Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2001. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 84-94).

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 76-93. Publié aussi en version électronique.

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T00:23:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amstalden_LucilaGobby_M.pdf: 4346952 bytes, checksum: 99d5f1ab2aae2aeb65d633016bc318a8 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A Anemia de Fanconi (AF) é uma doença caracterizada por múltiplas anomalias congênitas, progressiva falha da medula óssea e alto risco para desenvolvimento de câncer. E denominada também de Síndrome da Instabilidade Cromossômica devido ao fato de suas células apresentarem hipersensibilidade a agentes indutores de quebras cromossômicas. A mais importante das características clínicas é a manifestação hematológica. A incidência da anemia aplástíca, Síndrome Mieloplásica e Leucemia Mielóide Aguda é a maior resposável pela morbidade e mortalidade na AF A incidência da AF em todo o mundo é de. aproximadamente, 3 por milhão. No Brasil não há dados sobre a prevalência da doença. Foram descobertos 12 grupos de complementação e descobertos, até o momento. 11 genes relacionados ao distúrbio. São eles: FANCA. B, C, Dl, D2, E. F G, I, J, L e M. O trabalho teve como objetivo geral a análise das mutações principais (IVS8+2A>G, IVS11+lOC, IVS3+1G>C e 1794J803dellO) do gene FANCG em pacientes com quadro clínico compatível com AF. Foram analisados 38 indivíduos por meio da técnica de PCR associada à digestão e triagem por SSCP e subseqüente seqüenciamento. Nós encontramos um homozigoto para a mutação IVS8+2A>G e uma variante neutra (H482H). Concluímos com nosso estudo que, há uma heterogeneidade molecular em nosso meio; o DEB teste não é 100% eficaz na detecção de indivíduos com AF; o Teste de Complementação deve ser introduzido o quanto antes em nosso país para auxiliar no direcionamento da pesquisa para um determinado gene e minimizar os casos em que não há a confirmação de diagnóstico e, por último, há a necessidade de um Registro Brasileiro para AF com o objetivo de recolher informações clinicas e genéticas de indivíduos com o distúrbio. / Abstract: Fanconi anaemia (FA) is an autosomal recessive disease characterised by congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and high risk of developing cancer. It's called Chromosomal Instability Syndrome due to the fact of cells presents hipersensibility to DNA cross-linking agents like mitomycin C and diepoxybutane. The most important clinical feature is hematologic. The incidence of aplastic anemia, myelodysplastic syndrome and acute myeloide leukaemia is the most important cause of morbidity and mortality in FA. The incidence of FA is approximately three per million and the heterozygote frequency is estimated at 1 in 300 in Europe and United States. In Brazil there's not data about prevalence of FA. It was discovered at least 12 complementation groups and eleven gene have been cloned: FANCA, B, C, DJ, D2, E, F, G, I, J, L eM. The study had as general objective the analysis of the main mutation (IVS8-2A>G, TVSll+lOC, IVS3+1G>C e 1794J803dell0) of FANCG gene in patients with clinical features of FA. It was analysed 38 patients through the test polymerase chain reaction (PCR) associated with digestion and mutation screening by SSCP with posterior sequencing. Molecular analysis found a homozygote to rVS8+2A>G and a neutral variant (H482H). We concluded that there's a molecular heterogeneity in our region; it's necessary to introduce the use of complementary tests in Brazil, in order to address the molecular analysis and at last, it's necessary a Brazilian Fanconi Anemia Registry (BFAR) to receive clinical and genetics information of AF patients. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T11:46:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_ClaudiaEstela_M.pdf: 1883480 bytes, checksum: 5c9ad07b778588f38de1f644ecd18847 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A Anemia de Fanconi (AF) é uma doença que apresenta herança autossômica recessiva. É caracterizada por múltiplas anomalias congênitas, progressiva falha da medula óssea e alto risco para desenvolvimento de câncer. A mais importante das características clínicas é a manifestação hematológica, responsável pelo grande número de morbidade e mortalidade em portadores de AF. Também é chamada de síndrome da instabilidade cromossômica por apresentar hipersensibilidade a agentes clastogênicos como a mitomicina C e diepoxibutano. A incidência da AF em todo o mundo é de aproximadamente, três por milhão e a frequência de heterozigotos é estimada em um para 300 na Europa e Estados Unidos. No Brasil não há dados sobre a prevalência da doença. Foram descobertos até o momento 13 grupos de complementação (FANCA, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M e N), e os 13 genes foram clonados e pelo menos 11 genes estão relacionados ao distúrbio. O presente estudo teve como objetivo a análise das principais mutações (IVS4+4A>T, Q13X, W22X, DG322, R185X, L496R, L554P, e R548X) do gene FANCC em pacientes com quadro clínico de AF. Foram analisados 121 indivíduos com clínica compatível à AF e com DEB teste positivo. Na amostra encontramos 14% de indivíduos heterozigotos e 4% de indivíduos homozigotos para as mutações mais freqüentes do gene FANCC. As mutações mais prevalentes foram: IVS4+4A>T com 6,6% dos alelos analisados, com freqüência similar à encontrada na literatura, W22X com 2.47% dos cromossomos analisados e Q13X com 1.23% dos cromossomos analisados. Na triagem de mutações pela técnica de SSCP, encontramos alterações nos éxons 1, 4 e 6. / Abstract: Fanconi anaemia (FA) is an autosomal recessive disease characterized by congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and high risk of developing cancer. The most important of the clinic feature is hematologic, and too the most important cause of morbidity and mortality in FA. It's also called Chromosomal Instability Syndrome to the fact of cells presents hipersensibility to DNA cross-linking agents like mitomycin C and diepoxybutane. The incidence of FA is approximately three per million and the heterozygote frequency is estimated at 1 in 300 in Europe and United States. In Brazil there's no data about prevalence of FA. It was discovered at least 13 complementation groups (FANCA, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M e N), and 13 genes have been cloned and there are at least 11 that are related to the disease. The study had as general objective the analysis of the main mutations (IVS4+4A>T, Q13X, W22X, DG322, R185X, L496R, L554P, and R548X) of FANCC gene in patients with clinic compatible of FA. We analyzed 121 patients with compatible clinic and positive DEB test. In the sample we found 14% of individuals heterozygous and homozygous individuals of 4% for the most frequent mutations of the gene FANCC. Mutations were more prevalent: IVS4 4 A> T with 6.6% of alleles tested, often similar to that found in the literature, W22X with 2.47% of chromosomes analyzed and Q13X with 1.23% of chromosomes analyzed. In screening for mutations by the technique of SSCP, we found changes in exons 1, 4 and 6. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

La préservation d’un stock de cellules souches fonctionnelles est indispensable pour le maintien de nombreux tissus chez l’adulte. Les cellules souches se multiplient pour s’auto-renouveller et entrent en différenciation donnant naissance à des progéniteurs puis à des cellules matures. Récemment, la possibilité pour les progéniteurs de se reprogrammer en cellules souches et de réacquérir un potentiel de régénération à long terme a été suggérée notamment dans le tissu germinal. Ainsi, l’auto-renouvellement et la reprogrammation des progéniteurs pourraient jouer un rôle dans le maintien du pool de cellules souches. Mon travail de thèse portait sur l’étude de ces deux mécanismes de régénération des cellules souches chez la souris. J’ai tout d’abord étudié la reprogrammation des progéniteurs germinaux au cours de la spermatogenèse. Ce travail montre la capacité des progéniteurs germinaux mâles, les spermatogonies différenciées, à modifier leur programme de différenciation et à générer de nouvelles cellules souches germinales après transplantation testiculaire. Les progéniteurs germinaux pourraient ainsi constituer une réserve de « cellules souches potentielles ». Le tissu germinal possède donc une certaine plasticité. La seconde partie de mon travail porte sur l’implication du gène Fancg de l’anémie de Fanconi, voie de réponse aux dommages à l’ADN, dans l’auto-renouvellement et la fonctionnalité des cellules souches hématopoïétiques au cours de l’hématopoïèse. L’intégrité génétique des cellules souches doit en effet être préservée tout au long de la vie de l’individu. Cette étude montre que l’invalidation du gène Fancg perturbe le processus de migration, la quiescence, et la régulation de l’expression de certains gènes clés des fonctions des cellules souches. Ces altérations participent au déficit fonctionnel des cellules souches hématopoïétiques observées dans le modèle murin Fancg-/-. / The long-term maintenance of the stem cell pool is necessary to preserve the functionality of an organ throughout life. Stems cells proliferate in order to selfrenew or to be committed to differentiate to produce progenitors and finally highly specialized cells. Recent reports have suggested that germinal progenitors could reprogram into stem cells and reacquire a potential to regenerate tissue at long-term. Thus, the stem cell selfrenewal process and the reprogramming of progenitors could play a role in the maintenance of the stem cell pool. The project of my thesis focused on those two mechanisms of stem cell regeneration in the mouse model. First, I investigated the reprogramming process of the germinal progenitors during spermatogenesis. Our results show that male germinal progenitors, the differentiating spermatogonia, can change their differentiation program and generate new functional germinal stem cells after testicular transplantation. The germinal progenitors could constitute a pool of potential stem cell, and underscores the plasticity of the germinal lineage. A second part of my project dealt with the involvement of fancg, a gene of the Fanconi anemia DNA damage response pathway, in the selfrenewal and in the functions of the hematopoietic stem cells. The maintenance of the genetic integrity throughout life is particulary important for stem cells in order to safeguard the stem cell pool. Our study show that fancg deficiency induces the impairment of the migration potential and of the quiescence of stem cells, and modifies the expression of several key genes regulating stem cell functions. Those alterations contribute to the functional impairment of the hematopoietic stem cells observed in Fancg-/- mice.

Les protéines et les voies impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN (DDR), permettant de maintenir la stabilité génétique et de préserver la fidélité de la réplication, agissent non seulement comme l'initiation de la cancérogenèse mais peuvent également jouer un rôle majeur dans la progression tumorale et dans la résistance aux thérapies. La voie FANC joue un rôle central dans la stabilité génétique lors d'un stress réplicatif. La perte de fonction de cette voie est la cause d'un syndrome de fragilité chromosomique et de prédisposition au cancer appelé Anémie de Fanconi (FA).Nous avons démontré que les protéines FANC était surexprimées et suractivées dans les mélanome métastatiques exprimant le facteur de transcription MITF, un oncogène exprimé dans 80% des cas de mélanome. Nous avons identifié MITF comme un régulateur majeur de l'expression des transcrits codant les protéines de la voie FANC dans les cellules de mélanomes et montré que les cellules déplétées pour MITF présentaient les caractéristiques des cellules FA, i.e., une hypersensibilité aux agents pontants l'ADN. De plus, la voie FANC module également la migration des cellules de mélanome. Nos observations montrent le rôle central de cette voie de réparation dans la résistance des cellules de mélanomes aux dommages de l'ADN. Cette voie serait donc une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du mélanome.Nous avons également observé que la perte de fonction de la voie FANC augmente l'expression de MiTF dans des cellules FA et des cellules déplétées pour les protéines FANC. Nous avons montré que la voie FANC régule négativement l'expression de MITF au niveau transcriptionnel. Des résultats préliminaires montre que FANCD2 pourrait être associés au promoteur de MiTF au niveau d'un site de fixation de NF-kB, où il pourrait empêcher son action. La déplétion de MiTF conduit à une sensibilité aux agents pontants l'ADN dans des cellules contrôles mais pas dans des cellules FA, suggérant que MITF jouerait un rôle dans la DDR en régulant l'expression des protéines FANC. Enfin, nous avons montré que l'expression de MiTF est induite en réponse aux stimuli pro-inflammatoire. Enfin, l'expression altérée de MITF pourrait expliquer des défauts de pigmentation et la microphthalmie rapportés chez les patients FA. L'ensemble de ces données, à la fois validée et préliminaire, supporte l'existence d'une relation épistatique entre MiTF et la voie FANC. Cet voie aurait un rôle important à la fois dans la résistance au mélanome métastatique et dans certaines caractéristiques pathologiques de l'anémie de Fanconi. / Proteins and pathways involved in DNA damage response (DDR), maintaining genetic stability and safeguarding DNA replication, act not only as caretakers against cancer initiation but also play a major role in sustaining cancer progression and resistance to pharmacological-based therapies. The FANC pathway is central in maintaining genetic stability under conditions of replication stress and its loss-of-function is causative of the cancer predisposition and chromosome fragility syndrome Fanconi Anemia (FA).We demonstrate here that FANC proteins are over-expressed and over-activated in metastatic melanoma cells expressing the oncogenic microphthalmia-associated transcription factor (MiTF), which high expression is maintained in 80% of melanoma cases. We identified MiTF as a critical regulator of the expression of the mRNAs coding key proteins of the FANC pathway in melanoma cells and demonstrated that MiTF-silenced cells display the primary characteristics of FA cells, i.e., the cellular and chromosomal hypersensitivity to DNA interstrand crosslink- inducing agents. Moreover, FANC pathway also modulates melanoma cell migration. Our observations point to a central role of the FANC pathway in cellular and chromosomal resistance to DNA damage in melanoma cells. Thus, the FANC pathway appears as a promising new therapeutic target for melanoma treatment.Inversely, we observed that FANC pathway loss-of-function is associated to increased expression of MiTF in both FA patient-derived and siRNA-downregulated cells. We demonstrated that the FANC pathway negatively regulates MiTF expression at the mRNA level and have obtained preliminary data suggesting that FANCD2 associates to the MiTF promoter, impeding the action of the NF-kB transcription factor. MiTF depletion increases MMC sensitivity in FANC pathway proficient cells, but does not modify the sensitivity of FA cells, supporting the hypothesis that MiTF acts on the DDR by regulating the expression of FANC proteins. Finally, we demonstrated that MiTF expression is induced in response to inflammatory stimuli, like TNF-a. Thus, altered MiTF expression in FA could be involved in the pigmentation defects and microphthalmia reported in patients.In conclusion, we will present a corpus of both validated and yet preliminary data that strongly supports the existence of an epistatic relationship between MiTF and the FANC pathway. This circuitry appears to have an important role in melanoma resistance to chemotherapies and in some FA pathological traits.

Die Fanconi Anämie (FA) ist eine seltene autosomal und X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit, die zur Gruppe der Chromosomeninstabilitäts-Syndrome gehört. Klinisch manifestiert sich die FA durch kongenitale Fehlbildungen, progressives Knochenmarkversagen und eine Prädisposition für die Entwicklung von malignen Neoplasien in frühen Jahren. Am häufigsten ist unter FA-Patienten die Entstehung einer aplastischen Anämie zu beobachten mit einer kumulativen Inzidenz von 90% im Alter von 40 Jahren (Huck et al., 2006). Vom frühen Erwachsenenalter an stellen solide Tumoren, vornehmlich Plattenepithel-Karzinome des Oropharygeal- und Genitaltraktes, das Hauptproblem dar. Auf zellulärer Ebene ist die FA durch eine hohe spontane Chromosomenbrüchigkeit verbunden mit einer erhöhten chromosomalen Sensibilität gegenüber genotoxischen Substanzen und reaktiven Sauerstoffspezies gekennzeichnet. Seit einer stetigen Verbesserung der hämatopoietischen Stammzelltransplantation durch spezifische Konditionierungsprotokolle erreichen immer mehr FA-Patienten das Erwachsenenalter. In der Literatur häufen sich Berichte von FA-Patienten, die erstmalig im Erwachsenenalter durch ein frühes Auftreten von Malignomen oder Komplikationen in der Behandlung von Neoplasien diagnostiziert werden. Neben einer erfolgreichen HSZT können auch „ milde“ Mutationen oder die Bildung eines somatischen Mosaiks für das Überleben der FA Patienten in das Erwachsenenalter verantwortlich sein. Dies bedeutet, dass sich die FA als bisher rein pädiatrisch angesehenes Krankheitsbild mehr und mehr zu einer auch das Erwachsenenalter betreffenden Entität entwickelt. In der vorliegenden Arbeit wurden 131 FA-Patienten mit einem Alter von über 20 Jahren identifiziert und in verschiedene Gruppen eingeteilt. Damit wurde es möglich, die Verteilung der Patienten hinsichtlich ihres Geschlechts, der Komplementationsgruppe sowie der vermutlichen Ursachen für ein verlängertes Überleben dokumentieren zu können. 42 Patientenbeispiele stammen aus Literaturberichten von 1964 bis 2008, Informationen über 36 Patienten wurden dem US-amerikanischen Fanconi Anemia Research Fund („FARF“) entnommen und für 53 Patienten dienten die Krankenunterlagen des Instituts für Humangenetik an der Universität Würzburg als Grundlage. Es konnte gezeigt werden, dass etwa doppelt soviel Frauen wie Männer mit FA ein Alter jenseits des 20. Lebensjahres erreichten. Eine Zuordnung zu einer Komplementationsgruppe war bei 66 Patienten möglich. Diese ließ erkennen, dass im erwachsenen Patientenkollektiv die Komplementationsgruppen FA-A, FA-C, FA-D2, FA-G, FA-I und FA-J, jedoch keine der Gruppen FA-B, FA-D1, FA-E, FA-F, FA-L, FA-M und FA-N vertreten sind. Weiterhin wurden die erwachsenen FA-Patienten in vier verschiedene Gruppen nach der wahrscheinlichen Ursache ihres Überlebens eingeteilt werden: 26% erhielten eine erfolgreiche hämatopoietische Stammzelltransplantation, 17% entwickelten im Verlauf ein Mosaik, 4% konnten als Träger einer milden Mutation identifiziert werden. Die genaue Ursache für ein verlängertes Überleben bleibt jedoch bei 53% der FA-Patienten unbekannt, da Informationen bezüglich früherer Therapien und vor allem die Ergebnisse molekulargenetischer Untersuchungen fehlen. Bemerkenswert ist, dass der Großteil der über 50Jährigen ein Mosaik aufwies, während in dieser Altersgruppe Patienten mit erfolgreicher HSZT oder einer milden Mutation nur zu einem geringen Teil vertreten sind. Die für die FA charakteristische genetische Instabilität spiegelt sich in der hohen Anzahl (64%) von FA-Patienten wider, die auch ohne vorhergehende HSZT ein Plattenepithel-Karzinom (SCC) entwickelten. Nach HSZT manifestierte sich bei 25% der erwachsenen FA-Patienten ein SCC. Die Beachtung der medizinischen Besonderheiten des Erwachsenenalters ist von großer Bedeutung in der Prävention und Therapie von Komplikationen der FA und erfordert modifizierte Behandlungsstrategien für erwachsene FA-Patienten. Sorgfältig dokumentierte Langzeitbeobachtungen sowie die Identifizierung von Komplementationsgruppen und Mutationen bei jedem einzelnen FA-Patienten bilden die Grundlage für prognostische Aussagen, die derzeit nur beschränkt möglich sind. In zukünftigen Untersuchungen werden eine Reihe bisher ungelöster Fragen zu beantworten sein. Hierzu gehören die mögliche Rolle der Androgentherapie hinsichtlich der Förderung einer Mosaikbildung, die Faktoren, welche zu der auffälligen Geschlechterverteilung im Erwachsenenalter beitragen, sowie die Erforschung der Bedeutung „milder“ Mutationen und somatischer Reversionen. Die insgesamt sehr beeindruckenden Langzeitverläufe sowie die hohe Inzidenz von nicht-hämatologischen Komplikationen/Malignomen zeigen deutlich, dass sich die Fanconi Anämie zunehmend auch zu einer internistisch/onkologischen Krankheit entwickelt. / Fanconi anemia (FA) is a rare autosomal and X-chromosomal recessive disorder belonging to the group of chromosomal instability syndromes. FA is clinically characterised by congenital malformations, progressive bone marrow failure and a high risk for developing malignant neoplasia. FA-patients frequently present as aplastic anemia with a cumulative incidence of 90% at 40 years of age (Huck et al., 2006). From early adulthood on the mean clinical problem for FA-patients is the high incidence of solid tumors, predominantly squamous cell carcinomas of the oropharyngeal and genital tracts. At the cellular level FA is characterized by high spontaneous chromosomal breakage combined with strongly increased sensitivity to genotoxic agents such as DEB or MMC. Due to recent improvements of hematopoietic stem cell transplantation more and more FA-patients survive to adulthood. There is an increasing number of reports of adult FA patients being diagnosed in adulthood because of early onset of malignancies and/or unusually severe reactions towards radio- or chemotherapy. Surival to adulthood may result from successful HSCT, but also be due to the existence of a hypomorphic mutation or the development of a somatic reversion of a germline mutation. These life-extending events imply that FA changes more and more from a purely pediatric to an adulthood disease. Here we report 131 FA-patients older than 20 years and attempt to elucidate the probable reasons for their relative longevity. Among other parameters we document these patients with regard to gender, complementation group and presumable underlying causes of survival. 42 patients were reported in the literature from 1964 to 2008. Information of 36 patients derives from the American Fanconi Anemia Research Fund (“FARF”), and 53 patients were found in the local diagnostic database. We show that there are twice as many women as men reaching the adulthood. 66 patients could be assigned to complementation groups FA-A, FA-C, FA-D2, FA-G, FA-I and FA-J. In contrast, patients belonging to complementation groups FA-B, FA-D1, FA-E, FA-F, FA-L, FA-M and FA-N were not represented among our adult patient cohorts. The adult FA-patients were operationally divided in four different groups according to the presumptive cause of survival to adulthood: 26% received a successful HSCT, 17% developed a somatic mosaicism, 4% were likely to carry a hypomorphic mutation. The precise cause of the prolonged survival remains unknown in 53% of the FA-patients. This largest group lacks essential information about clinical course, previous therapeutic interventions, complementation group and mutations. A surprising finding is that there are more cases of somatic reversions among the very few patients older than 50 years. Due to lack of molecular analysis, the number of patients surviving due to hypomorphic mutations is likely to be underestimated. The characteristic genetic instability which affects all body cells is reflected in the high number of adult patients (64%) who developed a squamous cell carcinoma even in the absence of previous HSCT. 5 to 15 years after transplantation, 25% of the patients represented a SCC which again is a higher figure than among transplanted non-FA patients. Adult FA patients frequently present with clinical features that are different from childhood patients. These features include absent or only mild patterns of congenital malformations, normal or only mildly reduced blood counts, early onset SCC of the oropharyngeal and the anogenital region, and/or severe reaction to radiation or chemotherapy of such malignancies. In order to arrive at clinically useful prognostic data, long term monitoring of clinical course but also identification of complementation group and mutations are required in each FA-patient. Future studies should be aimed at elucidating the possible role of the steroid treatments for developing somatic reversion. Even though the primary non-hematological complications of adult FA-patients are early onset squamous cell carcinomas, there are a number of additional organ malfunctions (e.g. diabetes mellitus, hypothyroidism, gonadal failure, osteoporosis) which require attention by physicians trained in endocrinology, internal medicine and oncology. Clearly, FA evolves from a primary childhood to an adult disease.

Fanconi anemia (FA) is a genetically and phenotypically heterogenous autoso- mal recessive disease associated with chromosomal instability, progressive bone marrow failure, typical birth defects and predisposition to neoplasia. The clinical phenotype is similar in all known complementation groups (FA-A, FA-B, FA-C,FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G). The cellular phenotype is characterized by hypersensitivity to DNA crosslinking agents (MMC,DEB), which is exploited as a diagnostic tool. Alltogether, the FA proteins constitute a multiprotein pathway whose precise biochemical function(s) remain unknown. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF and FANCG interact in a nuclear complex upstream of FANCD2. Complementation group FA-D1 was recently shown to be due to biallelic mutations in the human breast cancer gene 2 (BRCA2). After DNA damage, the nuclear complex regulates monoubiquitylation of FANCD2, result- ing in targeting of this protein into nuclear foci together with BRCA1 and other DNA damage response proteins. The close connection resp. identity of the FA genes and known players of the DSB repair pathways (BRCA1, BRCA2, Rad51) firmly establishs an important role of the FA gene family in the maintenance of genome integrity. The chapter 1 provides a general introduction to the thesis describing the current knowledge and unsolved problems of Fanconi anemia. The following chapters represent papers submitted or published in scientific literature. They are succeeded by a short general discussion (chapter 7). Mutation analysis in the Fanconi anemia genes revealed gene specific mutation spectra as well as different distributions throughout the genes. These results are described in chapter 1 and chapter 2 with main attention to the first genes identified, namely FANCC, FANCA and FANCG. In chapter 2 we provide general background on mutation analysis and we report all mutations published for FANCA, FANCC and FANCG as well as our own unpublished mutations until the year 2000. In chapter 3 we report a shift of the mutation spectrum previously reported for FANCC after examining ten FA-patients belonging to complementation group C. Seven of those patients carried at least one previously unknown mutation, whereas the other three patients carried five alleles with the Dutch founder mu- tation 65delG and one allele with the Ashkenazi founder mutation IVS4+4A>T, albeit without any known Ashkenazi ancestry. We also describe the first large deletion in FANCC. The newly detected alterations include two missense mu- tations (L423P and T529P) in the 3´-area of the FANCC gene. Since the only previously described missense mutation L554P is also located in this area, a case can be made for the existence of functional domain(s) in that region of the gene. In chapter 4 we report the spectrum of mutations found in the FANCG gene com- piled by several laboratories working on FA. As with other FA genes, most muta- tions have been found only once, however, the truncating mutation, E105X, was identified as a German founder mutation after haplotype analysis. Direct compar- ison of the murine and the human protein sequences revealed two leucine zipper motifs. In one of these the only identified missense mutation was located at a conserved residue, suggesting the leucine zipper providing an essential protein-protein interaction required for FANCG function. With regard to genotype-phenotype correlations, two patients carrying a homozygous E105X mutation were seen to have an early onset of the hematological disorder, whereas the missense mutation seems to lead to a disease with later onset and milder clinical course. In chapter 5 we explore the phenomenon of revertant mosaicism which emerges quite frequently in peripheral blood cells of patients suffering from FA. We de- scribe the types of reversion found in five mosaic FA-patients belonging to com- plementation groups FA-A and FA-C. For our single FA-C-patient intragenic crossover could be proven as the mechanism of self-correction. In the remaining four patients (all of them being compound heterozygous in FANCA), either the paternal or maternal allele has reverted back to WT sequence. We also describe a first example of in vitro phenotypic reversion via the emergence of a compensat- ing missense mutation 15 amino acids downstream of the constitutional mutation explaining the MMC-resistance of the lymphoblastoid cell line of this patient. In chapter 6 we report two FA-A mosaic patients where it could be shown that the spontaneous reversion had taken place in a single hematopoietic stem cell. This has been done by separating blood cells from both patients and searching for the reverted mutation in their granulocytes, monocytes, T- and B-lymphocytes as well as in skin fibroblasts. In both patients, all hematopoietic lineages, but not the fibroblasts, carried the reversion, and comparison to their increase in erythrocyte and platelet counts over time demonstrated that reversion must have taken place in a single hematopoietic stem cell. This corrected stem cell then has been able to undergo self-renewal and also to create a corrected progeny, which over time repopulated all hematopoietic lineages. The pancytopenia of these patients has been cured due to the strong selective growth advantage of the corrected cells in vivo and the increased apoptosis of the mutant hematopoietic cells. / Fanconi Anämie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch phänotypisch hetero- gene, autosomal rezessive Erkrankung dar. Charakteristische Merkmale dieser Erkrankung sind die chromosomale Instabilität, ein fortschreitendes Knochen- marksversagen, multiple kongenitale Abnormalitäten und eine Prädisposition zu diversen Neoplasien. Dieser klinische Phänotyp ist bei allen bisher bekannten Komplementationsgruppen (FA-A, FA-B, FA-C, FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G) ähnlich, ebenso wie der zelluläre Phänotyp, der durch Hy- persensitivität zu DNA-quervernetzenden Substanzen, wie MMC und DEB, gekennzeichnet ist. Diese Hypersensitivität wird dementsprechend in der FA-Diagnostik verwandt. Alle FA-Proteine arbeiten in einem "Multiprotein- Pathway" zusammen, dessen exakte biochemische Funktion noch nicht geklärt ist. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF und FANCG interagieren in einem nukleären Komplex, der nach DNA-Schädigung die Monoubiquitylierung von FANCD2 reguliert, woraufhin man FANCD2 zusammen mit BRCA1 und anderen DNA-Reparaturproteinen in nukleären Foci detektieren kann. Die Komplemen- tationsgruppe FA-D1 wurde kürzlich biallelischen Mutationen im menschlichen Brustkrebsgen BRCA2 zugeordnet. Die enge Verbindung zwischen den FA- Genen und den Doppelstrangbruch(DSB)-Reparaturgenen (BRCA1, BRCA2, Rad51) deutet auf eine wichtige Rolle der FA-Genfamilie in der Erhaltung der genomischen Stabilität hin. Kapitel 1 gibt eine allgemeine Einleitung dieser Promotionsarbeit. Es liefert Hintergrundinformationen zu Fanconi Anämie basierend auf Publikationen bis einschließlich Mai 2002. In den darauffolgenden Kapiteln 2-6 sind eigene Veröf- fentlichungen zur Fanconi Anämie wiedergegeben, die entweder schon publiziert oder zur Veröffentlichung eingereicht worden sind. Zusätzlich zu den Diskussionsabschnitten in den einzelnen Veröffentlichungen werden diese fünf Arbeiten in Kapitel 7 kurz gemeinsam diskutiert. Die Mutationsanalyse in den diversen FA-Genen lieferte genspezifische Mutations- spektren sowie genspezifische Mutations-Verteilungen. Diese werden in Kapitel 1 und 2 beschrieben, wobei Kapitel 2 nur auf die zuerst entdeckten FA-Gene, FANCC, FANCA und FANCG, eingeht. In Kapitel 2 werden allgemeine Hinter- grundinformationen zur Mutationsanalyse geliefert und alle bis zum Jahr 2000 für FANCA, FANCC und FANCG publizierten Mutationen sowie unsere eigenen bis dato unveröffentlichten Veränderungen dargestellt. In Kapitel 3 berichten wir über eine bemerkenswerte Verschiebung des bisher beschriebenen FANCC-Mutationsspektrums. Von den zehn von uns untersuchten FA-C-Patienten trugen acht zumindest eine neue Mutation, wohingegen die drei restlichen Patienten fünf 65delG-Allele und ein IVS4+4A>T-Allel besaßen. Inter- essanterweise fanden wir auch erstmals große Deletionen im FANCC-Gen, deren Existenz bisher nur für FANCA beschrieben war. Weiterhin werden zwei bisher nicht bekannte Missense Mutationen (L423P und T529P) im 3´-Bereich des Gens beschrieben. In dieser Region findet sich auch der bisher einzige pathogene Aminosäureaustausch, L554P, was auf die Existenz einer funktionellen Domäne in dieser Genregion hindeutet. Außerdem scheinen unsere neu detektierten Muta- tionen vielmehr verstreut im Gen vorzuliegen als dies bisher angenommen worden war. Denn die bisher beschriebenen Veränderungen betreffen vor allem den Exon-bereich 5-6 sowie das amino- und carboxyterminale Ende von FANCC. Kapitel 4 beschreibt das Mutationsspektrum für FANCG, zusammengetragen von verschiedenen FA-Arbeitsgruppen. Wie in den anderen FA-Genen traten die meisten Mutationen auch hier nur einmal auf. Allerdings konnte die trunkierende Mutation, E105X, nach einer Haplotyp-Analyse als deutsche Gründermutation beschrieben werden. Ein direkter Vergleich der Proteinsequenzen von Men- sch und Maus ergab Hinweise auf konservierte Genabschnitte sowie auf zwei Leuzin-Zipper-Motive. Die einzige beschriebene Missense Mutation befindet sich in einem konservierten Bereich eines dieser beiden Leuzin-Zipper, was auf eine wichtige Rolle dieses Motivs für FANCG in Bezug auf Protein-Protein- Interaktionen schließen läßt. Obwohl die Anzahl der Patienten mit vergleichbaren Mutationen zu gering für statistisch signifikante Aussagen war, so fiel doch auf, dass bei den beiden Patienten mit einer homozygoten E105X-Mutation wesentlich früher hämatologische Probleme auftraten als bei dem Patienten mit der heterozygoten Missense Mutation, für den ein milder klinischer Verlauf sowie ein späteres Einsetzen hämatologischer Probleme berichtet wurde. Kapitel 5 und 6 behandeln das Phänomen des reversen Mosaizismus, der sehr häu- fig im Blut von FA-Patienten zu diagnostizieren ist. In Kapitel 5 beschreiben wir die Reversionsmechanismen von fünf Patienten, von denen einer der Komplemen- tationsgruppe C und die anderen vier der Komplementationsgruppe A angehören. Der Mechanismus, welcher der Selbstkorrektur des FA-C-Patienten zugrunde lag, konnte als intragene Rekombination definiert werden. Bei den verbleibenden vier compound heterozygoten FA-A-Patienten war jeweils eine Rückmutation zum Wildtyp auf dem mütterlichen bzw. väterlichen Allel ursächlich für die phäno- typische Gesundung der Blutzellen. Desweiteren beschreiben wir eine in vitro-Reversion in der lymphoblastoiden Linie eines unserer Patienten erstmals den Mechanismus einer sekundären Missense Mutation 15 Aminosäuren nach der kon- stitutionellen Mutation. Diese "kompensatorische" Mutation ist für die MMC- Resistenz der Zellinie verantwortlich. 4 von 5 der untersuchten Mosaik-Patienten zeigten eine eindeutige Verbesserung ihrer Blutwerte. Die Diagnose "Mosaizis-mus" verbessert offenbar die Prognose des Krankheitsbildes vor allem dann, wenn die Reversion eines Allels in einem frühen Stadium der Hämatopoiese auftritt. In Kapitel 6 berichten wir von zwei Mosaik-Patienten, bei denen untersucht wurde, wann in der Hämatopoiese die Reversion stattgefunden haben muss. Es konnte gezeigt werden, dass die Reversion in einer einzelnen hämatopoietischen Stammzelle erfolgte. Der Nachweis wurde durch die Isolierung einzelner Blutzell- typen, wie Granulozyten, Monozyten, T- und B-Zellen, aus dem peripheren Blut unserer Patienten sowie durch das Vorhandensein bzw. Nichtvorhanden- sein der Reversion in diesen Zellen geführt. Zum Vergleich wurden Hautfibrob- lasten herangezogen, da diese bei Mosaizismus im Blut nicht revertiert sind. In beiden Patienten trugen alle isolierten Blutzellen, nicht jedoch die Hautzellen, die Reversion. Dies und ein zusätzlicher Vergleich mit den zu diesem Zeit- punkt angestiegenen Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen zeigten, dass die Reversion in einer einzigen hämatopoietischen Stammzelle stattgefunden haben muss. Dieser revertierten Stammzelle sind alle jeweils phänotypisch korrigierten Blutzellen zuzuschreiben, die dann die gesamte Hämatopoiese übernahmen und aufgrund eines in vivo Wachstumsvorteils sowie der erhöhten Apoptoserate der mutierten Zellen die Panzytopenie beider Patienten im Sinne einer "natürlichen" oder "spontanen" Gentherapie zur Ausheilung brachten.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 287-289. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.A.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 69-75. Publié aussi en version électronique.