Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundo de Auxílio aos Docentes e Alunos (FADA) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (Pronex) / Objetivos: A nestina, uma proteína do filamento intermediário, pode ser usada como um indicador de imaturidade celular. Nas células já diferenciadas, essa proteína é substituída por outro tipo de filamento intermediário, específico do referido tecido. Porém, sua reexpressão pode ser induzida em condições regenerativas e/ou degenerativas. Assim, na tentativa de elucidar as alterações plásticas após um dano cerebral provocado pelo status epilepticus (SE) induzido pela pilocarpina em ratos, nossos objetivos foram: Ia) Estudar a expressão fisiológica normal da nestina no hipocampo e no córtex de ratos normais desde PN9 até a fase adulta (PN90); Ib) Avaliar as alterações da expressão da nestina no hipocampo e no córtex de ratos submetidos a três episódios de SE, induzidos pela pilocarpina, em PN7 PN8 e PN9. Esses animais foram estudados desde PN9 até PN90; 11) Estudar a expressão temporal e espacial da nestina no hipocampo de ratos adultos submetidos ao modelo da pilocarpina (fases aguda, silenciosa e crônica); 111) Avaliar a expressão da nestina no hipocampo de ratos idosos normais e em ratos idosos com epilepsia. Esses animais foram submetidos ao modelo da pilocarpina na fase adulta e seus cérebros foram estudados ao completarem dois anos de idade. Métodos: Indução do SE pela injeção de pilocarpina (ip); a expressão da nestina foi estudada por imuno-histoquímica. Resultados: No período pós-natal precoce, a expressão fisiológica da nestina foi intensamente visualizada nas glias radiais corticais, nas fibras hipocampais e nos vasos sanguíneos, desaparecendo nos animais adultos. Os animais submetidos ao SE em PN7-9, apresentaram aumento na expressão e atraso no desaparecimento da nestina, tanto nas glias radiais como nos vasos sanguíneos, em relação aos seus respectivos controles. Glias radiais corticais foram ainda encontradas nos ratos experimentais em PN21, enquanto que durante o desenvolvimento fisiológico normal elas já não estão mais presentes nessa idade. Quanto à distribuição temporal e espacial da nestina nos astrócitos reativos hipocampais de ratos adultos, submetidos ao modelo da pilocarpina, não encontramos a expressão dessa proteína nos animais dos grupos controle e agudo. Em contraste, os ratos...(au). / Purpose: Nestin is an intermediate filament component protein and can be used as an indicator of cellular immaturity. In the adult differentiated cell, nestin is replaced for other intermediate filament protein specific of the referred tissue. However, nestin re-expression can be induced by regenerative and/or degenerative conditions. In this way, in order to try to elucidate the plastic alterations followed by brain damage provoked by status epilepticus (SE) induced by pilocarpine in rats, the present work has the following purposes: Ia) Evaluate the physiological hippocampal and cortical nestin expression in rats from P9 to adulthood (P90); Ib) Evaluate hippocampal and cortical alterations of nestin expression in rats submitted to three episodes of SE induced by pilocarpine (P7,P8,P9). These animals were studied from P9 to P90; II) Evaluate the hippocampal temporal and spatial nestin expression of the adult rats submitted to the pilocarpine model of epilepsy (acute, silent and chronic phases); III) Evaluate the hippocampal nestin expression in aged normal rats and in aged rats with epilepsy. The aged chronic rats were submitted to the pilocarpine SE when young adults and they were studied with two years old. Methods: The SE was induced by pilocarpine injection (ip) and nestin expression was studied by immunohistochemistry. Results: Nestin expression was found in cortical radial glia, hippocampal fibers and blood vessels during early postnatal development, disappearing in the adulthood. Rats submitted to pilocarpine SE (P7-P9) showed a delayed nestin down-regulation in the cortical radial glia as well as in the blood vessels, when compared to their controls. We still found cortical radial glia in the experimental rats of P21 group, however they are not found anymore under normal physiological conditions at this age. Referring to the hippocampal reactive astrocytes expressing nestin in the adult rats submitted to the pilocarpine model, we did not detect nestin expression in the rats of the control and acute groups. In other hand, the animals of the silent group presented intense nestin expression 3 and 7 days after SE. Interestingly, still in the silent phase, we did not find any nestin expression 14 days after SE. However, in the 65 chronic phase of the model, the reactive astrocytes expressing nestin are again observed and they were sparsely distributed for all the hippocampal formation. The aged rats of the control group did not present nestin expression. However, aged chronic rats presenting long term epilepsy showed the same pattern of nestin immunoreactivity as observed in the chronic adult rats. Conclusions: This work showed that physiological nestin expression during early postnatal development to adulthood. Nestin immunoreactivity was intense in the cortical radial glia, hippocampal fibers and blood vessels during the early postnatal development disapearing in adulthood. Our data shoed that nestin expression was delayed in the rats submitted to SE (P7-9), suggesting a normal development impairment. We still found cortical radial glia in P21 in the experimental animals, suggesting a retardation of nestin down-regulation. The adult rats of the silent phase of the pilocarpine model presented transient nestin expression in the reactive astrocytes. However, reactive astrocytes expressing nestin were still found in the chronic phase of the model. These data suggest that nestin plays a role in the plastic events in the adult tissue after brain damage. The normal aging did not induce nestin re-expression. However, aged rats have the potential to re-express a developmental protein of immature cell, since the chronic aged rats in this study presented hippocampal reactive astrocytes. In this way, the knowledge of a temporal window of proteins such as nestin, with multi-potential and regenerative potential, allows advances in neurobiology understanding and contributes to the progress of cellular therapy in neurological diseases. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

No presente estudo nós investigamos o efeito in vivo da injeção intraestriatal de ácido quinolínico (AQ) sobre proteínas do citoesqueleto de astrócitos e neurônios de ratos jovens 30 minutos após a infusão. Injeção intraestriatal de AQ é um modelo excitotóxico da doença de Huntington (DH). Nossos resultados mostraram que o AQ (150μmol/0.5μL) aumentou significativamente a fosforilação in vitro da subunidade de baixo peso molecular dos neurofilamentos (NF-L) e da proteina glial fibrilar ácida (GFAP) de neurônios e astrócitos, respectivamente. Este efeito foi mediado pela proteína quinase AMPc-dependente (PKA), proteina quinase C (PKC) e proteina quinase Ca2+/calmodulina-dependente II (PKCaMII). Em contraste, proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK) não foram ativadas pela infusão com AQ. Além disso, o pré-tratamento com MK-801 (0.25 mg/kg i.p), antagonista específico dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA); com o antioxidante L-NAME (60 mg\kg\day) e com o difenildisseleneto (PheSe)2 (0.625 mg\kg\dia) preveniram totalmente a hiperfosforilação induzida pelo AQ. Nós também observamos que o sítio de fosforilação Ser55 localizado no domínio N-terminal da NF-L, descrito como um sítio regulatório da associação dos NF in vivo, foi alvo da hiperfosforilação induzida pelo AQ. Este efeito foi totalmente prevenido por MK801, pelo inibidor de PKA, H89 e pelo (PheSe)2, enquanto que staurosporina, um inibidor de PKC, preveniu apenas parcialmente a fosforilação da Ser55. O inibidor de PKCaMII (KN93) e o antioxidante L-NAME não preveniram a hiperfosforilação da Ser55 pelo AQ. Portanto, nós presumimos que a hiperfosforilação da NF-LSer55 pode representar os primeiros passos na cascata fisiopatológica dos eventos deletérios exercidos pelo AQ no estriado de ratos. Nossas observações também indicam que os eventos mediados pelo receptor NMDA e por estresse oxidativo podem estar relacionados com a hiperfosforilação das proteínas do citoesqueleto observadas, com importantes implicações para as funções cerebrais. / In the present study we investigated the effect of in vivo intrastriatal injection of quinolinic acid (QA) on rat cytoskeleton proteins in astrocytes and neurons of young rats at early stages (30 min) after infusion. Intrastriatal QA injection is an excitotoxic model of Huntington´s Disease (HD). Results showed that QA (150μmol/0.5μL) significantly increased the in vitro phosphorylation of the low molecular weight neurofilament subunit (NF-L) and the glial fibrillary acidic protein (GFAP) of neurons and astrocytes, respectively. This effect was mediated by cAMP-dependent protein kinase A (PKA), protein kinase C (PKC) and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (PKCaMII). In contrast, mitogen activated protein kinases (MAPK) were not activated by QA infusion. Furthermore, the specific N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonist MK-801 (0.25 mg/kg i.p), the antioxidant L-NAME (60 mg\kg\day), and diphenyldiselenide (PheSe)2 (0.625 mg\kg\day) injected prior to QA infusion totally prevented QA-induced hyperphosphorylation of cytoskeletal proteins. We also observed that QA-induced hyperphosphorylation was targeted at the Ser55 phosphorylating site on NF-L head domain, described as a regulatory site for NF assembly in vivo. This effect was fully prevented by MK801, by the PKA inhibitor H89 and by (PheSe)2, whereas staurosporine (PKC inhibitor) only partially prevented Ser55 phosphorylation. The PKCaMII inhibitor (KN93) and the antioxidant L-NAME failed to prevent the hyperphosphorylation of Ser55 by QA infusion. Therefore, we presume that QA-elicited NF-LSer55 hyperphosphorylation of the neural cytoskeleton achieved by intrastriatal QA injection could represent an early step in the pathophysiological cascade of deleterious events exerted by QA in rat striatum. Our observations also indicate that NMDA-mediated Ca2+ events and oxidative stress may be related to the altered protein cytoskeleton hyperphosphorylation observed with important implications for brain function.

Uma elevação da concentração de amônia no sangue é tóxica e pode levar a convulsões, coma e morte. A suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento a alterações neurológicas é maior do que no adulto. O citoesqueleto e, em particular, os filamentos intermediários (FIs) são um alvo de neurotoxinas e metabólitos tóxicos. No SNC temos os FIs neuronais, representados pelos neurofilamentos de alto, médio e baixo peso molecular (NF-H, NF-M, NF-L), e os astrocitários, proteína glial fibrilar ácida e vimentina (GFAP e VIM), entre outros. A fosforilação é uma modificação pós-traducional bem descrita como um dos principais mecanismos de regulação da dinâmica dos FIs. No presente trabalho, estudamos os efeitos de concentrações tóxicas de amônia sobre o citoesqueleto, com ênfase na homeostase do sistema fosforilante direcionado para os FIs e alguns mecanismos moleculares envolvidos nesses efeitos. Para tanto, utilizamos dois modelos experimentais de hiperamonemia aguda em animais de 10 e 21 dias de idade: in vivo e in vitro. No modelo in vivo, os animais foram injetados intraperitonealmente com acetato de amônio (7 mmol/Kg) e o nível de fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi analisado no córtex cerebral e no hipocampo. No modelo in vitro, fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos nas mesmas idades foram incubadas com diferentes concentrações de NH4Cl. Nos dois modelos experimentais utilizados as alterações no sistema fosforilante foram dependentes da idade e da estrutura cerebral. A injeção de acetato de amônio não alterou o nível de fosforilação dos FIs no córtex cerebral de ratos de 10 dias, 30 e 60 min após a injeção. No entanto, observamos hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) e neuronais (NF-L, NF-M e NF-H) 30 min após a injeção, sendo que esse efeito foi revertido 60 min após a injeção. O sistema fosforilante associado aos FIs das células neurais de hipocampo não foi alterado com relação aos controles nas duas idades e nos dois tempos estudados. No modelo in vitro a resposta ao NH4Cl foi estrutura-dependente e dose-dependente para as concentrações de 0,5, 1 e 5 mM. Fatias de hipocampo de ratos de 10 dias de idade apresentaram hipofosforilação de GFAP, VIM e NFL em resposta à incubação com 5 mM de NH4Cl, sem alteração na homeostase do citoesqueleto nas células neurais de córtex cerebral. Por outro lado, fatias de córtex cerebral de ratos de 21 dias de idade apresentaram hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) sem alteração no sistema fosforilante direcionado aos FIs de hipocampo. A hipofosforilação em resposta a sinais celulares está frequentemente associada à ativação de proteínas fosfatases. Portanto, em uma tentativa de estudar as vias de sinalização buscamos identificar as fosfatases envolvidas no efeito do NH4Cl, utilizando fatias de córtex cerebral. As proteínas fosfatases 1 (PP1) e 2B (PP2B) foram ativadas em resposta a 5 mM de NH4Cl aos 30 min e esse evento envolveu alterações nos níveis intra e extracelulares de Ca2+ via ativação do sistema glutamatérgico por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). O conjunto dos nossos dados evidenciam a neurotoxicidade da amônia por meio de um desequilíbrio no sistema fosforilante direcionado para os FIs tanto neuronais quanto astrocitários e de uma desregulação nos mecanismos de sinalização celular envolvidos na homeostase do citoesqueleto de astrócitos. Essas alterações podem ser parte integrante dos danos neurológicos associados à hiperamonemia aguda, principalmente no cérebro em desenvolvimento, como retardo mental e paralisia cerebral. Acreditamos que esses resultados são relevantes para a compreensão das bases moleculares envolvidas com a toxicidade da amônia no SNC. / High ammonia levels in the blood are toxic to brain and can lead to seizures, coma and death. The susceptibility of the developing brain to neurological abnormalities is greater than in adults. The cytoskeleton and, in particular, the intermediate filaments (IFs) are a target of neurotoxins and toxic metabolites. The intermediate dilaments (IFs) in the CNS are mainly represented by neurofilaments of high, medium and light molecular weight (NF-H, NF-M, NF-L) in neurons, glial fibrillary acidic protein and vimentin (GFAP and VIM), in astrocytes. Phosphorylation is a post-translational modification described as one of the major mechanisms regulating the dynamics of IFs. In the present work, we studied the effects of toxic concentrations of ammonia on the cytoskeleton, with emphasis in the homeostasis of the phosphorylating system directed to the IFs and we focused in some molecular mechanisms involved in these effects. For this, we use two experimental models of acute hyperammonemia in animals of 10 and 21 days of age: in vivo and in vitro models. In the in vivo model, animals were injected intraperitoneally with ammonium acetate (7 mmol/Kg) and the phosphorylation level of the cytoskeletal proteins was analyzed in the cerebral cortex and hippocampus.The injected acetate did not alter the phosphorylation level of IFs in the cerebral cortex of 10 day-old rats, 30 and 60 min after injection. However, we noted hypophosphorylation of the astrocytic (GFAP and VIM) as well as neuronal IFs (NF-L, NF-M and NF-H) 30 min after injection, and this effect was reversed 60 min after injection. The phosphorylating system associated with IFs of neural cells of the hippocampus was not altered as compared with controls at both ages and in the two studied times. In the in vitro model, the response to NH4Cl was structure-dependent and dose-dependent at the concentrations of 0.5, 1 and 5 mM. Hippocampal slices of 10-day-old rats showed hypophosphorylation of GFAP VIM and NFL in response to incubation with 5 mM NH4Cl, and unaltered homeostasis of the phosphorylating system directed to the cytoskeleton in the neural cells of the cerebral cortex. On the other hand, slices of cerebral cortex of 21-day-old rats showed hypophosphorylation of astrocytic IFs (GFAP and VIM) without altering the phosphorylating system directed to hippocampal IFs. The hypophosphorylation in response to cellular signals is often associated with activation of protein phosphatases. Therefore, in an attempt to study the signaling pathways we seek identify phosphatases involved in the effect of NH4Cl, using cerebral cortex slices. The protein phosphatases 1 (PP1) and 2B (PP2B) were activated in response to 5 mM NH4Cl 30 min after injection and this event was associated with in intra and extracellular Ca2+ levels via activation of glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Taken together, our data show that the neurotoxicity of ammonia is directed to the phosphorylating imbalance of both neuronal as astrocytic IFs through disruption of the homeostasis of the NMDA-mediated signaling mechanisms of cortical astrocytes of 21-day-old rats. These changes may be part of the neurological damage associated with acute hyperammonemia, in the developing brain, as mental retardation and cerebral palsy. We believe that these results are relevant for understanding the molecular basis involved in the toxicity of ammonia in the CNS.

Uma elevação da concentração de amônia no sangue é tóxica e pode levar a convulsões, coma e morte. A suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento a alterações neurológicas é maior do que no adulto. O citoesqueleto e, em particular, os filamentos intermediários (FIs) são um alvo de neurotoxinas e metabólitos tóxicos. No SNC temos os FIs neuronais, representados pelos neurofilamentos de alto, médio e baixo peso molecular (NF-H, NF-M, NF-L), e os astrocitários, proteína glial fibrilar ácida e vimentina (GFAP e VIM), entre outros. A fosforilação é uma modificação pós-traducional bem descrita como um dos principais mecanismos de regulação da dinâmica dos FIs. No presente trabalho, estudamos os efeitos de concentrações tóxicas de amônia sobre o citoesqueleto, com ênfase na homeostase do sistema fosforilante direcionado para os FIs e alguns mecanismos moleculares envolvidos nesses efeitos. Para tanto, utilizamos dois modelos experimentais de hiperamonemia aguda em animais de 10 e 21 dias de idade: in vivo e in vitro. No modelo in vivo, os animais foram injetados intraperitonealmente com acetato de amônio (7 mmol/Kg) e o nível de fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi analisado no córtex cerebral e no hipocampo. No modelo in vitro, fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos nas mesmas idades foram incubadas com diferentes concentrações de NH4Cl. Nos dois modelos experimentais utilizados as alterações no sistema fosforilante foram dependentes da idade e da estrutura cerebral. A injeção de acetato de amônio não alterou o nível de fosforilação dos FIs no córtex cerebral de ratos de 10 dias, 30 e 60 min após a injeção. No entanto, observamos hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) e neuronais (NF-L, NF-M e NF-H) 30 min após a injeção, sendo que esse efeito foi revertido 60 min após a injeção. O sistema fosforilante associado aos FIs das células neurais de hipocampo não foi alterado com relação aos controles nas duas idades e nos dois tempos estudados. No modelo in vitro a resposta ao NH4Cl foi estrutura-dependente e dose-dependente para as concentrações de 0,5, 1 e 5 mM. Fatias de hipocampo de ratos de 10 dias de idade apresentaram hipofosforilação de GFAP, VIM e NFL em resposta à incubação com 5 mM de NH4Cl, sem alteração na homeostase do citoesqueleto nas células neurais de córtex cerebral. Por outro lado, fatias de córtex cerebral de ratos de 21 dias de idade apresentaram hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) sem alteração no sistema fosforilante direcionado aos FIs de hipocampo. A hipofosforilação em resposta a sinais celulares está frequentemente associada à ativação de proteínas fosfatases. Portanto, em uma tentativa de estudar as vias de sinalização buscamos identificar as fosfatases envolvidas no efeito do NH4Cl, utilizando fatias de córtex cerebral. As proteínas fosfatases 1 (PP1) e 2B (PP2B) foram ativadas em resposta a 5 mM de NH4Cl aos 30 min e esse evento envolveu alterações nos níveis intra e extracelulares de Ca2+ via ativação do sistema glutamatérgico por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). O conjunto dos nossos dados evidenciam a neurotoxicidade da amônia por meio de um desequilíbrio no sistema fosforilante direcionado para os FIs tanto neuronais quanto astrocitários e de uma desregulação nos mecanismos de sinalização celular envolvidos na homeostase do citoesqueleto de astrócitos. Essas alterações podem ser parte integrante dos danos neurológicos associados à hiperamonemia aguda, principalmente no cérebro em desenvolvimento, como retardo mental e paralisia cerebral. Acreditamos que esses resultados são relevantes para a compreensão das bases moleculares envolvidas com a toxicidade da amônia no SNC. / High ammonia levels in the blood are toxic to brain and can lead to seizures, coma and death. The susceptibility of the developing brain to neurological abnormalities is greater than in adults. The cytoskeleton and, in particular, the intermediate filaments (IFs) are a target of neurotoxins and toxic metabolites. The intermediate dilaments (IFs) in the CNS are mainly represented by neurofilaments of high, medium and light molecular weight (NF-H, NF-M, NF-L) in neurons, glial fibrillary acidic protein and vimentin (GFAP and VIM), in astrocytes. Phosphorylation is a post-translational modification described as one of the major mechanisms regulating the dynamics of IFs. In the present work, we studied the effects of toxic concentrations of ammonia on the cytoskeleton, with emphasis in the homeostasis of the phosphorylating system directed to the IFs and we focused in some molecular mechanisms involved in these effects. For this, we use two experimental models of acute hyperammonemia in animals of 10 and 21 days of age: in vivo and in vitro models. In the in vivo model, animals were injected intraperitoneally with ammonium acetate (7 mmol/Kg) and the phosphorylation level of the cytoskeletal proteins was analyzed in the cerebral cortex and hippocampus.The injected acetate did not alter the phosphorylation level of IFs in the cerebral cortex of 10 day-old rats, 30 and 60 min after injection. However, we noted hypophosphorylation of the astrocytic (GFAP and VIM) as well as neuronal IFs (NF-L, NF-M and NF-H) 30 min after injection, and this effect was reversed 60 min after injection. The phosphorylating system associated with IFs of neural cells of the hippocampus was not altered as compared with controls at both ages and in the two studied times. In the in vitro model, the response to NH4Cl was structure-dependent and dose-dependent at the concentrations of 0.5, 1 and 5 mM. Hippocampal slices of 10-day-old rats showed hypophosphorylation of GFAP VIM and NFL in response to incubation with 5 mM NH4Cl, and unaltered homeostasis of the phosphorylating system directed to the cytoskeleton in the neural cells of the cerebral cortex. On the other hand, slices of cerebral cortex of 21-day-old rats showed hypophosphorylation of astrocytic IFs (GFAP and VIM) without altering the phosphorylating system directed to hippocampal IFs. The hypophosphorylation in response to cellular signals is often associated with activation of protein phosphatases. Therefore, in an attempt to study the signaling pathways we seek identify phosphatases involved in the effect of NH4Cl, using cerebral cortex slices. The protein phosphatases 1 (PP1) and 2B (PP2B) were activated in response to 5 mM NH4Cl 30 min after injection and this event was associated with in intra and extracellular Ca2+ levels via activation of glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Taken together, our data show that the neurotoxicity of ammonia is directed to the phosphorylating imbalance of both neuronal as astrocytic IFs through disruption of the homeostasis of the NMDA-mediated signaling mechanisms of cortical astrocytes of 21-day-old rats. These changes may be part of the neurological damage associated with acute hyperammonemia, in the developing brain, as mental retardation and cerebral palsy. We believe that these results are relevant for understanding the molecular basis involved in the toxicity of ammonia in the CNS.

No presente estudo nós investigamos o efeito in vivo da injeção intraestriatal de ácido quinolínico (AQ) sobre proteínas do citoesqueleto de astrócitos e neurônios de ratos jovens 30 minutos após a infusão. Injeção intraestriatal de AQ é um modelo excitotóxico da doença de Huntington (DH). Nossos resultados mostraram que o AQ (150μmol/0.5μL) aumentou significativamente a fosforilação in vitro da subunidade de baixo peso molecular dos neurofilamentos (NF-L) e da proteina glial fibrilar ácida (GFAP) de neurônios e astrócitos, respectivamente. Este efeito foi mediado pela proteína quinase AMPc-dependente (PKA), proteina quinase C (PKC) e proteina quinase Ca2+/calmodulina-dependente II (PKCaMII). Em contraste, proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK) não foram ativadas pela infusão com AQ. Além disso, o pré-tratamento com MK-801 (0.25 mg/kg i.p), antagonista específico dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA); com o antioxidante L-NAME (60 mg\kg\day) e com o difenildisseleneto (PheSe)2 (0.625 mg\kg\dia) preveniram totalmente a hiperfosforilação induzida pelo AQ. Nós também observamos que o sítio de fosforilação Ser55 localizado no domínio N-terminal da NF-L, descrito como um sítio regulatório da associação dos NF in vivo, foi alvo da hiperfosforilação induzida pelo AQ. Este efeito foi totalmente prevenido por MK801, pelo inibidor de PKA, H89 e pelo (PheSe)2, enquanto que staurosporina, um inibidor de PKC, preveniu apenas parcialmente a fosforilação da Ser55. O inibidor de PKCaMII (KN93) e o antioxidante L-NAME não preveniram a hiperfosforilação da Ser55 pelo AQ. Portanto, nós presumimos que a hiperfosforilação da NF-LSer55 pode representar os primeiros passos na cascata fisiopatológica dos eventos deletérios exercidos pelo AQ no estriado de ratos. Nossas observações também indicam que os eventos mediados pelo receptor NMDA e por estresse oxidativo podem estar relacionados com a hiperfosforilação das proteínas do citoesqueleto observadas, com importantes implicações para as funções cerebrais. / In the present study we investigated the effect of in vivo intrastriatal injection of quinolinic acid (QA) on rat cytoskeleton proteins in astrocytes and neurons of young rats at early stages (30 min) after infusion. Intrastriatal QA injection is an excitotoxic model of Huntington´s Disease (HD). Results showed that QA (150μmol/0.5μL) significantly increased the in vitro phosphorylation of the low molecular weight neurofilament subunit (NF-L) and the glial fibrillary acidic protein (GFAP) of neurons and astrocytes, respectively. This effect was mediated by cAMP-dependent protein kinase A (PKA), protein kinase C (PKC) and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (PKCaMII). In contrast, mitogen activated protein kinases (MAPK) were not activated by QA infusion. Furthermore, the specific N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonist MK-801 (0.25 mg/kg i.p), the antioxidant L-NAME (60 mg\kg\day), and diphenyldiselenide (PheSe)2 (0.625 mg\kg\day) injected prior to QA infusion totally prevented QA-induced hyperphosphorylation of cytoskeletal proteins. We also observed that QA-induced hyperphosphorylation was targeted at the Ser55 phosphorylating site on NF-L head domain, described as a regulatory site for NF assembly in vivo. This effect was fully prevented by MK801, by the PKA inhibitor H89 and by (PheSe)2, whereas staurosporine (PKC inhibitor) only partially prevented Ser55 phosphorylation. The PKCaMII inhibitor (KN93) and the antioxidant L-NAME failed to prevent the hyperphosphorylation of Ser55 by QA infusion. Therefore, we presume that QA-elicited NF-LSer55 hyperphosphorylation of the neural cytoskeleton achieved by intrastriatal QA injection could represent an early step in the pathophysiological cascade of deleterious events exerted by QA in rat striatum. Our observations also indicate that NMDA-mediated Ca2+ events and oxidative stress may be related to the altered protein cytoskeleton hyperphosphorylation observed with important implications for brain function.

No presente estudo nós investigamos o efeito in vivo da injeção intraestriatal de ácido quinolínico (AQ) sobre proteínas do citoesqueleto de astrócitos e neurônios de ratos jovens 30 minutos após a infusão. Injeção intraestriatal de AQ é um modelo excitotóxico da doença de Huntington (DH). Nossos resultados mostraram que o AQ (150μmol/0.5μL) aumentou significativamente a fosforilação in vitro da subunidade de baixo peso molecular dos neurofilamentos (NF-L) e da proteina glial fibrilar ácida (GFAP) de neurônios e astrócitos, respectivamente. Este efeito foi mediado pela proteína quinase AMPc-dependente (PKA), proteina quinase C (PKC) e proteina quinase Ca2+/calmodulina-dependente II (PKCaMII). Em contraste, proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK) não foram ativadas pela infusão com AQ. Além disso, o pré-tratamento com MK-801 (0.25 mg/kg i.p), antagonista específico dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA); com o antioxidante L-NAME (60 mg\kg\day) e com o difenildisseleneto (PheSe)2 (0.625 mg\kg\dia) preveniram totalmente a hiperfosforilação induzida pelo AQ. Nós também observamos que o sítio de fosforilação Ser55 localizado no domínio N-terminal da NF-L, descrito como um sítio regulatório da associação dos NF in vivo, foi alvo da hiperfosforilação induzida pelo AQ. Este efeito foi totalmente prevenido por MK801, pelo inibidor de PKA, H89 e pelo (PheSe)2, enquanto que staurosporina, um inibidor de PKC, preveniu apenas parcialmente a fosforilação da Ser55. O inibidor de PKCaMII (KN93) e o antioxidante L-NAME não preveniram a hiperfosforilação da Ser55 pelo AQ. Portanto, nós presumimos que a hiperfosforilação da NF-LSer55 pode representar os primeiros passos na cascata fisiopatológica dos eventos deletérios exercidos pelo AQ no estriado de ratos. Nossas observações também indicam que os eventos mediados pelo receptor NMDA e por estresse oxidativo podem estar relacionados com a hiperfosforilação das proteínas do citoesqueleto observadas, com importantes implicações para as funções cerebrais. / In the present study we investigated the effect of in vivo intrastriatal injection of quinolinic acid (QA) on rat cytoskeleton proteins in astrocytes and neurons of young rats at early stages (30 min) after infusion. Intrastriatal QA injection is an excitotoxic model of Huntington´s Disease (HD). Results showed that QA (150μmol/0.5μL) significantly increased the in vitro phosphorylation of the low molecular weight neurofilament subunit (NF-L) and the glial fibrillary acidic protein (GFAP) of neurons and astrocytes, respectively. This effect was mediated by cAMP-dependent protein kinase A (PKA), protein kinase C (PKC) and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (PKCaMII). In contrast, mitogen activated protein kinases (MAPK) were not activated by QA infusion. Furthermore, the specific N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonist MK-801 (0.25 mg/kg i.p), the antioxidant L-NAME (60 mg\kg\day), and diphenyldiselenide (PheSe)2 (0.625 mg\kg\day) injected prior to QA infusion totally prevented QA-induced hyperphosphorylation of cytoskeletal proteins. We also observed that QA-induced hyperphosphorylation was targeted at the Ser55 phosphorylating site on NF-L head domain, described as a regulatory site for NF assembly in vivo. This effect was fully prevented by MK801, by the PKA inhibitor H89 and by (PheSe)2, whereas staurosporine (PKC inhibitor) only partially prevented Ser55 phosphorylation. The PKCaMII inhibitor (KN93) and the antioxidant L-NAME failed to prevent the hyperphosphorylation of Ser55 by QA infusion. Therefore, we presume that QA-elicited NF-LSer55 hyperphosphorylation of the neural cytoskeleton achieved by intrastriatal QA injection could represent an early step in the pathophysiological cascade of deleterious events exerted by QA in rat striatum. Our observations also indicate that NMDA-mediated Ca2+ events and oxidative stress may be related to the altered protein cytoskeleton hyperphosphorylation observed with important implications for brain function.

Uma elevação da concentração de amônia no sangue é tóxica e pode levar a convulsões, coma e morte. A suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento a alterações neurológicas é maior do que no adulto. O citoesqueleto e, em particular, os filamentos intermediários (FIs) são um alvo de neurotoxinas e metabólitos tóxicos. No SNC temos os FIs neuronais, representados pelos neurofilamentos de alto, médio e baixo peso molecular (NF-H, NF-M, NF-L), e os astrocitários, proteína glial fibrilar ácida e vimentina (GFAP e VIM), entre outros. A fosforilação é uma modificação pós-traducional bem descrita como um dos principais mecanismos de regulação da dinâmica dos FIs. No presente trabalho, estudamos os efeitos de concentrações tóxicas de amônia sobre o citoesqueleto, com ênfase na homeostase do sistema fosforilante direcionado para os FIs e alguns mecanismos moleculares envolvidos nesses efeitos. Para tanto, utilizamos dois modelos experimentais de hiperamonemia aguda em animais de 10 e 21 dias de idade: in vivo e in vitro. No modelo in vivo, os animais foram injetados intraperitonealmente com acetato de amônio (7 mmol/Kg) e o nível de fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi analisado no córtex cerebral e no hipocampo. No modelo in vitro, fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos nas mesmas idades foram incubadas com diferentes concentrações de NH4Cl. Nos dois modelos experimentais utilizados as alterações no sistema fosforilante foram dependentes da idade e da estrutura cerebral. A injeção de acetato de amônio não alterou o nível de fosforilação dos FIs no córtex cerebral de ratos de 10 dias, 30 e 60 min após a injeção. No entanto, observamos hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) e neuronais (NF-L, NF-M e NF-H) 30 min após a injeção, sendo que esse efeito foi revertido 60 min após a injeção. O sistema fosforilante associado aos FIs das células neurais de hipocampo não foi alterado com relação aos controles nas duas idades e nos dois tempos estudados. No modelo in vitro a resposta ao NH4Cl foi estrutura-dependente e dose-dependente para as concentrações de 0,5, 1 e 5 mM. Fatias de hipocampo de ratos de 10 dias de idade apresentaram hipofosforilação de GFAP, VIM e NFL em resposta à incubação com 5 mM de NH4Cl, sem alteração na homeostase do citoesqueleto nas células neurais de córtex cerebral. Por outro lado, fatias de córtex cerebral de ratos de 21 dias de idade apresentaram hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) sem alteração no sistema fosforilante direcionado aos FIs de hipocampo. A hipofosforilação em resposta a sinais celulares está frequentemente associada à ativação de proteínas fosfatases. Portanto, em uma tentativa de estudar as vias de sinalização buscamos identificar as fosfatases envolvidas no efeito do NH4Cl, utilizando fatias de córtex cerebral. As proteínas fosfatases 1 (PP1) e 2B (PP2B) foram ativadas em resposta a 5 mM de NH4Cl aos 30 min e esse evento envolveu alterações nos níveis intra e extracelulares de Ca2+ via ativação do sistema glutamatérgico por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). O conjunto dos nossos dados evidenciam a neurotoxicidade da amônia por meio de um desequilíbrio no sistema fosforilante direcionado para os FIs tanto neuronais quanto astrocitários e de uma desregulação nos mecanismos de sinalização celular envolvidos na homeostase do citoesqueleto de astrócitos. Essas alterações podem ser parte integrante dos danos neurológicos associados à hiperamonemia aguda, principalmente no cérebro em desenvolvimento, como retardo mental e paralisia cerebral. Acreditamos que esses resultados são relevantes para a compreensão das bases moleculares envolvidas com a toxicidade da amônia no SNC. / High ammonia levels in the blood are toxic to brain and can lead to seizures, coma and death. The susceptibility of the developing brain to neurological abnormalities is greater than in adults. The cytoskeleton and, in particular, the intermediate filaments (IFs) are a target of neurotoxins and toxic metabolites. The intermediate dilaments (IFs) in the CNS are mainly represented by neurofilaments of high, medium and light molecular weight (NF-H, NF-M, NF-L) in neurons, glial fibrillary acidic protein and vimentin (GFAP and VIM), in astrocytes. Phosphorylation is a post-translational modification described as one of the major mechanisms regulating the dynamics of IFs. In the present work, we studied the effects of toxic concentrations of ammonia on the cytoskeleton, with emphasis in the homeostasis of the phosphorylating system directed to the IFs and we focused in some molecular mechanisms involved in these effects. For this, we use two experimental models of acute hyperammonemia in animals of 10 and 21 days of age: in vivo and in vitro models. In the in vivo model, animals were injected intraperitoneally with ammonium acetate (7 mmol/Kg) and the phosphorylation level of the cytoskeletal proteins was analyzed in the cerebral cortex and hippocampus.The injected acetate did not alter the phosphorylation level of IFs in the cerebral cortex of 10 day-old rats, 30 and 60 min after injection. However, we noted hypophosphorylation of the astrocytic (GFAP and VIM) as well as neuronal IFs (NF-L, NF-M and NF-H) 30 min after injection, and this effect was reversed 60 min after injection. The phosphorylating system associated with IFs of neural cells of the hippocampus was not altered as compared with controls at both ages and in the two studied times. In the in vitro model, the response to NH4Cl was structure-dependent and dose-dependent at the concentrations of 0.5, 1 and 5 mM. Hippocampal slices of 10-day-old rats showed hypophosphorylation of GFAP VIM and NFL in response to incubation with 5 mM NH4Cl, and unaltered homeostasis of the phosphorylating system directed to the cytoskeleton in the neural cells of the cerebral cortex. On the other hand, slices of cerebral cortex of 21-day-old rats showed hypophosphorylation of astrocytic IFs (GFAP and VIM) without altering the phosphorylating system directed to hippocampal IFs. The hypophosphorylation in response to cellular signals is often associated with activation of protein phosphatases. Therefore, in an attempt to study the signaling pathways we seek identify phosphatases involved in the effect of NH4Cl, using cerebral cortex slices. The protein phosphatases 1 (PP1) and 2B (PP2B) were activated in response to 5 mM NH4Cl 30 min after injection and this event was associated with in intra and extracellular Ca2+ levels via activation of glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Taken together, our data show that the neurotoxicity of ammonia is directed to the phosphorylating imbalance of both neuronal as astrocytic IFs through disruption of the homeostasis of the NMDA-mediated signaling mechanisms of cortical astrocytes of 21-day-old rats. These changes may be part of the neurological damage associated with acute hyperammonemia, in the developing brain, as mental retardation and cerebral palsy. We believe that these results are relevant for understanding the molecular basis involved in the toxicity of ammonia in the CNS.