La mucoviscidose (Cystic Fibrosis, CF) est caractérisée par des mutations dans le gène CFTR codant pour un canal chlorure situé à la membrane apicale des cellules épithéliales. La mutation principalement retrouvée chez les patients (CF) est la mutation F508del qui entraine une rétention du canal dans le RE des cellules, et son absence à la membrane apicale. Cette mutation va avoir de nombreuses conséquences sur la signalisation cellulaire. Outre la perte d’activité de canal chlorure du CFTR, de nombreux canaux ioniques sont dérégulés entrainant notamment des défauts dans la sécrétion d’ions et d’eau par les épithéliums. Une forte dérégulation de l’homéostasie calcique des cellules exprimant la mutation F508del a également été montrée, et pourrait participer de manière importante aux différentes atteintes cellulaires observées dans ces cellules. L’objectif de cette thèse a été d’une part de poursuivre la description de la dérégulation de l’homéostasie calcique observée dans la mucoviscidose et d’autre part de caractériser l’implication d’une protéine du RE sensible au Ca2+, la caluménine, dans ces dérégulations et dans la biosynthèse du CFTR. Nous avons retrouvé dans notre modèle cellulaire de cellules épithéliales bronchiques CF un certain nombre des dérégulations de l’homéostasie calcique décrites précédemment et mis en évidence de nouvelles dérégulations. Ainsi une modulation de l’activité des pompes SERCA et PMCA due à la dérégulation de l’interaction entre le CFTR muté et ces protéines a été identifiée pour la première fois. Nous avons de plus démontré que la caluménine joue un rôle important de chaperonne du CFTR et que la modulation de son expression régule la biosynthèse du CFTR. Nos travaux ont de plus établi l’implication de la caluménine dans la régulation de l’activité des pompes SERCA dans les cellules épithéliales bronchiques. / Cystic Fibrosis (CF) is characterized by mutations in the CFTR gene that encodes for an apical plasma membrane chloride channel in epithelial cells. The most common mutation found in CF is the F508del mutation, which lead to the synthesis of a wrongly conformed CFTR protein sequestered in the endoplasmic reticulum (ER) and absent of the plasma membrane. CFTR ER retention has important consequences on cell signaling. Besides its Cl- channel activity, CFTR regulates many ionic channels, and its mutations lead to defects in epithelial ionic and water secretion. Moreover an important deregulation of Ca2+ homeostasis is observed in CF cells that impacts a large range of cellular functions. The aim of this work was firstly to pursue the description of Ca2+ homeostasis defects in CF cells, and secondly to characterize the implication of calumenin, an ER Ca2+-sensitive protein, in these deregulations and in CFTR biosynthesis. We observed in our CF epithelial cell models some of the previously described deregulations in Ca2+ homeostasis, and highlighted new deregulations. Indeed, we showed for the first time perturbations of SERCA and PMCA pumps activities in CF cells. These deregulations are mediated by a modified interaction of these pumps with CFTR. Moreover, we demonstrated that calumenin acts as a CFTR chaperone, and modulating calumenin expression modifies CFTR biosynthesis. Finally, we also characterized calumenin implication in epithelial cell Ca2+ homeostasis.

Introduction : La mucoviscidose est une maladie génétique autosomale récessive causée par des mutations dans le gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Ce dernier code un canal chlorure AMPc-dépendant localisé dans la membrane apicale des cellules épithéliales, dont l’activité est régulée par de nombreuses interactions protéine-protéine. Dans le cadre de la recherche de nouveaux partenaires du CFTR, une interaction directe entre le canal (sauvage et muté F508del) etl’annexine A5 (AnxA5) a été mise en évidence dans notre laboratoire. Des stratégies de sur et de sousexpression nous ont également permis d’établir un lien fonctionnel entre les deux protéines. En effet, nos travaux montrent que les sécrétions ioniques dépendantes du CFTR sont corrélées au niveau d’expression intracellulaire de l’AnxA5. Par ailleurs, une élévation des courants médiés par le CFTR ainsi qu’une augmentation de la quantité de canaux dans la membrane plasmique sont observées suite à la surexpression de l’AnxA5 dans des cellules exprimant le CFTR muté F508del.But de l’étude : Au vu de ces observations, l’AnxA5 apparaît comme une cible potentielle pour la correction de certains défauts engendrés par la mutation F508del. Une piste thérapeutique pourrait être l’identification de composés capables d’augmenter son expression dans des cellules épithéliales exprimant le mutant F508del de la protéine CFTR. Considérant les informations fournies par la littérature, notre choix s’est porté sur la GnRH (gonadotropin-releasing hormone), molécule utilisée en thérapeutique humaine depuis plus de 25 ans. Ainsi, nous avons évalué l’effet de la GnRH sur la modulation de l’expression de l’AnxA5 et sur le transport ionique dépendant du CFTR dans nos différents modèles d’étude Résultats : Outre la présence du récepteur de la GnRH dans nos modèles cellulaires, nous montrons également que l’expression de l’AnxA5 y est augmentée dès 60 minutes de traitement avec l’hormone (1 nM). De plus, comparativement à des cellules non stimulées, des cellules prétraitées avec la GnRH présentent une hausse significative des sorties actives d’iodure, corrélant avec une augmentation de la quantité de CFTR à la surface cellulaire. Ces observations ont été faites dans les modèles exprimant le CFTR muté F508del ainsi que dans ceux exprimant le CFTR sauvage. Conclusion : Dans nos modèles et selon nos conditions de stimulation, un traitement avec la GnRH augmente l’expression intracellulaire de l’AnxA5 et conduit à une élévation des sécrétions ioniques médiées par le canal CFTR. Néanmoins, au vu de la multitude de voies de signalisation susceptibles d’être activées et de gènes pouvant être régulés suite à la liaison de la GnRH sur son récepteur, l’effet observé sur l’AnxA5 ne représente probablement pas le seul évènement cellulaire à l’origine de l’impact positif enregistré sur l’activité du canal CFTR. / Background: Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disorder caused by mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, which encodes a cAMP-stimulated chloride channel. CFTR is primarily located at the apical surface of epithelial cells, where its activity is regulated by some protein-protein interactions. As part of new CFTR’s partners research, we previously showed that annexin A5 (AnxA5) binds directly to both normal and F508del-CFTR. Moreover, under and overexpression strategies led us to establish a functionnal link between these two proteins. In fact, CFTR-dependent ion secretions are correlated to the intracellular level of AnxA5. Otherwise, in transfected epithelial cells, AnxA5 overexpression increases CFTR’s level in plasma membranes and raises CFTR-mediated currents in F508del-CFTR expressing cells. Aim of the study: In the light of these findings, AnxA5 appears as a potential target in order to correct some defects caused by the F508del mutation. A therapeutic approach would be to find some compounds capable of increasing AnxA5 expression in F508del-CFTR expressing epithelial cells. Reviewing the literature, our choice fell on GnRH (gonadotropin-releasing hormone), a commonly used molecule for diverse clinical applications for 25 years. So, the effects of GnRH on the modulation of AnxA5 expression and on CFTR-dependent ion transport were assessed in our different cellular models. Results: Beside the GnRH receptor expression, we show that AnxA5 expression is augmented in all cell lines after one hour incubation with the hormone (1 nM). Moreover, compared to untreated cells, a significant iodide efflux peak is measured in GnRH pretreated, which is correlated with an increased cell surface expression of CFTR. It is of interest to note that these observations have been made in CF and non-CF cells. Conclusion: In our models and according to our stimulation conditions, GnRH treatment enhances AnxA5 intracellular expression and leads to a rise of CFTR-dependent ion secretions. Nevertheless, given the multitude of activated signaling pathways and regulated genes in response to GnRH binding to its receptor, the positive impact on CFTR activity is probably not solely explained by the effect on AnxA5 expression.

La mucoviscidose est la maladie héréditaire autosomique récessive, rare, létale, la plus fréquente dans la population caucasienne. Cette maladie est causée par des mutations du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) codant la protéine CFTR. Cette protéine est principalement un canal chlorure (Cl-) AMPc-dépendant localisé dans la membrane apicale des cellules épithéliales. La mutation F508del entraîne un défaut de maturation de la protéine qui est retenue dans le réticulum endoplasmique avant d’être dégradée. Cependant, une faible quantité de protéines malformées échappe à ce système de contrôle et parvient à la membrane plasmique.Des travaux de notre équipe ont montré une augmentation des efflux ioniques dépendants du CFTR dans des lignées cellulaires épithéliales bronchiques (CFBE41o-), exprimant le CFTR sauvage ou le CFTR muté F508del, après un traitement par une hormone: la gonadolibérine (GnRH, Gonadotropin releasing hormone, 1h, 10-9M). Cette augmentation est vraisemblablement due à un nombre plus important de canaux CFTR à la membrane plasmique.L’objectif de cette thèse a été de tester un analogue de la GnRH comme modulateur de l’exportation membranaire et/ou de l’activité canal du CFTR muté, sur des cultures primaires de cellules épithéliales nasales humaines homozygotes pour la mutation F508del. Dans un premier temps, nous avons vérifié la présence du récepteur à la GnRH (R-GnRH) dans notre modèle cellulaire. Puis, nous avons étudié l’effet de l’analogue sur la fonction du CFTR par des techniques d’électrophysiologie. Nous avons observé une augmentation des efflux d’ions Cl- médiés par le canal CFTR après un traitement à l’analogue (2h, 10-12M). Enfin, une étude protéomique nous a permis d’identifier des protéines différentiellement exprimées après traitement. Certaines protéines mises en évidence pourraient appartenir à des voies de signalisation intracellulaires ayant un rôle dans la régulation de la protéine CFTR et être des cibles thérapeutiques.Par ailleurs, le canal CFTR est régulé par le Mg2+ intracellulaire ([Mg2+]i). Le canal TRPM7 est le principal régulateur du [Mg2+]i. La [Mg2+]i a été mesurée et l’expression de TRPM7 vérifiée dans des cellules Hela transfectées avec le CFTR sauvage (wt) ou mutés (G551D et F508del). Nous avons étudié la localisation, la fonction et la régulation de TRPM7 dans nos modèles cellulaires avant de rechercher un possible lien fonctionnel entre le CFTR et TRPM7. Dans les modèles CF, l’expression, la fonction et la localisation du canal TRPM7 sont altérées. Il existerait un lien fonctionnel entre TRPM7 et le CFTR par l’intermédiaire de la diminution du [Mg2+]i impliquant TRPM7 dans la physiopathologie de la mucoviscidose. / Cystic fibrosis is the most common lethal autosomal recessive disease in the Caucasian population. This disease is caused by mutations in the gene encoding the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) protein. This protein is a cAMP-regulated chloride channel expressed at the apical membrane of epithelial cells. The F508del mutation causes a defect in CFTR protein folding preventing its maturation. Some misfolded proteins escape the control system and reach the plasma membrane.We previously showed a rise of CFTR-dependent ion efflux in wt- and F508del-CFTR human bronchial epithelial expressing cells (CFBE41o-) after incubation with GnRH (Gonadotropin releasing hormone; 1h, 10-9M). This increase was probably due to an increased cell surface expression of CFTR.The aim of the present study was to test a GnRH analog as a modulator of CFTR delivery to the plasma membrane and/or activity of CFTR on primary culture of human nasal epithelial cells (F508del/F508del).We checked the GnRH receptor expression in our model. Then, we studied the GnRH effect on CFTR’s function by electrophysiology. We found a significant increase of CFTR dependent chloride efflux in cells pretreated with analogue (2h, 10-12M). Proteomic study enabled us to identify differentially expressed proteins after treatment. Some highlighted proteins could be part of signalling pathways regulating CFTR and could be therapeutic targets.Moreover, CFTR is regulated by intracellular Mg2+ ([Mg2+]i). TRPM7 (Transient Receptor Potential Melastatin 7) is the main channel regulating [Mg2+]i. [Mg2+]i and TRPM7 expression were measured in Hela cells stably expressing wildtype and two CFTR mutants (F508del-CFTR and G551D-CFTR). We studied TRPM7 expression, function and regulation in our cell models before examining a functional link between TRPM7 and CFTR. In CF models, TRPM7 expression, localization and function are altered. There should be a functional link between TRPM7 and CFTR through the decreased [Mg2+]i involving TRPM7 in cystic fibrosis physiopathology.