Made available in DSpace on 2014-06-12T23:14:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo913_1.pdf: 9938957 bytes, checksum: 09779bcc831b5b32e8759cd43141d969 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Os sais de amônio da N-(3,5-dinitrobenzoil)-α-fenilglicina (DNFG): N-(3,5- dinitrobenzoil)-α-fenilglicinato de amônio (DNBA), N-(3,5-dinitrobenzoil)-α-fenilglicinato de n-butilamônio (DNBB), N-(3,5-dinitrobenzoil)-α-fenilglicinato de n-propilamônio (DNBP), N-(3,5-dinitrobenzoil)-α-fenilglicinato de dietilamônio (DNBD) e N-(3,5-dinitrobenzoil)-α- fenilglicinato de trietilamônio (DNBT) e respectivos sais de metais alcalinos: DNB M+ (em que DNB = N-(3,5-dinitrobenzoil)-α-fenilglicinato e M = Li, Na, K e Rb) são incolores. Quando expostos em forma sólida à radiação ultravioleta (λ = 254 nm) mudam para cor vermelho-rosa. Este fenômeno também é observado em solução de dimetilsulfóxido, acetonitrila ou etanol. Contudo, os respectivos ácido (DNFG) e éster, N-(3,5- dinitrobenzoil)-α-fenilglicinato de metila (DNBM), não apresentaram qualquer mudança de cor após irradiação, demonstrando que é necessária a presença do sal para que ocorra o processo fotoquímico. Os espectros de RMN 1H ou RMN 13C não apresentaram nenhuma mudança espectral para as amostras irradiadas e não irradiadas. Foram realizados vários experimentos para elucidar o mecanismo de mudança de cor, os quais levaram à proposta de formação de um complexo de transferência de carga (CTC), o qual deve ocorrer entre os grupos 3,5-dinitrobenzoil (aceptor) e carboxilato (doador). Os sais de DNFG, após irradiação, apresentam três bandas de absorção localizadas em aproximadamente 405, 555 e 650 nm. Neste caso o CTC gerado apresentou algumas bandas de emissão em 440 (λexc = 377 nm), 620 e 700 nm (λexc = 420 nm), sendo que as duas últimas são provenientes do mesmo comprimento de onda de excitação. Essas bandas estão numa intensidade aproximada de 75:25. Portanto, a transferência de carga (TC) deve ocorrer pelo mecanismo de transferência de carga intramolecular por torção (TCIT) no qual o nitrogênio da amida sofre uma torção de 90o no estado excitado. Os sais fixados em matrizes de silicone apresentaram o mesmo comportamento dos sais no estado sólido

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2631.pdf: 1610800 bytes, checksum: 9f443d37247fb5fee135a70ec93a8142 (MD5) Previous issue date: 2008-09-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / Immobilization and stabilization of enzymes increases their potential for use in industrial scale. D-hydantoinases (dihidropirimidina amidrohidrolase EC 3.5.2.2) catalyze the hydrolysis of D-hydantoins, generating the corresponding Ncarbamoil- D-amino acid and are used in the production of D-amino acids, including Dphenylglycine and D-p-hydroxyphenylglycine.This work reports studies for immobilization and stabilization of D-hydantoinase from Vigna angularis (E.C. 3.5.2.2.). Different strategies of multipoint covalent attachment in organic supports as chitosan and agarose were used. Different protocols of immobilization were employed, being the adittion of ions during the reduction step with the NaBH4 important to protect enzyme catalytic site. The active and stabilized derivatives were used to catalyze the hydrolysis of D-phenylhydantoin. The temperature and pH enzyme profiles showed maximum enzyme activity at 60ºC and pH 10,0. The subunits of the enzyme present molecular mass aroundt 50kDa. The enzyme immobilized in glyoxyl-agarose in the presence of Zn2+ ions during the reduction step, with immobilization time of 24h, was the best derivative, being 89-fold more stable than the soluble enzyme. The analysis of amino acids showed that a 50% of lysines residue present in the enzymes was covalently linked in glyoxyl-agarose. The enzyme immobilized in epoxy-chitosan-alginate was 20-fold more stable than the soluble enzyme. All the tested immobilization protocols led to 100% of immobilization yield. Soluble enzyme and the best glyoxyl and chitosan enzyme derivatives were used to catalyze the hydrolysis of D- phenylhydantoin , and led to the production of 99% of NCarbamoil- D-Phenylglycine after 3, 9 and 15h of reaction respectively. / A imobilização e estabilização de enzimas aumentam muito o potencial de uso industrial desses catalisadores. D-hidantoinases (dihidropirimidina amidrohidrolase EC 3.5.2.2) são enzimas que catalisam a hidrólise de hidantoínas, com abertura do anel, para o correspondente N-carbamoil-D-aminoácido e são usadas na produção de Daminoácidos, incluindo D-fenilglicina e D-p-hidroxifenilglicina. Este trabalho relata os estudos desenvolvidos para a imobilização e estabilização de D-hidantoinase de Vigna angularis (3.5.2.2.). Foram abordadas diferentes estratégias de imobilização multipontual em suportes orgânicos como quitosana e agarose. Diferentes protocolos de imobilização foram empregados, sendo adição de íons durante a redução com NaBH4 importante para proteção do centro catalítico da enzima. Os derivados ativos e estabilizados foram empregados na reação de hidrólise da fenilhidantoína. O estudo de temperatura e pH de máxima atividade da enzima foi 60°C e pH 10,0. As subunidades da enzima apresentam peso molecular, com valor próximo a 50kDa. A enzima imobilizada em glioxil-agarose na presença dos íons Zn2+ durante a etapa de redução, com tempo de imobilização de 24 h foi o derivado mais estável sendo 89 vezes mais estável que a enzima solúvel. A análise de aminoácidos mostrou que aproximadamente 50% dos resíduos de lisina presentes na enzima foram covalentemente ligados no derivado de glioxil-agarose. A enzima imobilizada em quitosana-alginato-epoxilado foi 20 vezes mais estável que a enzima solúvel. Todos os procedimentos de imobilização testados levaram a 100% de rendimento de imobilização. Enzima solúvel e os melhores derivados obtidos por imobilização em glioxil e quitosana foram usados na catálise da hidrólise de fenilhidantoína, produzindo 99% de N-Carbamoil-D-fenilglicina nos tempos de 3, 9 e 15 h, respectivamente.