El cáncer gástrico es el resultado final de un largo proceso multifactorial que se desarrolla en distintas etapas y en el que intervienen un elevado número de factores ambientales y genéticos. Los genes TFFs y MUCs codifican para las principales proteínas de formación y mantenimiento de la mucosa gástrica, mucinas y péptidos trefoil, que ejercen un papel importante en la protección del epitelio contra patógenos y otras agresiones externas, así como intervienen en la regulación de diversos procesos celulares durante la homeostasis gástrica normal. Sin embargo, su implicación en la carcinogénesis gástrica todavía es poco conocida aunque cada vez hay más evidencias de su importancia. Este trabajo profundiza en el conocimiento de los factores de susceptibilidad genética al cáncer gástrico y su objetivo principal es el análisis de la variabilidad polimórfica de los genes MUC y TFF de la mucosa gástrica y de su asociación con el cáncer gástrico y la evolución de las lesiones precursoras. Para analizar la variabilidad de estos genes se realizó una búsqueda y selección de polimorfismos en regiones funcionales de TFF1, TFF2 y TFF3 que nos permitió identificar y validar 13 variantes potencialmente funcionales (7 de ellas nuevas), que se seleccionaron para el análisis de asociación. Además, se utilizó la información de HapMap para realizar un análisis de desequilibrio de ligamiento e identificación de haplotipos en las regiones de los tres genes TFF y de los genes MUC1, MUC2 y MUC6, que nos permitió seleccionar marcadores (tagSNPs) de su variabilidad genética. Los estudios de asociación se realizaron en una población de 453 pacientes con lesiones gástricas precursoras de cáncer, en los que se evaluó la evolución de las lesiones al final de un seguimiento medio de 13 años; también se analizó una población caso-control de cáncer gástrico (365 casos y 1284 controles), anidada en la cohorte europea EPIC. En relación a la evolución de las lesiones gástricas, tres polimorfismos de la región 3’ de MUC2 se asociaron como factores protectores de la progresión, mientras que otros cuatro polimorfismos de la región 5’ se asociaron con la regresión. El análisis de haplotipos confirmó la asociación con la variabilidad genética de MUC2, cuyo efecto solo fue significativo en los pacientes infectados por H.pylori, indicando una interacción genética con la bacteria. Además, polimorfismos de MUC2 también se asociaron con cáncer gástrico, especialmente del tipo intestinal y del no cardia, sugiriendo una implicación de la mucina secretada en la carcinogénesis gástrica. Un SNP de MUC1, rs4072037, también se asoció al cáncer gástrico y, específicamente y en mayor medida, al tipo intestinal, y probablemente el del cardias, replicando las asociaciones encontradas en estudios previos. Tres variantes en la región genómica a 5’ de TFF1 se asociaron con la regresión de las lesiones y un SNP intrónico se asoció con un mayor riesgo de progresión. Además, ocho variantes en este gen y regiones reguladoras adyacentes modificaron el riesgo del cáncer gástrico del tipo intestinal. El análisis de haplotipos confirmó la asociación, evidenciando la gran variabilidad de TFF1 y sus distintos efectos en la carcinogénesis en función de las variantes que se combinen en el haplotipo. Aunque la asociación con los genes TFF2, TFF3 y MUC6 no fue tan evidente, algunos resultados indican que estos genes también podrían desempeñar un papel importante en el desarrollo de cáncer gástrico. Finalmente, polimorfismos en los genes CD14, CDH1, TLR4, TNF y PTNP11 se asociaron con la evolución de las lesiones gástricas, sugiriendo un efecto sobre las fases iniciales de la carcinogénesis gástrica, de la variabilidad en genes relacionados con la vía de señalización y respuesta inmunoinflamatoria a la infección por H.pylori. / Gastric cancer is the result of a long multistep and multifactorial process that involves well-characterized sequential stages and where a large number of environmental and genetic factors play a role. Different TFF and MUC genes encode for the main proteins involved in the formation, maintenance and repair of the protective mucous layer of the gastrointestinal tract, where they have a central defensive role against pathogens and other external challenges, as well as having a central regulatory role in cellular processes needed to maintain epithelial homeostasis. However, their role in gastric carcinogenesis is still poorly known despite recent evidences on their importance. This study has been designed with the purpose of analyzing the genetic variability of the MUC and TFF genes of the gastric mucous layer and its association with gastric cancer and with the evolution of its precursor lesions. Through database searches and gene scanning of the functional regions of TFF1, TFF2 and TFF3 we could identify and validate a total of 13 potentially functional variants, seven of which hadn’t been previously reported, that we selected for association analyses. Furthermore, through linkage disequilibrium and haplotype analyses of HapMap information for each of the three TFF and the MUC1, MUC2 and MUC6 genomic regions, we selected tagSNPs of the most common genetic variation of these regions. For the association analyses we used a population of 453 patients with gastric cancer precursor lesions whose evolution was followed for a mean period of 13 years; A case-control population (365 gastric cancer cases y 1284 controls), nested in the European EPIC cohort, was also analyzed. Three polymorphisms of the 3’ region of MUC2 were significantly and inversely associated with the progression of the lesions, appearing as protective against it, while another four polymorphisms of the 5’ region of the gene were associated with regression. Haplotype analyses confirmed this association with genetic variability of MUC2, which was significant only in H.pylori infected patients, thus suggesting a genetic interaction with the bacterium. MUC2 polymorphisms were also found associated with gastric cancer, particularly of the intestinal-type and non cardia localization, thus suggesting a role of this secreted mucin in gastric carcinogenesis. A MUC1 SNP, rs4072037, was also found associated with gastric cancer, with a stronger association with the intestinal-type and, probably, the cardia localization, which was in agreement with previous reports. Three variants at the 5’ region upstream of TFF1 were associated with the regression of the gastric lesions and an intronic SNP was associated with an increased progression risk. Furthermore, eight variants in this gene and its adjacent regulatory were associated with gastric cancer of the intestinal type. This association was confirmed by haplotype analyses, which put into evidence the large variability of TFF1 and the different effects on gastric carcinogenesis according to the different haplotypes. Although association with TFF2, TFF3 and MUC6 was not so clear, some results suggest that these genes could also have an important role in gastric carcinogenesis. Finally, polymorphisms in the CD14, CDH1, TLR4, TNF and PTNP11 genes were associated with the evolution of gastric lesions, suggesting that genetic variability in genes involved in the H.pylori signaling pathway and immunoinflamatory response, may influence the initial stages of gastric carcinogenesis.

Ara que es comença a treure l’entrellat -o si més no a tenir una nova perspectiva- de la diversitat de microorganismes present als oceans gràcies a la biologia molecular i a la metagenòmica, el següent pas és esbrinar quines són les noves funcions que aquesta amaga i com són utilitzades i per qui a l’oceà. La regulació de l’expressió gènica és la base de la versatilitat i l’adaptabilitat de qualsevol organisme al medi on viu. De l’estudi dels gens expressats d’un organisme es poden deduir correctament moltes de les característiques del medi on la seva vida es desenvolupa habitualment. En cada situació els organismes expressen solament una part del seus gens, responent tant a factors interns (per exemple el cicle cel·lular) com a factors externs (temperatura, llum, aport de nutrients...). Les tecnologies de seqüenciació massiva també s’han aplicat en l’estudi de l’expressió de les comunitats microbianes marines (metatranscriptòmica). Tanmateix, aquestes tecnologies encara no estan prou optimitzades i sovint proporcionen seqüències que no poden ser assignades a cap gen conegut. En aquesta tesi ens hem plantejat l’estudi de l’expressió gènica dels microorganismes marins a tres escales diferents: a escala de comunitat, de genoma, i de gen. L’esforç més gran ha estat estudiar l’expressió gènica a escala de comunitat, on el nostre repte ha estat desenvolupar una tècnica equivalent als mètodes “d’empremta dactilar” (fingerprinting) del DNA que s’usen de forma rutinària –com la DGGE o l’ARISA- per tal d’explorar la dinàmica dels patrons d’expressió gènica de les comunitats de microbis marins, permetent la comparació d’un gran nombre de mostres a un preu assequible i sense la necessitat prèvia de saber les seqüències dels RNA missatgers. Aquesta tècnica, batejada com a TFA (de “Transcriptome Fingerprinting Analysis”), ens ha permès estudiar I) les variacions estacionals en els patrons d’expressió gènica dels picoeucariotes marins de l’Observatori Microbià de la Badia de Blanes durant 4 anys, i II) les variacions dels patrons d’expressió al llarg d’un gradient espacial horitzontal i vertical i d’un gradient temporal. En ambdós casos, els canvis d’expressió s’han comparat amb els canvis en l’estructura de la comunitat (mitjançant l’ARISA). A escala genòmica hem estudiat la resposta transcripcional global d’un microorganisme heteròtrof a la llum. La llum és responsable d’una gran quantitat de respostes fisiològiques. Una gran part dels microorganismes del mar que utilitzen la llum ho fan mitjançant la fotosíntesis, però existeixen d’altres microorganismes que utilitzen la llum de manera diferent, com els fotoheteròtrofs, que la utilitzen per generar energia però no fixen CO2. En un dels estudis de genòmica ambiental es va descobrir la presència d’una proteïna fotoactiva, la proteorodopsina, associada a un grup de bacteris marins no cultivats. Les proteorodopsines són responsables d’un nou mecanisme de fototrofia als oceans; funcionen com a bombes de protons accionades per la llum que generen un gradient de protons a la membrana per tal de sintetitzar ATP. A escala de gen, en aquesta tesi hem estudiat mitjançant RT-PCR l’expressió del gen de la proteorodopsina en un cultiu d’una flavobacteria marina i hem vist que la llum augmentava els seus nivells d’expressió. / Recent advances have been crucial to understand, or at least to have a new perspective, on the diversity of microorganisms present in the oceans through molecular biology and metagenomics. The next step is to find out what functions are hidden within this diversity and how and when are they used. The regulation of gene expression is the basis of the versatility and adaptability of any living organism to the environment. The study of the genes expressed in an organism can help to deduce many of the characteristics of the environment. Usually, organisms express only a portion of their genes in response to both internal factors (e.g. cell cycle) and external factors (temperature, light, nutrients, etc.). Massive sequencing technologies have also been applied to the study of the expression of genes in marine microbial communities (metatranscriptomics). However, these technologies are not yet sufficiently optimized and often provide sequences that cannot be assigned to known genes. In this PhD thesis I have studied gene expression of marine organisms at three different levels: at the community level, at the genome level, and at the gene level. The major effort was dedicated to gene expression at the community level, where the challenge was to develop a technique equivalent to DNA fingerprinting methods that are routinely used -such as ARISA or DGGE- in order to explore the dynamics of gene expression patterns in marine microbial communities, allowing the comparison of a large number of samples at an affordable price and without the need for prior knowledge of the messenger RNA sequences. This technique, called TFA (from “Transcriptome Fingerprinting Analysis”), has then been used to study I) seasonal variations in gene expression patterns of marine picoeukaryotes at the Blanes Bay Microbial Observatory during 4 years, and II) changes in expression patterns along spatial horizontal and vertical gradients and diel cycles. In both cases, expression changes were compared with changes in community structure (by ARISA). At the genomic level I have studied the global transcriptional response to light of a heterotrophic microorganism. Light is responsible for a large number of physiological responses. A large fraction of marine microorganisms that use light perform photosynthesis, but there are other organisms as photo-heterotrophs, who use light to generate energy but do not fix CO2. At the gene level, we have studied the proteorhodopsin gene expression by RT-PCR in a culture of a marine flavobacterium. In a study of environmental genomics, the presence of this photoactive protein was found to be associated with a group of uncultivated marine bacteria. Proteorhodopsins are responsible of a new mechanism of phototrophy in the oceans; they act as proton pumps powered by light that generate a membrane proton gradient in order to synthesize ATP. In the present study it was found that light increased the expression levels of the proteorhodopsin gene.

Over the last ten years, improvements in molecular techniques and the arrival of the next-generation sequencing technologies have revealed a large amount of structural variation (SV) in the human genome. Consequently, there has been a significant increase in interest from the scientific community to understand the role of the SV in diseases, such as cancer, or in determining phenotypic traits in the general population. The objective of this thesis has been to study in depth the characterization and the functional importance of the SV, through the analysis of different methods for its detection and its biological impact in two different contexts. First, we have analysed the presence of copy-number variants in several human populations using a microarray approach and, by validating one of the detected regions, we have confirmed the reliability of this method for the detection of this type of SV. Second, through the chronic lymphocytic leukaemia (CLL) genome project, we have identified structural variants in patients with CLL by whole-genome sequencing. To obtain a comprehensive analysis of the SV in cancer genomes, we have developed a computational tool with the capacity to characterize and define all forms of the SV using next-generation sequencing data. With this tool we have detected, on one hand, some novel variants in CLL and, on the other hand, a high level of genomic complexity in one of the patients studied. From this last case, we have carried out the evaluation of the phenotypic impact of the complex variants in the progression of the CLL, which has allowed us to determine the importance of analysing cancer as a dynamic process undergoing evolutionary changes over time / En els últims deu anys, les millores en tècniques moleculars i l’aparició d’una nova generació de tècniques de seqüenciació han revelat que existeix una gran quantitat de variació estructural (SV, en anglès) en el genoma humà. En conseqüència, hi ha hagut un augment significatiu en l’interès de la comunitat científica per entendre el paper que la SV juga en malalties com el càncer, o en la determinació de trets fenotípics en la població general. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat aprofundir en la caracterització i la importància funcional de la SV, analitzant diferents mètodes per a la seva detecció i el seu impacte biològic en dos contextos específics. En primer lloc, hem analitzat la presència de variants en nombre de còpia en diferents poblacions humanes mitjançant una tècnica de microarray i, a través de la validació d’una de les regions trobades, hem pogut confirmar la fiabilitat d’aquesta tècnica per detectar aquest tipus de SV. En segon lloc, a través del projecte del genoma de la leucèmia limfàtica crònica (LLC), hem caracteritzat variants estructurals en pacients amb LLC mitjançant la seqüenciació completa del seu genoma. Per tal d’obtenir un anàlisi el màxim d’exhaustiu de la SV en genomes de càncer, hem desenvolupat una eina computacional capaç de caracteritzar i definir totes les formes possibles de SV utilitzant dades de seqüenciació. Amb aquesta eina hem pogut detectar, per una banda, algunes variants noves en LLC i, per l’altra, un alt nivell de complexitat genòmica en un dels pacients. A partir d’aquest últim cas hem dut a terme l’avaluació de l’impacte fenotípic d’un patró de SV complex en la progressió de la LLC, la qual cosa ens ha permès determinar la importància d’analitzar el càncer com a un procés dinàmic sotmès a canvis evolutius al llarg del temps.

S:Als darrers 10 anys, el nostre coneixement de l'evolució dels animals ha estat objecte d'una revolució degut a l'aplicació de la Biologia Molecular al camp de la Filogènia, que ha rebutjat algunes hipòtesis antigues i n'ha proposat de noves. Un dels canvis més importants és el que subdivideix a tots els animals amb simetria bilateral (els Bilateria) en tres grups: els Lophotrochozoa, els Ecdysozoa y els Deuterostomata. Malgrat el gran cabdal d'informació que han suposat, les dades moleculars no han estat capaces de resoldre totes les relacions entre els fílums. Al començament, això era degut al l'ús de pocs marcadors moleculars, que no portaven prou informació i que patien artefactes metodològics com el Long Branch Atraction. L'objectiu d'aquest projecte és obtenir una filogènia molecular dels bilaterals el més resolta possible, mitjançant l'aplicació de dues aproximacions. La primera fa us de la gran quantitat de dades disponibles dels gens nuclears del RNA ribosomal (18S i 28S) a l'hora que es minimitza l'impacte dels artefactes filogenètics; s'ha obtingut una matriu de 104 representants dels bilaterals, pertanyents a 28 fílums i amb 3.700 parells de bases de longitud. Aquesta matriu s'ha analitzat mitjançant mètodes d'inferència filogenètica de tipus probabilístic (Maxima Versemblança i Inferència Bayesiana), tot fent servir models evolutius sofisticats i compartimentant les anàlisis pels grups problemàtics. La segona aproximació pretén construir una matriu dels bilaterals que maximitzi tant el nombre de marcadors com el de fílums representats. S'han seleccionat 13 gens candidat i recollit mostres per un total de 96 espècies de 31 fílums. S'han obtingut un total de 135 seqüències, que junt amb seqüències de les bases de dades, s'han fet servir per construir una matriu de 90 representants de 27 fílums amb 8.880 parells de bases de longitud i un 40% de missing data. Aquesta matriu s'ha analitzat amb mètodes d'inferència probabilístics.Els resultats principals dels dos estudis son: 1) es comprova la monofilia dels tres grans grups de bilaterals, així com la posició d'Acoela i Nemertodermatida com a bilaterals basals, 2) s'obté una filogènia resolta dels deuteròstoms, mentre que la filogènia dels ecdisozous resulta en una tricotomia i 3) s'obté una nova filogènia dels lofotrocozous, a on cal destacar als gnatostomulats i gastrotrics com els fílums més basals, la posició dels platihelmints com a grup germà de la resta d'animals espirals i la parafilia dels espirals degut a la posició de braquiòpodes i foronidis com a grup germà dels mol·luscs, 4) la filogènia obtinguda situa a Xenoturbella dins dels deuteròstoms, tot i que amb un suport molt baix, i no es pot descartar una posició més basal dins dels bilaterals, 5) els Chaetognatha pertanyen als ecdisozous, tot i que la posició exacta dins dels mateixos és dubtosa, i 6) la filogènia obtinguda ens ha permès especular sobre l'evolució de determinades característiques del patró corporal, mostrant la gran plasticitat de la seva aparició i la prevalença de l'adquisició independent d'algunes d'elles. / "Bilaterian molecular phylogeny: a multigenic approach"TEXT:Resolving the relationships among animal phyla is a key biological problem that remains to be solved. Morphology has been unable to determine the relationships among most phyla. During the past decade studies based on a limited number of markers established new hypotheses such as the existence of three bilaterian superclades (Deuterostomia, Ecdysozoa and Lophotrochozoa) but left major questions unresolved.The aim of this project is to obtain a well resolved bilaterian phylogeny applying two approaches. The first uses the great quantity of information available for 18S and 28S genes, while overcoming their pitfalls by combining several methods suggested in previous studies. A matrix was built, comprising 104 bilaterian representatives for 28 phyla and it is 3,700 base pairs long. The methods used include Maximum Likelihood and Bayesian Inference, the application of models with rate-heterogeneity across sites, wide taxon sampling, and compartmentalized analyses for each problematic clade. The second approach is based on maximizing the number of markers and the number of representatives. 13 genes were chosen as candidates and tissues for 96 species belonging to 31 phyla were sampled. 135 sequences were obtained, and used together with databases sequences to build a matrix 8,880 base pairs long, with 90 representatives for 27 bilaterian phyla and bears 40% of missing data.The results obtained show 1) the monophyly of the three superclades and the basal position of a paraphyletic Acoelomorpha, 2) a well resolved deuterostomates phylogeny, while ecdysozoan relationships turn up as a tricotomy, 3) a new lophotrochozoan phylogeny is obtained with gnathostomulids and gastrotrichs as the most basal phyla, flatworms as sistergroup to spiralians animals, and spiralians are paraphyletic due to the position of brachiopods and phoronids as sistergroup to molluscs, 4) Xenoturbella is shown within deuterostomates, though a more basal position cannot be rejected, 5) Chaetognatha belong to Ecdysozoa, though its exact position cannot be solved, and 6) the obtained phylogeny was used for a speculative discussion on morphological traits evolution, showing their great evolving plasticity.

La anemia de Fanconi (AF) es un síndrome hereditario raro, de patrón recesivo mayoritariamente autosómico. Clínicamente se caracteriza por presentar malformaciones congénitas, fallo de médula ósea progresivo, endocrinopatías, predisposición a cáncer e hipersensibilidad celular a agente inductores de enlaces cruzados en el DNA (ICL). Esta enfermedad puede ser causada por mutacions bialélicas en cualquiera de los16 genes que hasta la fecha se han identificado, por lo cual existen 16 grupos de complementación. El grupo de complementación más frecuente a nivel mundial es el FA-A (63%) y su espectro mutacional es altamente heterogeneo. En la población Española la frecuencia de este grupo de complementaciòn es mayor (77%) debido a su alta prevalencia en la población gitana española. En este estudio se ha continuado con el análisis mutacional de los pacientes FA-A españoles usando la estrategia de análisis de las mutaciones más comunes y se ha iniciado en paralelo el análisis mutacional de poblaciones AF de algunos países Latino-americanos usando dicha estrategia. Adicionalmente, se ha estudiado el fenotipo celular de pacientes Fanconi-like y otros pacientes con fenotipo celular similar incluyendo un ensayo de fragilidad cromosómica negativo. Por otra parte, se ha realizado un estudio a largo plazo de la evolución hematológica de pacientes AF con mosaicismo somático hematológico. Finalmente, se ha analizado la tasa de eficiencia del diagnóstico genético preimplantacional (DGP) con tipificación del antígeno leucocitario humano (HLA) en parejas con hijos afectos de AF. Estos resultados confirman que la estrategia de cribado mutacional realizado en pacientes FA-A españoles es eficiente para identificar el 51% de las mutaciones en pacientes españoles y sólo el 17% de las mutaciones en la población Latino-americana estudiada hasta el momento. La implementación de la secuenciación masiva del exoma es muy eficiente para el subtipaje de pacientes AF, especialmente para los subtipos menos frecuentes, de esta manera se han subtipado dos pacientes españoles (FA104: FA-Q y FA287: FA-J). Con respecto al análisis de los pacientes Fanconi-like se observó que tienen una sensibilidad celular intermedia a agentes inductores de ICLs asociado a un fenotipo clínico similar a AF. Interesantemente, células derivadas de pacientes deficientes en FAN1 presentan una sensibilidad celular intermedia a agentes inductores de ICLs pero no presentan un fenotipo hematológico de AF, lo cual descarta a FAN1 como un gen candidato para AF. Por otra parte, se ha observado una mejoría hematológica en la mayoría de los pacientes AF con mosaicismo somático, pero con casos excepcionales que son relevantes para la predicción de resultados de futuros ensayos de terapia génica. Los resultados moleculares sugieren que la evolución clínica en estos pacientes no sólo depende del nivel celular donde ocurrió la reversión mutacional, sino también de la edad biológica y el potencial proliferativo de la célula revertida. Finalmente, se ha encontrado una baja tasa de éxito en parejas con hijos afectos con AF sometidas a DGP con tipificación HLA, muy probablemente debido a la edad materna avanzada / Fanconi anemia (FA) is a rare genetic disorder, which is mainly inherited with autosomal recessive pattern. Clinically it is characterized by congenital and endocrine abnormalities, bone marrow failure, cancer predisposition and cellular hypersensitivity to DNA interstrand crosslinking agents (ICL). This disease is caused by biallelic mutations in any of 16 genes that have been identified so far, leading to 16 complementation groups. FA-A is the most common complementation group (63%) and its mutational spectrum is highly heterogeneous. In the Spanish population, the frequency of this complementation group is even higher (77%) due to its high prevalence in the Spanish gypsy population. In this study, we have continued the mutational analysis of Spanish FA-A patients by analyzing the most common mutations, and we also have started the mutational analysis of FA populations of some Latin-American countries by this strategy. In addition, we have studied the cellular phenotype of Fanconi-like patients and others patients with similar cellular phenotype including a negative chromosome fragility test. On the other hand, we have performed a long-term retrospective study of the hematological evolution of FA patients having hematologic somatic mosaicism. Finally, we have analyzed the rate of efficiency of preimplantation genetic diagnosis (PGD) with human leukocyte antigen (HLA) in couples with affected FA children. The results confirm that the mutational screening strategy adopted in Spanish FA-A patients is efficient to identify 51% of mutations in Spanish patients but only 17% of Latin-American populations studied so far. The implementation of whole exome sequencing is an efficient strategy for FA subtyping, especially for infrequent subtypes, as we have done confirming two Spanish patients (FA104: FA-Q and FA287:FA-J). It was observed that Fanconi-like patients share intermediate cell sensitivity to ICLs associated with clinical phenotype similar to FA. Interestingly, patient derived FAN1-deficient cells have intermediate cell sensitivity to ICLs but do not have a FA hematological phenotype, disregarding FAN1 as a candidate gene for FA. On the other hand, we have usually observed hematological improvement in patients with somatic mosaicism, but with exceptional cases that are relevant to predict the outcome of future gene therapy trials. The molecular results suggest that the clinical course in these patients depends not only on the cellular level where mutational reversion occurred but also on the biological age and proliferative potential of the reversed cell. Finally, we have found a very low success rate in couples with affected children with FA undergoing PGD with HLA typing, most probably due to the advanced maternal age.

Cerebral ischaemia is a potent inducer of gene expression, however, little is known about the mechanisms that regulate this expression. Studies of gene expression and the study of the mechanisms regulating this expression allow identifying new molecules regulated by ischaemia and possibly involved in the physiopathology of stroke. This thesis shows, (1) the importance of validating suitable endogenous controls for the studies of gene expression for each experimental condition; (2)that Gcf2/Lrrfip1 presents as a gene with diverse isoforms that are differentially expressed in response to stroke and that rLrrfip1, which has a possible protector role, is the main isoform; and (3) that the differential expression of the microRNAs remains from the acute to the chronic phase of ischaemia, having determined that miR-347 promotes neuronal apoptosis and Acsl4 and Arf3, potential targets of microRNAs differentially expressed in response to ischaemia, are new proteins to study in the physiopathology of stroke. / La isquèmia cerebral és un potent inductor de l’expressió gènica, en canvi, poc es coneix sobre els mecanismes que regulen aquesta expressió. Els estudis d’expressió gènica i l’estudi dels mecanismes reguladors d’aquesta expressió permeten identificar noves molècules regulades per la isquèmia i possiblement implicades en la fisiopatologia de l’ictus. Aquesta tesi mostra, (1) la importància de validar els controls endògens idonis per als estudis d’expressió gènica per cada condició experimental; (2) que Gcf2/Lrrfip1 és un gen amb diverses isoformes diferencialment expressades en resposta a la isquèmia, sent rLrrfip1 la isoforma principal amb un possible rol protector; i (3) que l’expressió diferencial dels microRNAs es manté des de la fase aguda fins la fase crònica de la isquèmia, havent determinat que el miR-347 promou l’apoptosis neuronal i que Acsl4 i Arf3, potencials dianes de microRNAs diferencialment expressats en resposta a la isquèmia, són noves proteïnes d’estudi en la fisiopatologia de l’ictus.

Both the prenatal and postnatal environment have a profound impact on the risk for adult diseases. A model of catch-up growth following fetal growth restriction was set in Wistar rats to study changes in the gene expression of energetic metabolism–related genes. Excessive adipose tissue accumulation and hypertrophy, decreased circulating adiponectin and triglycerides levels, higher HOMA-IR values and reduced expression of STK11, DLK1 and SIRT1 genes in retroperitoneal adipose, hepatic and muscular tissues were observed in pups with catch-up growth at postnatal day 42, that is related to visceral fat accumulation and insulin resistance. In conclusion, catch-up growth following prenatal growth restriction leads to changes in STK11, DLK1 and SIRT1 gene expression. These genes could be new therapeutic targets for early prevention on fetal programming of metabolic disorders in adulthood. / Els ambients pre i postnatal poden augmentar el risc de desenvolupar malalties en l’edat adulta. S’ha dissenyat un model animal de creixement recuperador postnatal secundari a restricció de pes prenatal en rates Wistar per estudiar canvis en l’expressió de gens de regulació metabòlica. Les cries amb creixement recuperador postnatal presenten acumulació excessiva i hipertròfia del teixit adipós visceral, disminució dels nivells l’adiponectina i triglicèrids circulants, augment del valor de HOMA-IR i baixa expressió dels gens STK11, DLK1 i SIRT1 en els teixits adipós, hepàtic i muscular en el dia postnatal 42 que es relaciona amb acumulació de greix visceral i resistència a la insulina. En conclusió, el creixement recuperador postnatal secundari a restricció de pes prenatal provoca canvis en l’expressió dels gens STK11, DLK1 i SIRT1, els quals podrien ser noves dianes terapèutiques per a la prevenció precoç de la programació fetal dels desordres metabòlics en l’edat adulta.

La migranya és un trastorn neurològic comú que afecta un 15% de la població. Es caracteritza per l’aparició d’episodis de cefalees recurrents i incapacitants, molt sovint acompanyades d’altres símptomes com la sensibilitat a la llum, les nàusees o els vòmits. La seva prevalença és variable en funció de l’edat i el sexe, essent fins a tres vegades més freqüent en dones en etapa adolescent o adulta. Clínicament, la migranya es classifica en dos subtipus, migranya sense aura i migranya amb aura, aquesta última caracteritzada per l’aparició de símptomes neurològics que precedeixen i/o acompanyen la cefalea. La migranya comuna té una etiologia complexa, en què participen factors genètics, encara poc coneguts, i ambientals. Hi ha, però, una forma monogènica del trastorn, la migranya amb aura hemiplègica, de la qual ja s'han resolt molts casos, amb gens i mutacions descrites, i que per tant constitueix un bon punt de partida per abordar l'estudi de la migranya comuna. En aquest treball hem aprofundit en els aspectes genètics de les formes rara i comuna de migranya, en pacients amb i sense aura. S’han dut a terme cribratges mutacionals, basats en seqüenciació i anàlisi de CNVs, en pacients amb migranya hemiplègica o altres trastorns paroxístics relacionats, tot identificant diverses mutacions causals. D’altra banda, s’han realitzat estudis d’associació a escala genòmica i amb gens candidats amb l’objectiu de detectar variants de susceptibilitat a la migranya comuna. Entre les dianes dels nostres estudis hi ha els microRNAs, molècules reguladores de l'expressió gènica que no havien estat avaluades fins ara en pacients migranyosos. En últim terme, es presenten els resultats preliminars d’un estudi de transcriptòmica en un model animal de depressió cortical propagant. / Migraine is a common neurological disorder that affects 15% of the population. It’s caractherized by reccurent and inhabilitating episodes of headache, often accompanied by other symptoms like photophobia, nauseas or vomiting. The prevalence of migraine is dependent on sex and age, being more frequent in adolescent and adult women. Clinically, migraine is classified in two subtypes, with and without aura, the first characterized by the appearance of neurological disturbances that preceede or accompany the migraine episode. Common migraine presents a complex ethiology, in which both genetic and environmental factors are involved. Moreover, there is a monogenic form of the disease, hemiplegic migraine, which genetic bases are known in part. This rare form of migraine turns into a good starting point to address the study of common forms of migraine. In this Thesis we have studied the genetic factors that underlie both common and rare migraine, in patients with and without aura. We have performed mutational screening, based on sequencing and CNV analysis, in patients with hemiplegic migraine and other related paroxystic disorders that have allowed the identification of several causal mutations. Moreover, case-control association studies have been performed, at both genome-wide level or on candidate genes, in order to detect risk variants for common migraine. Among the different candidates assessed, we have focused our attention mainly on microRNAs, important gene expression regulatory molecules that had not been previously explored in migraine patients. Finally, we present the preliminary results of a transcriptomic study in a rat model of cortical spreading depression.

Tesi realitzada a l'Institut Català d'Oncologia - IDIBELL / La presente tesis doctoral consta de 4 proyectos independientes centrados en el estudio de las causas genéticas del cáncer colorrectal (CCR) hereditario: A) Estudio de una variante común (rs2075786) en el gen de la telomerasa como modificador de riesgo de cáncer en síndrome de Lynch: Identificamos un incremento de riesgo de desarrollar un cáncer asociado al síndrome de Lynch (SL) en los pacientes jóvenes (<45 años) con el genotipo AA para rs2075786, los cuales mostraron telómeros más cortos que aquellos con el genotipo GG. Análisis in silico posteriores predijeron la rotura de un sitio de unión a retinoides con efecto modulador de la transcripción, lo cual podría implicar una activación más temprana de la actividad telomerasa. B) Caracterización de tumores desarrollados en el contexto del cáncer colorrectal familiar tipo X: Se realizó una caracterización de los tumores desarrollados en el contexto del cáncer colorrectal familiar de tipo X (CCRFX), comparando los resultados obtenidos con las características propias del CCR esporádico sin fallos en el sistema reparador de bases desapareadas. La caracterización incluyó: a) El estudio del patrón cromosómico: Los resultados obtenidos mostraron patrones de alta inestabilidad cromosómica muy cercanos a los reportados en los casos de CCR esporádico. Sin embargo, revelaron una mayor frecuencia de ganancias en los brazos 2p y 2q, y una mayor frecuencia de pérdidas de 10q al considerar sólo los casos Ámsterdam I. b) El screening de mutaciones en los genes KRAS, BRAF, TP53 y PIK3CA, implicados en las vías de desarrollo del cáncer: Mientras que las frecuencias mutacionales de KRAS, BRAF y PIK3CA alcanzaron valores similares en los dos grupos estudiados, los tumores CCRFX mostraron una carga de mutaciones para TP53 cercana a la mitad de la identificada en los tumores de colon esporádicos, aunque esta diferencia no alcanzó niveles significativos. c) El análisis del estado de metilación de las islas CpG: El estudio de 25 tumores CCRFX identificó un bajo nivel de metilación general para la gran mayoría (88%) de los tumores analizados (≤3/8 promotores de genes metilados). C) Caracterización de tumores desarrollados en el contexto del cáncer colorrectal familiar tipo X: Realizamos la secuenciación del dominio exonucleasa de POLE y POLD1 en 441 pacientes con CCR familiar no polipósico y en otros 88 afectos de poliposis. Como resultado, se identificaron seis mutaciones nuevas o raras en POLD1, cuatro de ellas mostrando evidencias de patogenicidad. Además, se realizó una revisión exhaustiva de los casos identificados previamente en la literatura, elaborándose unas guías de recomendación para el estudio genético de POLE y POLD1, así como para el seguimiento preventivo de portadores. D) Búsqueda de la causa genética del CCRFX mediante ultra-secuenciación de exomas: Con la intención de identificar genes causantes de la agregación familiar presente en el CCRFX, los exomas de tres individuos afectos con CCR de una misma familia con CCRFX fueron secuenciados. Las variantes genéticas identificadas en los tres individuos fueron sometidas a varios procesos de cribado, en base al tipo de mutación y su impacto sobre la proteína, su ausencia en poblaciones control o la relevancia de la función del gen. Varias mutaciones fueron seleccionados para su estudio en profundidad, incluyendo: cosegregación de la variante con la enfermedad, búsqueda de un segundo evento inactivante del alelo salvaje, estudios de predicción in sílico, revisión bibliográfica o búsqueda de mutaciones adicionales en series de pacientes con CCR familiar. En base a los resultados obtenidos, propusimos un modelo poligénico en el que mutaciones en los genes BRF1, BARD1 y CLCA1 estarían contribuyendo a la predisposición al CCR presente en la familia estudiada. / The herein thesis “Caracterización molecular y búsqueda de causas genéticas del cáncer colorrectal hereditario no polipósico” (in English, “Molecular characterization and search for genetic causes in the hereditary non-polyposis colorectal cancer”) comprises four different studies: A) Genetic variant rs2075786 in the telomerase gene modifies cancer risk in Lynch syndrome: We found an association between the rs2075786 A allele, specially in homozygosity, with increased cancer risk of developing cancer in Lynch syndrome (LS) carriers under the age of 45. Besides, cancer-affected LS patients with the AA genotype have shorter telomeres than those with GG. In silico studies predicted that the SNP causes the disruption of a transcription binding site for a retinoid receptor, probably provoking early telomerase activation. B) Comprehensive molecular characterisation of hereditary non-polyposis colorectal tumours with mismatch repair proficiency. Hereditary non-polyposis colorectal tumours showed presence of high chromosomal instability and a higher frequency of chromosome 2p and 2q gains and of 10 q loss, when comparing to sporadic colorectal tumors with mismatch repair proficiency. No statistically significant differences between these two groups were found in the frequency of BRAF, KRAS, PIK3CA and TP53 mutations. Besides, hereditary non-polyposis colorectal tumours showed a low degree of CpG islands methylation. C) Study of the impact of POLE and POLD1 mutations in the familial colorectal cancer and/or polyposis. The exonuclease domains of POLE and POLD1 were studied 441 kindreds with familial non-polyposis colorectal cancer (CRC) and 88 with polyposis. Six novel or rare POLD1 variants, four of them with strong evidence for pathogenicity, were identified in non-polyposis CRC families. We also suggested some recommendations for POLE and POLD1 mutation screening and to define the clinical management of mutation carriers D) Search for the genetic cause of the colorectal cancer type X by whole-exome sequencing. In order to find the genetic cause of the familial colorectal cancer type-X, we sequenced the whole exome of three CRC affected relatives from the same type-X family. After several steps of mutations filtering and extensive experimental and in silico studies, we proposed a poly-genic model to explain the CRC aggregation within the family, in which mutations in BRF1, BARD1 and CLCA1 would be contributing to the familiar CRC predisposition.

Históricamente, los individuos portadores de alelos premutados se consideraban asintomáticos dado que no manifestaban discapacidad intelectual. Sin embargo, desde el año 2000 se han descrito dos patologías de aparición tardía asociadas específicamente a estos individuos: la insuficiencia ovárica primaria (FXPOI; OMIM#311360, ORPHA619) y el síndrome de temblor/ataxia asociado al X-Frágil (FXTAS; OMIM#300623, ORPHA93256). No obstante, cada vez es más evidente que existe un amplio espectro de manifestaciones clínicas que abarca alteraciones cognitivas, psiquiátricas, endocrinas e inmunológicas que afecta en cierto grado a los individuos portadores de la premutación. Un factor que tienen en común todas las patologías asociadas a la premutación es la penetrancia reducida, es decir, no todos los individuos portadores de alelos premutados desarrollaran alguna de estas patologías y en cambio otros pueden llegar a desarrollar varías de ellas. En este contexto, el desarrollo de las tecnologías de alto rendimiento ha proporcionado herramientas científica y metodológicamente prometedoras para el avance del conocimiento sobre las causas y mecanismos involucrados en las enfermedades complejas. El objetivo principal de esta tesis doctoral es el de ampliar el conocimiento de las bases moleculares de las patologías asociadas a la premutación, principalmente en FXPOI y FXTAS. En el trabajo I se han utilizado microarrays de expresión para la determinación del transcriptoma en sangre periférica de mujeres portadoras de la premutación con y sin FXPOI. El análisis de enriquecimiento funcional ha puesto de manifiesto la infraexpresión de vías moleculares de señalización indispensables para la activación de los folículos primordiales, el mantenimiento de su supervivencia y la maduración de los oocitos. Por otra parte, en el trabajo II se ha utilizado la secuenciación masiva de los ARNs de pequeño tamaño y microarrays de expresión de miRNAs para determinar el perfil de expresión de los miRNAs en muestras de sangre periférica de pacientes FXTAS. Este estudio ha demostrado que la biogénesis de los miRNAs no está alterada en este tejido, sin embargo existe una desregulación de su expresión por lo podrían estar implicados en la patogénesis del FXTAS. Por otro lado, los resultados del trabajo III sugieren que la inactivación preferencial del cromosoma X en las mujeres portadoras de la premutación del gen FMR1contribuye significativamente en el riesgo a desarrollar FXTAS, ya que existe un incremento significativo de la inactivación preferencial en las mujeres portadoras de la premutación respecto a la población control. Además, el patrón de inactivación es totalmente distinto. De manera que todas las mujeres con FXTAS con inactivación preferencial inactivaban preferencialmente el alelo normal mientras que las asintomáticas inactivaban preferencialmente el alelo expandido. Finalmente, se ha puesto de manifiesto una disfunción mitocondrial en los fibroblastos de pacientes con FXTAS. Este estudio identificó la disminución de la capacidad oxidativa de los fibroblastos de pacientes con FXTAS, la cual no puede ser atribuida a un menor número de mitocondrias ya que el análisis de la actividad de la enzima citrato sintasa, mostró niveles similares entre pacientes y controles. Además, el estudio mediante microscopia confocal reveló que la red mitocondrial de los pacientes con FXTAS es significativamente más circular y se encuentra menos interconectada que en el grupo control. / For many years, there was no a priori expectation for clinical involvement in the premutation range, since these individuals do not present intellectual disability. However, it is now clear that at least two distinct clinical phenotypes among carriers of premutation alleles: fragile X-associated primary ovarian insufficiency (FXPOI) and fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS). Premutation alleles are hyper-expressed and disease symptoms result from the deleterious consequences of high levels of expression of the transcript with large numbers of CGG-repeats. There is a lingering difficulty with our understanding of the FMR1 premutation-associated disorders; that is, the inability to predict who will develop any of the particular phenotypes. The major objective of this doctoral thesis is to deep knowledge of molecular mechanisms underlying FMR1 associated pathologies, mainly FXPOI and FXTAS. In the first study, transcription profiling of total blood from FMR1 premutation female carriers with and without FXPOI revealed the deregulation of key signaling pathways involved in oocyte maturation in FXPOI females. These results suggest that the impairment of fertility in these females might be due to a generalized deregulation rather than defects in a single gene. In the second study, it was evidenced a differential miRNA expression profiling in FXTAS blood samples suggesting that miRNAs are involved in FXTAS pathogenesis. In the third study, it was detected differences regarding the allele presenting severe skewed X-chromosome inactivation between the FXTAS and no-FXTAS groups. This finding suggests that skewed X-chromosome inactivation of the normal FMR1 allele may be a risk factor for the development of FXTAS. Finally, mitochondrial dysfunction was evidenced in skin fibroblasts from FXTAS patients. Furthermore, alteration of the mitochondrial network was also observed in FXTAS skin fibroblasts. Collectively, these results indicate that both mitochondrial function and dynamics are implicated in the pathophysiology and/or aetiology of neurological symptoms from FXTAS patients.