L'apoptose est un processus primordial pour le développement et le maintien des organismes eucaryotes. Elle est régulée à différents niveaux de l’expression génique. En fonction des stimuli intra- et extra-cellulaires, les facteurs de transcription régulent l'expression des protéines pro-survies et pro-apoptotiques. Ces facteurs de transcription facilitent la formation du complexe de pré-initiation (CPI) de la transcription pour activer la transcription. Le CPI est composé de l’ARN polymérase II et des facteurs généraux de transcription dont le facteur de reconnaissance du promoteur, TFIID. TFIID est un complexe multi-protéique composé de la protéine de liaison de la boîte TATA (TBP) et de 14 facteurs associés à TBP (TAFs) tel que TAF6 qui nous intéresse. TAF6 est exprimé sous 5 isoformes d'épissage alternatif (?, ?, ?, ð, ? ). TAF6? et TAF6ð sont deux entités antagonistes. Ils sont issus de l’épissage alternatif du deuxième exon de TAF6. Contrairement au variant majoritaire TAF6? qui a une activité oncogénique et antiapoptotique, le variant minoritaire TAF6ð est pro-apoptotique. À l’opposé de TAF6?, l’excision de la partie alternative du deuxième exon empêche la dimérisation de TAF6ð avec TAF9 dans TFIID (TFIID?). Les analyses de puce à ADN ont montré que l'impact sur le transcriptome de la perte de TAF6? est fortement distinct de l'impact causé par l'induction de l’isoforme pro-mort TAF6ð par des oligonucléotides antisens qui bascule l’épissage (SSO pour Splice site Switching Oligonucleotids). En outre, la déplétion du variant d'épissage majeur TAF6? aboutit à la perte de la viabilité des cellules. L'importance de l'induction de TAF6ð dans la mort cellulaire programmée et nos résultats précédents montrant que TAFð induit l’apoptose indépendamment de p53 dans de nombreux types de cellules cancéreuses, nous ont incités à entreprendre une dissection des éléments cis d'ARN qui contrôlent l'épissage du variant TAF6ð. Nous avons développé un système de minigène pour étudier les éléments cis d'ARN qui contrôlent l'expression de TAF6ð. Le minigène inclut la séquence génomique de TAF6 (exon 2 à exon 3) qui est dirigé par le promoteur CMV et il mime le patron d’épissage alternatif de TAF6? et TAF6ð endogène. Nous avons entrepris une analyse mutationnelle pour identifier les éléments cis de TARN pré-messager de TAF6. Nos données ont mis en évidence un site activateur d'épissage dans l’exon 2 constitutif. Dans l’intron, deux motifs polyC et polyG pourraient réguler l’épissage alternatif de TAF6ð. Ces motifs représentent des sites potentiels de liaison pour les protéines de liaison à l’ADN, hnRNP K et H respectivement. Nous avons donc testé l’effet de la surexpression de hnRNP K et H sur l’épissage alternatif de TAF6 et nous n'avons eu aucuns changement sur l’expression de TAF6ð endogène. De plus, nous avons constaté que la mutation d'un seul nucléotide qui semble perturber la structure secondaire d'ARN au site d’épissage proximal, renverse complètement le patron d’épissage. Cette mutation favorise le choix du site d’épissage distal (un site faible) à la place du site d’épissage proximal (TAF6?). Nos résultats suggèrent aussi qu’un élément régulateur d’épissage qui favorise TAF6? est présent dans l’exon 2 alternatif. Pour permettre l’identification des facteurs d’épissage influençant le choix du site d’épissage, nous avons créé un nouveau système d’épissage rapporteur. Notre nouveau vecteur contient la séquence génomique de TAF6 (exon 2 à exon 4) modifiée par l’introduction d’un codon stop prématuré (CSP) dans l’exon 2 alternatif et fusionné à la protéine EYFP. La combinaison des essais de transfections transitoires avec les SSOs ont été utilisés pour valider ce système contrôlé par cytométrie de flux. Dans le futur, ce système pourrait être utilisé pour produire une lignée stable afin d'identifier les facteurs d’épissage impliqués dans la régulation de l’épissage alternatif par un criblage d’inhibition (siRNA) ou de surexpression (ADNc). Donc, mon projet présente la première identification des éléments cis qui contrôlent l’épissage du facteur aussi bien que le développement d’un système d'épissage rapporteur créé pour permettre l’identification des protéines d'épissage qui régulent l’expression de TAF6ð. [symboles non conformes]

Les protéines U2AF65, CAPERα, PUF60 et SPF45 sont des facteurs d'épissage qui possèdent des domaines similaires appelés UHM et qui interagissent pendant les étapes précoces de l'épissage avec des protéines qui possèdent des domaines ULM, comme SF3b155. Par des approches biochimiques, nous avons mis en évidence la formation d'assemblages macromoléculaires par U2AF65 et CAPERα au contact du domaine multi-ULM de SF3b155. En diminuant les taux d'expression des facteurs d'épissage à domaines UHM avec des shRNA et en analysant par qPCR l'épissage de 65 exons cassette, nous avons identifié un rôle activateur de CAPERα, U2AF65 et PUF60 et un rôle répresseur de SPF45 dans l'épissage. Plus particulièrement, CAPERα et U2AF65 activent l'épissage des exons cassette présentant des séquences flanquantes en 5' riches en motifs polypyrimidine. De plus, ces séquences favorisent la formation des assemblages macromoléculaires de U2AF65 et CAPERα. Appuyés par ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel des interactions multivalentes conduisent à la formation d'assemblages macromoléculaires par CAPERα et U2AF65 ; ces complexes ont une affinité particulière d'une part pour les séquences introniques riches en motifs polypyrimidine et d'autre part avec le domaine multi-ULM de SF3b155. L'ensemble de ces interactions favorise la reconnaissance des sites 3' d'épissage. / U2AF65, CAPERα, PUF60 and SPF45 are splicing factors that hold similar domains called UHM that interact during the early splicing steps with ULM domains proteins, such as SF3b155. Using biochemical approaches, we highlighted the formation of macromolecular assemblies by U2AF65 and CAPERα in contact with the multi-ULM domain of SF3b155. The inhibition of the expression of the UHM splicing factors by shRNA, followed by a qPCR analysis of 65 cassette exons led us to identify an activating role of CAPERα, U2AF65 and PUF60 and a repressing role of SPF45 in splicing. Particularly, CAPERα and U2AF65 activate splicing of cassette exons presenting long pyrimidine-rich 5' flanking regions. Moreover, these regions favor the formation of macromolecular assemblies of U2AF65 and CAPERα. On the basis of these results, we propose a model in which multivalent interactions lead to CAPERα and U2AF65 macromolecular assemblies; these assemblies present a particular affinity on one hand for long pyrimidine-rich introns and on the other one for the multi-ULM domain of SF3b155. All these interactions promote 3' splice sites recognition.

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) reste un problème majeur de santé publique. L’infection chronique par le VHB peut conduire au développement d’une cirrhose et d’un carcinome hépatocellulaire (CHC). L’ARN pré-génomique du VHB (ARNpg), matrice de la réplication virale, peut aussi subir un épissage alternatif dans les hépatocytes. L’ARN simple-épissé SP1 (ARNSP1) est le variant majeur détecté. L’ARNSP1 génère des particules virales défectives (VHBd) et code la protéine HBSP (HBV splicing-generated protein). Des études récentes ont démontré que la proportion de VHBd dans le sérum augmente lors de la progression de maladies hépatiques et précède le développement de CHC. Notre équipe ainsi que d’autres ont décrit qu’HBSP pouvait pirater les voies de signalisation intervenant dans l’immunité innée et limiter l’étendue de l’inflammation du foie. Le but de notre étude est de comprendre la régulation de l’épissage alternatif viral et cellulaire au cours de la pathogenèse hépatique. Nous avons montré:1) une diminution du recrutement immunitaire et une réduction de la fibrose hépatique les souris exprimant HBSP régulée par épissage alternatif. 2) dans 6 modèles murins différents une régulation de l’expression des facteurs épissage variable selon la maladie du foie et définissant une signature spécifique. Cette régulation de facteurs d’épissage et de l’épissage alternatif a été observée dans les CHC de patients. En conclusion, nos résultats soulignent l’impact de l’atteinte hépatique sur l’expression des facteurs d’épissage, lesquels pourraient contribuer à réguler à la fois l’épissage viral et cellulaire et par conséquent, la progression de la pathogenèse hépatique. / Hepatitis B virus (HBV) infection remains a major public health problem with 250 million chronic carriers worldwide. Chronic HBV infection may lead to the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). HBV pregenomic RNA (pgRNA), matrix of viral replication, could also undergo alternative splicing (AS) in hepatocytes. The singly spliced SP1RNA is the major HBV spliced variant detected. SP1RNA generates defective viral particles (dHBV) and encodes for HBV splicing-generated protein (HBSP). Recent studies found the proportion of serum dHBV increased during the progression of liver disease and prior to development of HCC. In addition, our group and others revealed that HBSP hacked signaling pathways involved in innate immunity and limit the extent of liver inflammation. The aim of our study was to investigate the regulation of viral and cellular alternative splicing in the pathogenesis of liver diseases. Our data showed that 1) the modulated expression of splicing factors in HBV transgenic mice contributed to an increase of SP1RNA encoding for HBSP. In HBSP transgenic mice, HBSP expression led to the decrease of inflammatory mono/macrophages recruitment and consequently impaired liver fibrogenesis. 2) the pattern of selected splicing factors expression varied according to liver disease in mouse models, and overexpression of splicing factors and enhanced alternative splicing of target genes were observed in HCC tumors. In conclusion, our data highlighted the impact of liver diseases on the expression of splicing factors which may contribute to regulate both viral and cellular splicing events and consequently the progression of liver pathogenesis.

TDP-43 est une protéine de liaison aux acides nucléiques qui joue un rôle essentiel dans le métabolisme de l'ARN. À l'état physiologique, un contrôle strict des niveaux d’expression de cette protéine est critique pour la fonction et la survie cellulaire. Une boucle d'autorégulation négative est à la base de ce contrôle du taux intracellulaire de TDP-43. Laquelle a été identifiée comme le constituant principal des inclusions observées chez une majorité des patients atteints de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) ou de Dégénérescence Lobaire Fronto-Temporale (DLFT). A ce jour, plus de 50 mutations faux-sensdu gène TARDBP/TDP-43 ont été décrites chez des patients DLFT/SLA, démontrant le rôle clé de TDP-43 dans ces pathologies neurodégénératives. Notons cependant que les conséquences fonctionnelles de ces mutations ne sont pas complètement déterminées. Plusieurs études suggèrent qu’une élévation des niveaux d’accumulation de TDP-43 pourraitparticiper aux mécanismes physiopathologiques. La modulation du cycle de production de TDP-43 pourrait donc constituer une nouvelle stratégie thérapeutique. Ce travail de recherche avait donc pour principal objectif d’identifier des modulateurs génétiques de la production de TDP-43 en utilisant un nouveau modèle de drosophile transgénique mimant les principales étapes d’autorégulation de TDP-43. Nous avons ainsi pu montrer que la modulation des niveaux d’expression de la protéine TCERG1 et de plusieurs facteurs d'épissage, parmi lesquels SRSF1, SRSF3 et SF3B1, influe sur les niveaux de production deTDP-43. Nous avons également montré que la présence des mutations DLFT/SLA n’altère pas la capacité de la protéine à s’autoréguler. / TDP-43 is a DNA/RNA binding protein that plays an important role in RNA metabolism. In the physiological state, strict control of its expression levels is critical for cell function and survival. TDP-43 expression is tightly regulated through an autoregulatory negative feedback loop. This protein has been identified as the principal component of the inclusions observed in a majority of patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) or FrontoTemporal Lobar Degeneration (FTLD). To date, more than 50 missense mutations of the TARDBP / TDP-43 gene have been described in FTLD / ALS patients, demonstrating the key role of TDP-43 in these neurodegenerative pathologies. However, the functional consequences of TDP-43 mutations are not completely determined. Several studies suggest that high accumulation levels of TDP-43 may participate in pathophysiological mechanisms. The modulation of the production cycle of TDP-43 may therefore provide a new therapeutic strategy. The main goal of this research project was to identify genetic modulators of TDP-43 production by using a novel transgenic Drosophila model mimicking main steps of TDP-43 the autoregulatory mechanism. We identified several splicing factors, including SF2, Rbp1 and Sf3b1, as genetic modulators of TDP-43 production. We have also shown that modulation of TCERG1 expression levels affect TDP-43 production levels in flies. Finally, we found that FTLD/ALSlinked TDP-43 mutations do not alter TDP-43’s ability to self-regulate its expression and consequently of the homeostasis of TDP-43 protein levels.