats, si bé estos influeixen inclús en major grau en la filtrabilidad del fang actiu. A més, es demostra que els bacteris baix condicions d'estrès, causat per exemple per augment de conductivitat, augmenten la producció de SMP, i per tant, s'incrementa l'embrutiment de les membranes. D'altra banda, es conclou que un temps de retenció hidràulic baix afavoreix una concentració elevada de carbohidrats i conseqüentment provoca un augment de la viscositat i el temps de succió capil¿lar, augmentant també l'embrutiment de la membrana. / Zuriaga Agustí, E. (2017). Influencia de las características físicas y químicas del licor de mezcla en Bioreactores de Membrana y su correlación con los parámetros de operación en aguas residuales urbanas e industriales [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90512

[ES] El infarto agudo de miocardio (IAM) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados. A lo largo de los últimos años se ha visto que la respuesta inflamatoria que ocurre tras desencadenarse el IAM es muy importante en el desarrollo clínico de esta patología. Si se produce una respuesta inflamatoria exacerbada aumenta el riesgo de remodelado cardiaco adverso y fallo cardiaco, pero el hecho de que no se desencadene la respuesta inflamatoria también tiene consecuencias negativas. Debido a la importancia de la respuesta inflamatoria en el IAM, recientemente se han intentado desarrollar terapias dirigidas frente componentes celulares o moleculares que participan en esta respuesta. Dentro de estas terapias, la terapia celular con células mesenquimales estromales (MSC) se ha postulado como un buen candidato. Las MSC se caracterizan fundamentalmente por su capacidad inmunomoduladora, lo que ha conducido a su empleo como agentes terapéuticos en diferentes enfermedades que cursan con procesos inflamatorios. Sin embargo, a lo largo de los últimos años, numerosos estudios han mostrado que el efecto terapéutico de las MSC está mediado fundamentalmente por las vesículas extracelulares (EVs) que liberan. Estas EVs recapitulan los efectos terapéuticos de las células de origen, por lo que también presentan efectos inmunomoduladores. El empleo de las EVs de MSC como agentes terapéuticos presenta ventajas respecto al uso de las MSC como, por ejemplo, una mayor bioseguridad. No obstante, el uso clínico de las EVs todavía tiene que hacer frente a retos como la obtención de grandes cantidades de EVs que constituyan un producto clínico estable y homogéneo. En este trabajo se ha querido evaluar, por un lado, si las EVs obtenidas de diferentes biopsias de la misma fuente tisular de MSC pueden constituir un producto biológico homogéneo que presente las mismas características y funcionalidad. Por otro lado, se ha evaluado si estas EVs se pueden emplear como agente terapéutico frente a la respuesta inflamatoria que se desencadena tras el IAM. Para ello se ha estudiado el efecto inmunomodulador de las EVs sobre células del sistema inmune, fundamentalmente macrófagos, in vitro y en un modelo in vivo de IAM en ratas. Los resultados mostraron que las EVs favorecen la diferenciación de los macrófagos M1 proinflamatorios hacia un fenotipo similar al M2, aumentando la expresión de marcadores M2 y reduciendo la secreción de citocinas proinflamatorias. Además, las EVs promovieron la activación de neutrófilos in vitro y la reducción de su estrés oxidativo. La administración de EVs en ratas sometidas a IAM amortiguó la caída de la función cardiaca y limitó la extensión de la zona infartada a los 7 y 21 días postinfarto. Las EVs también redujeron el número de macrófagos y neutrófilos proinflamatorios dentro de la zona infartada, favoreciendo la resolución de la inflamación. En conclusión, las EVs empleadas en este trabajo han demostrado ser un producto biológico estable con independencia de la biopsia de la que proceden, y han demostrado ser capaces de ejercer respuestas pro-resolutivas eficaces en un modelo de isquemia miocárdica, lo que las convierte en potenciales agentes terapéuticos para tratar la inflamación en el IAM. / [CA] L'infart agut de miocardi (IAM) és una de les principals causes de morbiditat i mortalitat als països desenvolupats. Al llarg dels darrers anys s'ha vist que la resposta inflamatòria que passa després de desencadenar-se l'IAM és molt important en el desenvolupament clínic d'aquesta patologia. Si es produeix una resposta inflamatòria exacerbada augmenta el risc de remodelat cardíac advers i fallada cardíaca, però el fet que no es desencadeni la resposta inflamatòria també té conseqüències negatives. A causa de la importància de la resposta inflamatòria a l'IAM, recentment s'han intentat desenvolupar teràpies dirigides davant de components cel·lulars o moleculars que participen en aquesta resposta. Dins aquestes teràpies, la teràpia cel·lular amb cèl·lules mesenquimals estromals (MSC) s'ha postulat com un bon candidat. Les MSC es caracteritzen fonamentalment per la seva capacitat immunomoduladora, cosa que ha conduït a la seva ocupació com a agents terapèutics en diferents malalties que cursen amb processos inflamatoris. Tot i això, al llarg dels últims anys, nombrosos estudis han mostrat que l'efecte terapèutic de les MSC està intervingut fonamentalment per les vesícules extracel·lulars (EVs) que alliberen. Aquestes EVs recapitulen els efectes terapèutics de les cèl·lules dorigen, per la qual cosa també presenten efectes immunomoduladors. L'ús de les EVs de MSC com a agents terapèutics presenta avantatges respecte a l'ús de les MSC com, per exemple, una bioseguretat més gran. Tot i això, l'ús clínic de les EVs encara ha de fer front a reptes com l'obtenció de grans quantitats d'EVs que constitueixin un producte clínic estable i homogeni. En aquest treball s'ha volgut avaluar, d'una banda, si les EV obtingudes de diferents biòpsies de la mateixa font tissular de MSC poden constituir un producte biològic homogeni que presenti les mateixes característiques i funcionalitat. D'altra banda, s'ha avaluat si aquestes EVs es poden fer servir com a agent terapèutic davant de la resposta inflamatòria que es desencadena després de l'IAM. Per això s'ha estudiat l'efecte immunomodulador de les EV sobre cèl·lules del sistema immune, fonamentalment macròfags, in vitro i en un model in vivo d'IAM en rates. Els resultats van mostrar que les EVs afavoreixen la diferenciació dels macròfags M1 proinflamatoris cap a un fenotip similar al M2, augmentant l'expressió de marcadors M2 i reduint la secreció de citocines proinflamatòries. A més, les VE van promoure l'activació de neutròfils in vitro i la reducció del seu estrès oxidatiu. L'administració d'EVs en rates sotmeses a IAM va esmorteir la caiguda de la funció cardíaca i va limitar l'extensió de la zona infartada als 7 i 21 dies postinfart. Les EVs també van reduir el nombre de macròfags i neutròfils proinflamatoris dins de la zona infartada, afavorint la resolució de la inflamació. En conclusió, les EVs emprades en aquest treball han demostrat ser un producte biològic estable amb independència de la biòpsia de què procedeixen, i han demostrat ser capaços d'exercir respostes pro-resolutives eficaces en un model d'isquèmia miocàrdica, cosa que les converteix en agents terapèutics potencials per tractar la inflamació a l'IAM. / [EN] Acute myocardial infarction (AMI) is one of the main causes of morbidity and mortality in developed countries. Over the last few years, it has been shown that the inflammatory response that occurs after AMI is triggered is very important in the clinical development of this pathology. If an exacerbated inflammatory response occurs, the risk of adverse cardiac remodeling and heart failure increases, but failure to trigger the inflammatory response also has negative consequences. Because of the importance of the inflammatory response in AMI, recent attempts have been made to develop therapies that target cellular or molecular components involved in this response. Within these therapies, cell therapy with mesenchymal stromal cells (MSC) has been postulated as a good candidate. MSC are mainly characterized by their immunomodulatory capacity, which has led to their use as therapeutic agents in different diseases involving inflammatory processes. However, in recent years, numerous studies have shown that the therapeutic effect of MSCs is mainly mediated by the extracellular vesicles (EVs) they release. These EVs recapitulate the therapeutic effects of the cells of origin and therefore also have immunomodulatory effects. The use of MSC-EVs as therapeutic agents has advantages over the use of MSC, such as increased biosafety. However, the clinical use of EVs still faces challenges such as obtaining large quantities of EVs that constitute a stable and homogeneous clinical product. The aim of this study was to evaluate, on the one hand, whether EVs obtained from different biopsies of the same MSC tissue source can constitute a homogeneous biological product with the same characteristics and functionality. On the other hand, we have evaluated whether these EVs can be used as a therapeutic agent against the inflammatory response triggered after AMI. To this end, the immunomodulatory effect of EVs on immune system cells, mainly macrophages, was studied in vitro and in an in vivo model of AMI in rats. The results showed that EVs favored the differentiation of proinflammatory M1 macrophages towards an M2-like phenotype, increasing the expression of M2 markers and reducing the secretion of proinflammatory cytokines. In addition, EVs promoted the activation of neutrophils in vitro and the reduction of their oxidative stress. The administration of EVs in rats subjected to AMI blunted the decline in cardiac function and limited the extent of the infarct zone at 7- and 21-days post-infarction. EVs also reduced the number of proinflammatory macrophages and neutrophils within the infarct zone, favoring the resolution of inflammation. In conclusion, the EVs used in this work have been shown to be a stable biological product regardless of the biopsy from which they are derived and have been shown to be able to exert effective pro-resolving responses in a model of myocardial ischemia, making them potential therapeutic agents to treat inflammation in AMI. / Amaro Prellezo, E. (2024). Las vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales de pulpa dental como producto terapéutico frente a la respuesta inmune que se desencadena tras el infarto agudo de miocardio [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202973

O Melanoma é um tipo de neoplasia que se origina de melanócitos normalmente presentes na epiderme. Uma das características do melanoma é a capacidade de adquirir resistência a terapias. As células de melanoma podem aumentar a liberação de vesículas extracelulares (VEs) em resposta ao tratamento com quimioterápicos. A cisplatina (CDDP) e a temozolomida (TMZ) são drogas utilizadas para o tratamento de tumores. Ambas as drogas formam adutos no DNA, mas as vias de sinalização que deflagram a morte celular são distintas. O objetivo desse estudo é investigar a morte celular da linhagem B16-F10 na presença de VEs oriundas de células B16-F10 tratadas com cisplatina CDDP ou TMZ. Inicialmente as VEs oriundas de células de melanoma murino, B16-F10, tratadas com CDDP ou TMZ e seus controles, foram isoladas por ultracentrifugações sucessivas. Para os experimentos in vitro, as células foram tratadas com as drogas em combinação com as respectivas VEs. As amostras foram realizados avaliações de ciclo celular e de morte e ensaio clonogênico. Para os experimentos in vivo, as células B16-F10 foram pré-tratadas com VEs, e posteriormente, as células foram inoculadas via subcutânea em camundongos C57BL/6 e os tumores foram mensurados diariamente. Em nosso estudo concluimos que a metodologia do isolamento de VEs é eficiente. Além disso, observamos que o tratamento com CDDP ou TMZ aumenta a liberação de VEs por células tumorais. Apesar do resultado contraditorio, as VEs liberadas por células tumorais tratadas com quimioterápicos aumentam a capacidade de sobrevivência das células de melanoma in vitro. VEs oriundas de células de melanoma não participam inicialmente da sensibilização à morte de células tumorais causada pelas mesmas drogas, mas a longo prazo, as VEs oriundas de células tratadas com a TMZ podem conferir uma resposta celular de sobrevivência às células tumorais in vitro. In vivo, o resultado é inconclusivo, uma vez que para confirmar se as VEs fazem parte da adaptação tumoral conferindo fenômenos de sobrevivência celular in vivo, é necessário avaliar em outros modelos celulares e animais / Melanoma is a neoplasm derived from melanocytes normally present in the skin specifically in the epidermis. One of the malignancies of melanoma is the ability to acquire chemoresistance. Cisplatin (CDDP) and temozolomide (TMZ) are drugs used for the treatment of tumors. Both drugs can form alkylating adducts in DNA, however, the pathways that trigger cell death are distinct. Tumor cells, including melanoma, may increase the release of extracellular vesicles (EVs) in response to chemotherapeutic treatment. The aim of this study is to investigate the cell death phenomenon in B16-F10 cell line in presence of EVs derived from chemotherapeutic-treated B16-F10 cells. For in vitro experiments, the cells were treated with CDDP or TMZ in combination with EVs from chemotherapictreated samples. For in vivo experiments, B16-F10 cells were exposed to EVs and inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. The growth was measured daily. In this work, we established and characterized VEs released by melanoma cells treated with chemotherapics and we established chemotherapics treatments to isolate EVs for next EVs isolation. Our results showed that CDDP or TMZ treatment increase the release of EVs by tumor cells. The EVs released by melanoma cells after CDDP or TMZ treatment seem to increase the survival capacity of melanoma cells. Thus, we concluded that EVs derived from melanoma cells do not participate in the cell death sensitization induced by CDDP or TMZ. However, EVs derived from TMZ treated cells may offer a survival effect to tumor cells in vitro a long term. In vivo, The result is inconclusive since to confirm how VEs are part of the tumor adaptation conferring cellular survival phenomena in vivo, it is necessary to evaluate in other cellular and animal models

As células que compõem o tumor podem interagir entre si, através da liberação e incorporação de vesículas extracelulares, muitas vezes contribuindo para a progressão tumoral. Dessa maneira, o presente trabalho teve como objetivo observar se as vesículas extracelulares , como as microvesículas e os exossomas liberados pelas células cancerosas em condições de estresse celular, após quimioterapia e indução de hipóxia conferem alguma vantagem adaptativa às células tumorais. Nossos resultados mostram que vesículas liberadas por células de melanoma humano em hipóxia ou normóxia apresentam tamanho médio característico de exossomos e microvesículas e não modulam os processos de proliferação, morte e migração celular. As vesículas liberadas pelas células após tratamento com o quimioterápico temozolamida também apresentam tamanho característico de exossomos e microvesículas; em adição, o tratamento com a temozolamida induziu um aumento na secreção dessas vesículas pelas células de melanoma. A incubação das células tumorais com vesículas oriundas da terapêutica com a temozolamida aumentou a proliferação celular, conferindo vantagem proliferativa às células de melanoma humano / Tumor cells can interact with each other by releasing and incorporating extracellular vesicles, contributing to tumor progression. Therefore, the aim of this study was to evaluate if extracellular vesicles, such as microvesicles and exossomes, released by cancer cells under cell stress conditions like chemotherapy and hypoxia, induce an adaptive advantage to tumor cells. Our results show that vesicles shed by human melanoma cells under hypoxia, or normoxia exhibit the characteristic size of exossomes and microvesicles and do not modulate cell proliferation, death or migration. The vesicles released by melanoma cells after temozolomide treatment also showed the average size of exossomes and microvesicles; moreover, temozolomide treatment induced an increase in extracellular vesicles shedding by tumor cells. Incubation of tumor cells with vesicles released under temozolamide therapeutics caused an increase in cell proliferation, providing a proliferative advantage to human melanoma cells

Na periodontite, um potencial loop inflamatório oral-sistêmico é identificado pela presença de produtos da atividade neutrofílica em locais onde o processo inflamatório não foi desenvolvido inicialmente. Nossos resultados mostram um aumento da quantidade de neutrófilos circulantes, assim como a resposta destas células dos animais com periodontite induzida por ligadura (7 dias) ante diferentes estímulos in vitro em comparação aos animais Sham. A produção de ânion superóxido por neutrófilos circulantes de ratos com periodontite foi maior quando estimulados com PMA ou Zimosan. Na liberação de MPO, PMA, Zimosan ou fMLP produziram efeitos maiores no grupo com periodontite. A formação de NETs foi maior nos neutrófilos dos ratos com periodontite em resposta ao PMA. Além das respostas estimuladas, a liberação de MPO e a formação de NETs em condições basais foram maiores nos neutrófilos provenientes dos ratos com periodontite. Estes resultados mostram que existe uma pre-ativação (priming) dos neutrófilos circulantes já na fase inicial do desenvolvimento da periodontite. / In periontitis, a potential loop of oral-systemic inflammation is identified by the presence of neutrophil activity products at the sites where the inflammatory process was not initially developed. Our results show an increase in the amount of circulating neutrophils, as well as the response of these cells from rats with ligature-induced periodontitis (7 dias) to different in vitro stimuli, in comparison with those obtined from Sham animals. Superoxide anion production by circulating neutrophils from rats with peridontitis was higher when stimulated with either PMA or Zymosan. In MPO release, either PMA, zymosa or fMLP produced greater effects by periodontitis group. The formation of NETs was also higher in the neutrophils from rats with peridontitis in response to PMA. In addition to the stimulated responses, under basal conditions, MPO release and NET formation were also higher in neutrophils obtained from rats with periodontitis. These results show that circulating neutrophils are pre-activated (primed) even in the initial phase of periodontitis development.

Orientador: Lucilene Delazari dos Santos / Resumo: O uso de animais de grande porte como sorodoadores tem se mostrado de grande importância para a produção do selante de fibrina do Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP). O objetivo deste trabalho foi certificar um plantel de bubalinos, realizar uma investigação sobre os potenciais candidatos à biomarcadores de brucelose em soro de búfalos e evidenciar o isolamento e a quantificação pioneira de exossomos (EVs) do soro de bubalinos com theileriose e babesiose. Realizaram-se os seguintes testes sorológicos: brucelose (BRU), leptospirose (LEP), febre aftosa (FMD), rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), diarréia viral bovina (BVD), varíola bovina (Pox) e tuberculose, língua azul (BTV), estomatite vesicular (EV) - sorotipos cocal (COCV) e alagoano (VSAV), leucose bovina (BLV), neospora (NC), toxoplasmose (TX) e testes bioquímicos laboratoriais. Todas as amostras de soro foram submetidas ao diagnóstico sorológico para detecção de brucelose, diagnóstico de reação em cadeia da polimerase para detecção de theileriose e babesiose, cromatografia líquida de afinidade, isolamento de exossomos, digestão de proteínas em solução, análise de espectrometria de massa e ferramentas de bioinformátca. Observamos um enriquecimento de 90,5% de proteínas nos soros de búfalos após este protocolo de depleção. A análise MS/MS evidenciou que as principais diferenças no proteoma dos animais com brucelose. No que se refere ao exossosmos isolados e quantififcados neste trabalho, nossa met... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of large animals as sorbozers has been shown to be of great importance for the production of fibrin sealant from the Center for the Study of Venoms and Poisonous Animals (CEVAP). The objective of this work was to certify a flock of buffaloes, to conduct an investigation of the potential candidates for brucellosis biomarkers in buffalo serum and to evidence the isolation and the pioneer quantification of buffalo serum exosomes (EVs) with theileriose and babesiosis. The following serological tests were carried out: brucellosis (BRU), leptospirosis (LEP), foot-and-mouth disease (FMD), infectious bovine rhinotracheitis (IBR), bovine viral diarrhea (BVD), bovine pox (Pox) and tuberculosis, blue tongue (BTV), vesicular stomatitis (EV) - cocal (COCV) and alagoan (VSAV) serotypes, bovine leukosis (BLV), neospora (NC), toxoplasmosis (TX) and laboratory biochemical tests. All serum samples were submitted: 1) serological test; 2) Polymerase chain reaction; 3) Depletion; 4) Isolation of exosomes; 5) Mass spectrometry and 6) Analysis and interpretation of the data. The MS / MS analysis showed that the major differences in the proteome of animals with brucellosis. Regarding the isolated and quantified exosmos in this work, our methodology is strongly encouraged for the isolation and characterization of EVs in Apicomplexa infections in farm animals. We conclude that this study on different fronts such as management, infectious diseases and parasitic diseases can be used in small pro... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Silvio Roberto Andrietta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-09-11T21:08:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aquino_DeniseSilvade_M.pdf: 2817268 bytes, checksum: 75e30246006dba478e363bb0b37da638 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Dextranas são polissacarídeos produzidos pela bactéria pertencente à família Lactobacileae constituídos de moléculas de glicose unidas por ligações a-(1-6) na cadeia principal e ligações a-(1-4), a-(1-3) e a-(1-2) nas ramificações. A enzima dextranasacarase, responsável por sua síntese, é extracelular e tem a sacarose como principal indutor. Este biopolímero possui aplicações nas indústrias farmacêuticas, químicas e de alimentos. Na indústria farmacêutica é que a dextrana tem a sua maior aplicação. A dextrana de baixa massa molecular, dextrana clínica, é utilizada como expansor volumétrico sanguíneo e como facilitador da fluidez do sangue. Este trabalho teve como objetivo otimizar o processo de produção de dextrana por três novas linhagens de bactérias denominadas 4-03, 4-30 e 4-26 isoladas da cana-de-açúcar, dentro deste objetivo principal estão incluídos a caracterização da estrutura de cadeia destes biopolímeros e a identificação das linhagens das bactérias isoladas. Para a otimização, tanto da produção de dextrana como da produção de dextrana-sacarase, realizaram-se ensaios em frascos agitados, analisando a influência das seguintes variáveis: concentração de tampão (controle do pH), concentração de substrato (sacarose) e concentração da fonte de nitrogênio (extrato de levedura). Conduziram-se os ensaios de otimização com base em planejamento experimental fatorial e análise de superfície de resposta. As linhagens 4-26 e 4-30 apresentaram modelos estatisticamente significativos, portanto, podem ser utilizados na previsão da composição do meio de fermentação para produção da dextrana-sacarase. Para a otimização da produção de dextrana, somente a linhagem 4-26 mostrou variação significativa estatisticamente das variáveis respostas frente ás variáveis estudadas na região avaliada. Realizaram-se ensaios para a obtenção da dextrana a qual teve sua estrutura de cadeia determinada utilizando o método da perioxidação e o método da degradação de Smith. A primeira metodologia consiste em determinar os tipos e as proporções das ligações a-(1-6), a-(1-4) e a-(1-2), e a-(1-3) por meio do consumo do oxidante e produção de ácido quando as dextranas são sujeitas a uma oxidação com periodato. A segunda metodologia citada, consiste na oxidação do polissacarídeo seguida de redução ao poliálcool correspondente e por fim realiza-se hidrólise ácida gerando fragmentos de Dgliceraldeído, característico de ligações a- (1,2), D-glicose, característico de ligações a-(1,3), eritritol, característico de ligações a- (1,4), glicerol e glicoaldeído, característicos de ligações a- (1,6) e terminal não-redutor. Quando compara-se os dois métodos de determinação da estrutura de cadeia da dextrana, a solubilidade em água da dextrana formada pela linhagem 4-03 é confirmada, pois a sua cadeia em ambas as análises apresentou uma maior porcentagem das ligações a-(1,6), característica contrária a goma produzida pela linhagem 4-30, que apresenta-se de forma insolúvel por ter uma cadeia ramificada. O resultado para o biopolímero formado pela linhagem 4-26 apresentou-se os mesmos valores para as duas metodologias, porém no método da degradação de Smith sua estrutura não aproximou-se da dextrana padrão / Abstract: Dextran is a polysaccharide produced by bacteria of the Lactobacillaceae family and it consists of D-glucose monomeric units linked at the position a-(1,6) in the linear chain and a-(1-4), a-(1-3) and a-(1-2) positions at the branching points. The enzyme dextransucrase, responsible for dextran synthesis, is extracellular and has sucrose as its main inductor. This biopolymer is used by the pharmaceutical, chemistry and the food industry. Dextran has its main application in the pharmaceutical industry. The low molecular weight dextran, the clinical dextran, is used as blood volume expander and blood flow improver. This work had as objective to optimize the dextran production by three new bacteria strains named 4-03, 4-26 and 4-30 isolated from sugar cane, into this main objective are including the characterization the structure of the chain of these bacteria biopolymers and to identification bacteria strains isolated. The influence of the following variable was analyzed for the dextransucrase and dextran production optimization: buffer (pH control), substrate (sucrose) and nitrogen source (yeast extract) concentrations. The experimental assays were performed on the basis of factorial design and response surface techniques. The strains 4-26 and 4-30 presented statically significant models, therefore, these models may be used for predict the optimum composition of the fermentation medium for dextransucrase production. Only strain 4-26 showed statically significant variation of the dependent variables in the evaluated region dextran production optimization. The dextran structure of the three strains was determined by the periodate oxidation and Smith degradation methods. The first methodology consist in to determine kinds and proportions of the a-(1,6), a-(1-2) e a-(1-4) e a-(1-3) linkages by the consumption of oxidant and the production of acid when the dextran is subject to periodate oxidation analysis. The second methodology consists in the oxidation of the polysaccharide followed by reduction and hydrolysis with dilute acid which produces characteristic fragments: D-glyceraldehydes, characteristic of the a-(1,2) linkages, D-glucose, characteristic of the a-(1,3) linkages, erythritol, characteristic of the a-(1,4) linkages and glycerol or glycolaldehyde, characteristic of the a-(1,6) linkages and no reducing terminal. The results obtained confirmed the high solubility of the dextran produced by strain 4-03 due to its high proportion of the a-(1,6) linkages in contrast with gum produced by strain 4- 30 that is highly insoluble due to its branched chain. The biopolymer produced by strain 4- 26 presented the same values for the both methodologies, however, the Smith degradation result showed that its structure is not close to the standard dextran / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

O sucesso no desenvolvimento de tumores não dependente somente de mutações, mas também é influenciado pelo microambiente do tumor; nele ocorre a interação entre as células tumorais e o estroma. Essa interação pode ser mediada por vesículas liberadas por essas células para o meio extracelular. Essas vesículas atuam na comunicação celular que pode influenciar a progressão tumoral. O objetivo deste estudo foi analisar as interações mediadas por vesículas entre células tumorais e fibroblastos normais. As células tumorais foram plaqueadas sobre a monocamada de fibroblastos e carregadas com diferentes corantes vitais. Nossos resultados evidenciaram a presença e a troca de vesículas entre as células em co-cultura. Vesículas isoladas mostraram tamanhos heterogêneos. Células tumorais possuem mais vesículas que as células normais. As vesículas são compostas pelas proteínas AHNAK e Anexinas. AHNAK foi detectada em vesículas trocadas e estava aumentada em tumores. AHNAK é molécula estrutural das vesículas extracelulares que pode influenciar a biologia dos tumores de mama. / The successful development of tumors is not only dependent on cell mutations, but also driven by the tissue microenvironment; relies on interaction of cells and their surrounding stroma. Some cell types release vesicular structures into the extracellular space that would be involved in cellular communication and tumor progression. The aim of this study was to analyze vesicle-mediated interactions between tumor cells and normal fibroblasts. Tumor cells were plated above fibroblasts monolayer and both loaded with different vital dyes. Our results evidenciated presence and exchange of vesicles between breast tumor cells and fibroblasts in co-culture. Vesicles isolated showed heterogeneous sizes. Tumor cell showed more vesicles than normal cells. These vesicles were composed of AHNAK and Annexins proteins. The protein AHNAK was detected in exchanged vesicles and was increased in tumors when compared to normal breast tissues. AHNAK could represent a vesicle structural molecule that would influence breast tumor biology.

Orientador: Luciane Alarcão Dias-Melicio / Resumo: Recentemente, a deficiência de vitamina D vem se tornando um problema de abrangência mundial em virtude de hábitos rotineiros da população, como o trabalho por períodos prolongados em ambientes fechados e diminuição da exposição solar. Trabalhos recentes demonstram que a vitamina D age não somente na homeostase do cálcio, mas também na regulação do sistema imune. Diante da multiplicidade de funções dessa vitamina, sua deficiência tem sido associada ao risco de desenvolvimento de uma série de doenças, entre elas doenças infecciosas como as causadas por S. aureus. As infecções por essa bactéria têm trazido expressiva preocupação para a população humana em decorrência do aumento da prevalência de cepas resistentes aos fármacos antibacterianos, dificultando, dessa maneira, o tratamento e contribuindo para a busca de métodos alternativos para combater esse tipo de infecção. Além disso, o S. aureus conta com um potente arsenal de fatores de virulência que contribuem para a evasão da resposta imune do hospedeiro. Nesse contexto, torna-se importante avaliar se a vitamina D pode modular os efeitos bactericidas de neutrófilos humanos através de mecanismos intra e extracelulares, favorecendo, portanto, o combate a infecções, especialmente aquelas causadas por microrganismos resistentes aos principais tratamentos. Dessa maneira, nós demonstramos que neutrófilos tratados com vitamina D e desafiados com duas cepas de S. aureus tiveram um aumento nas taxas de fagocitose e atividade bacteric... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the last years, vitamin D deficiency has become a worldwide problem due to routine population habits, such as prolonged work indoors and increased use of sunscreen/decreased sun exposure in attempt to avoid high rates of skin cancer. Recent studies demonstrated that vitamin D acts not only on calcium homeostasis, but also on the regulation and function of the immune system. Facing the countless functions of vitamin D, its deficiency has been associated with the risk of development of many diseases, including infectious diseases such as those caused by S. aureus. Infections caused by these bacteria have brought significant concern to the human population due to the increased prevalence of strains resistant to antibiotics, thus making it difficult to treat and contributing to the search for alternative methods to combat this type of infection. In addition, S. aureus have a variety of virulence factors, which confer the ability to evade host immune responses. In this context, it is important to evaluate whether vitamin D can modulate the bactericidal effects of human neutrophils through intra- and extracellular mechanisms, such as phagocytosis, bacterial killing and release of Neutrophil Extracellular Traps (NETs), thus contributing to the response against infections, especially those caused by microorganisms resistant to the main treatments. Thus, we demonstrated that neutrophils treated with Vitamin D and challenged with two strains of S. aureus had an increase in phagocyti... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O Melanoma é um tipo de neoplasia que se origina de melanócitos normalmente presentes na epiderme. Uma das características do melanoma é a capacidade de adquirir resistência a terapias. As células de melanoma podem aumentar a liberação de vesículas extracelulares (VEs) em resposta ao tratamento com quimioterápicos. A cisplatina (CDDP) e a temozolomida (TMZ) são drogas utilizadas para o tratamento de tumores. Ambas as drogas formam adutos no DNA, mas as vias de sinalização que deflagram a morte celular são distintas. O objetivo desse estudo é investigar a morte celular da linhagem B16-F10 na presença de VEs oriundas de células B16-F10 tratadas com cisplatina CDDP ou TMZ. Inicialmente as VEs oriundas de células de melanoma murino, B16-F10, tratadas com CDDP ou TMZ e seus controles, foram isoladas por ultracentrifugações sucessivas. Para os experimentos in vitro, as células foram tratadas com as drogas em combinação com as respectivas VEs. As amostras foram realizados avaliações de ciclo celular e de morte e ensaio clonogênico. Para os experimentos in vivo, as células B16-F10 foram pré-tratadas com VEs, e posteriormente, as células foram inoculadas via subcutânea em camundongos C57BL/6 e os tumores foram mensurados diariamente. Em nosso estudo concluimos que a metodologia do isolamento de VEs é eficiente. Além disso, observamos que o tratamento com CDDP ou TMZ aumenta a liberação de VEs por células tumorais. Apesar do resultado contraditorio, as VEs liberadas por células tumorais tratadas com quimioterápicos aumentam a capacidade de sobrevivência das células de melanoma in vitro. VEs oriundas de células de melanoma não participam inicialmente da sensibilização à morte de células tumorais causada pelas mesmas drogas, mas a longo prazo, as VEs oriundas de células tratadas com a TMZ podem conferir uma resposta celular de sobrevivência às células tumorais in vitro. In vivo, o resultado é inconclusivo, uma vez que para confirmar se as VEs fazem parte da adaptação tumoral conferindo fenômenos de sobrevivência celular in vivo, é necessário avaliar em outros modelos celulares e animais / Melanoma is a neoplasm derived from melanocytes normally present in the skin specifically in the epidermis. One of the malignancies of melanoma is the ability to acquire chemoresistance. Cisplatin (CDDP) and temozolomide (TMZ) are drugs used for the treatment of tumors. Both drugs can form alkylating adducts in DNA, however, the pathways that trigger cell death are distinct. Tumor cells, including melanoma, may increase the release of extracellular vesicles (EVs) in response to chemotherapeutic treatment. The aim of this study is to investigate the cell death phenomenon in B16-F10 cell line in presence of EVs derived from chemotherapeutic-treated B16-F10 cells. For in vitro experiments, the cells were treated with CDDP or TMZ in combination with EVs from chemotherapictreated samples. For in vivo experiments, B16-F10 cells were exposed to EVs and inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. The growth was measured daily. In this work, we established and characterized VEs released by melanoma cells treated with chemotherapics and we established chemotherapics treatments to isolate EVs for next EVs isolation. Our results showed that CDDP or TMZ treatment increase the release of EVs by tumor cells. The EVs released by melanoma cells after CDDP or TMZ treatment seem to increase the survival capacity of melanoma cells. Thus, we concluded that EVs derived from melanoma cells do not participate in the cell death sensitization induced by CDDP or TMZ. However, EVs derived from TMZ treated cells may offer a survival effect to tumor cells in vitro a long term. In vivo, The result is inconclusive since to confirm how VEs are part of the tumor adaptation conferring cellular survival phenomena in vivo, it is necessary to evaluate in other cellular and animal models