In photosynthetic organisms the redox-dependent modification of thiols belonging to enzymes of the photosynthetic cycle, plays a prominent role in the regulation of metabolism and signalling. An important regulatory mechanism is represented by light that acts through a ferredoxin-thioredoxin system. The system permits the reduction/oxidation of disulfide bridges of the target enzymes. Moreover, cysteines residues can undergo other modifications such as glutathionylation and nitrosylation. Proteomic studies have allowed the identification of new putative targets of redox modifications, including Calvin Benson cycle enzymes. The aim of the studies was to investigate whether phosphoglycerate kinase, triose phosphate isomerase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Chlamydomonas reinhardtii undergo redox modifications. All enzymes and their mutants (i.e. cysteines variants) were purified and the treatments with alkylating and oxidative agents have permitted to confirm the presence of reactive cysteine(s). The sensitivity of recombinant proteins to redox modifications and the cysteine(s) involved were analyzed by biochemical approcheas. The structural features were analyzed, and the crystallography structure of CrTPI and CrGPA were solved. The three enzymes result all redox regulated although with different biochemical features. The CrPGK contains two cysteines sensitive to redox treatments, although the inhibitor effects of these modifications are different, indeed glutathionylation slightly affected the enzymatic activity compare to nitrosylation. Moreover, the crystallographic structure of CrTPI was determined at a resolution of 1.1.Å, showing a homodimeric conformation containing the typical α/β- barrel fold. No evidence for CrTPI Trx-dependent regulation was obtained but was found to undergo glutathionylation and nitrosylation with a moderate down-regulation on activity. Furthermore, the CrGAPA shows an extreme sensitivity to oxidant molecules and the crystallographic structure of CrGAPA was determined at a resolution of 1.8.Å, confirming the tetrameric fold of the enzyme. the results suggest that redox modifications could constitute a mechanism for the regulation of the Calvin-Benson cycle under oxidative stress conditions.

A lipoaspiração é a cirurgia estética mais comumente realizada pelas mulheres no mundo. Uma vez que o tecido adiposo é um órgão metabolicamente ativo, alguns autores sugeriram que a remoção cirúrgica do tecido adiposo subcutâneo (TAS) pudesse exercer efeitos importantes no perfil metabólico. Além disso, estudos experimentais observam ganho de gordura compensatório no tecido adiposo intacto em resposta à lipectomia. O exercício físico regular induz a inúmeras melhoras no perfil metabólico e na composição corporal, promovendo o aumento do gasto energético total e preservação da massa magra. Estudos sobre os efeitos integrados do exercício e da lipoaspiração em humanos são inexistentes na literatura. Desta forma, este estudo visou avaliar o efeito da lipoaspiração acompanhada de treinamento físico sobre o perfil metabólico, a adiposidade e a distribuição de gordura corporal em mulheres adultas e eutróficas (20 a 35 anos; IMC: 23,8 ± 2.2 Kg/m2). Trinta e seis mulheres foram submetidas à cirurgia de lipoaspiração abdominal. Dois meses após a cirurgia, as voluntárias foram divididas em dois grupos: treinado (LT; n=18) e sedentário (LS; n=18). O treinamento físico consistiu de treinamento aeróbio e de força, 3x/semana, por 16 semanas. A metodologia empregada incluiu avaliação do peso corporal, composição corporal (pesagem hidrostática), distribuição da gordura abdominal (tomografia computadorizada), consumo alimentar (diário alimentar), perfil lipídico, concentração de citocinas anti e proinflamatórias, de adiponectina e de leptina antes (PRE), dois meses após a cirurgia (POS-2) e seis meses após a cirurgia (POS-6). A capacidade física (determinada pelo VO2max, e por testes de repetição máxima para membros inferiores e superiores), a taxa metabólica de repouso (TMR) (calorimetria indireta), a determinação do diâmetro médio dos adipócitos e a expressão gênica dos fatores de transcrição para adipogênese, das citocinas anti e proinflamatórias, da leptina e da adiponectina no tecido adiposo subcutâneo abdominal e femoral foram avaliadas nos tempos PRE e POS-6. O consumo alimentar permeceneu inalterado ao longo do estudo. Seis meses após a cirurgia, o grupo LS apresentou tendência ao retorno do peso e da massa gorda total aos valores basais, bem como aumento do tecido adiposo visceral (TAV) e queda da TMR. O grupo LT também apresentou queda da TMR, mas manteve os valores de peso corporal e de massa gorda diminuídos em resposta à cirurgia no POS-6 e apresentou aumento da massa magra e manutenção do TAV. Ambos os grupos apresentaram queda das concentrações de adiponectina e aumento do colesterol total, da LDL-colesterol e da razão LDL/Apolipoproteína B no POS-6. Por meio dos resultados, podemos concluir que a remoção do tecido adiposo abdominal subcutâneo (TAS) em sujeitos eutróficos parece desencadear mecanismos que favorecem a reposição e o crescimento compensatório de tecido adiposo, em especial na cavidade visceral, além de acarretar na diminuição das concentrações de adiponectina, sugerindo possíveis efeitos deletérios no risco cardiovascular em longo prazo. A prática de exercício físico após a cirurgia é de extrema importância para preservar os efeitos da cirurgia na composição corporal, prevenir contra o crescimento compensatório de gordura na cavidade visceral e atenuar seus possíveis efeitos deletérios no metabolismo em longo prazo / Liposuction is the most communly cosmetic surgery performed worlwide. Because adipose tissue is metabolicaly active, researchers have suggested that the surgical removal of fat through liposuction could benefically affect the metabolic profile. In addition, in many species, when body fat is removed, it is recovered rapidly due to compensatory fat growth at intact depots. Regular exercise training benefits metabolic profile and body composition by increasing energy expenditure and preserving fat free mass. Studies about the associated effects of liposuction and physical exercise lack in the literature. Thus the aim of this study was to evaluate the effects of liposuction associated with exercise training on metabolic profile, adiposity and body fat distribution in adult normal weight women (20 to 35 years old, BMI: 23,8 ± 2.2 Kg/m2). Thirty-six women underwent a small-volume abdominal liposuction (mean fat aspirate supernantant: 1240.3 ± 363.6 ml). Two months after surgery were randomly divided into two groups: trained (TR; n=18) and sedentary control (SC; n=18). The four-month exercise program consisted of aerobic plus resistance training, thrice a week. Body composition (hydrostatic weighing), body fat distribution (computer tomography), dietary intake (food records), lipid profile, plasmatic concentration of citokyne, adiponectin and leptin were assessed at baseline (PRE), two (POST-2) and six months after surgery (POST-6). Physical capacity (by VO2max, one repetition maximum (1RM) bench and leg press ), resting energy expenditure (TMR - indirect calorimetry), adipocyte size and gene expression of adipogenesis transcription factors, leptin, adiponectin and citokyne were assessed at PRE and POST-6. Dietary intake was unchanged throughout the study. Six months after surgery, LS group showed increased visceral adipose tissue (TAV), decreased TMR and a tendency to return body weight and fat to baseline values. LT group also showed decreased TMR, but sustained liposuction-induced decreased body weight and fat, increased fat free mass and preserved TAV at POST-6. Both groups showed decreased levels of adiponectin and increased levels of total cholesterol, LDL, cholesterol and LDL/ApoB ratio at POST-6. In conclusion, abdominal subcutaneous fat removal in normal weight subjects triggers a compensatory increase of fat, specially towards the visceral cavity, and lowers adiponectin levels, which could enhance long-term cardiovascular risk. Additionally, exercise training plays a very important role in preserving against the compensatory increase of visceral fat and attenuating possible long-term deleterious effects

Submitted by Gizele Lima (gizele.lima@inpa.gov.br) on 2017-02-13T18:52:52Z No. of bitstreams: 2 Tese de Doutorado_Marcos Prado Lima_GCBEv.pdf: 4143016 bytes, checksum: 33bb9eb6b868b0a6893a86ded5c5480c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T18:52:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese de Doutorado_Marcos Prado Lima_GCBEv.pdf: 4143016 bytes, checksum: 33bb9eb6b868b0a6893a86ded5c5480c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-05-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In recent years, the balance of the natural ecosystems has been affected by climate change resulting from a continuous increase of greenhouse gases, mainly carbon dioxide. According to the Intergovernmental Panel on Climate Change, the IPCC, there will be an increase in the temperature around the planet, which enhances the risk of biodiversity loss in vulnerable regions such as the Amazon. Fish, like other ectothermic animals, do not control their body temperature and will then be subject to environmental variations that can compromise vital metabolic processes, causing to death. Thus, to understand how Amazonian fish can respond to global climate change, this study aimed to evaluate the biological effects of exposure of tambaqui, an Amazonian important fish species, to major climate change scenarios foreseen by IPCC for the year 2100. Juveniles of tambaqui were exposed during 150 days to the current environmental situation and B1, A1B and A2 climate change scenarios. Firstly were investigated changes in gene expression profile after 5 and 15 days of exposure through the construction of eight RNA-Seq libraries, which were sequenced using a next generation sequencer SOLID 4. The obtained results enabled to identify 32,512 genes on the transcriptome of tambaqui, being 236 and 209 differentially expressed after 5 and 15 days of exposure, respectively. A large number of differentially expressed genes identified indicates that a complex combination of genes is involved in tambaqui's response to climate change, especially genes related to energy metabolism, chaperones, transcription initiation factors and translation and ribosomal genes. Secondly, we investigated the occurrence of DNA damage in erythrocytes, several hematological parameters and ion regulation of tambaqui during 150 days of exposure to the various climate change driven environmental scenarios. The results revealed the existence of DNA strand breaks in erythrocytes after 30 days of exposure, changes in several hematological parameters, particularly those related to increase of red blood cells to compensate the increased demand of oxygen to tissues, as well as a severe imbalance in the plasma ion concentrations and the activity of key ion regulation enzymes of the gills. Thus, we concluded that the exposure of tambaqui to the analyzed climate change driven environmental scenarios can result in severe imbalances of vital metabolic processes that impair cellular homeostasis and pose a greater health risk to the analyzed species. / Nos últimos anos o equilíbrio dos ecossistemas naturais do planeta tem sido afetado pelas mudanças climáticas resultantes do aumento de gases do efeito estufa, especialmente dióxido de carbono. De acordo com o Painel Internacional sobre Mudanças no Clima, o IPCC, até o ano 2100 haverá elevação na temperatura média em todo o planeta, o que aumenta o risco de perda de biodiversidade em regiões mais vulneráveis como a Amazônia. Os peixes, assim como outros animais ectotérmicos, não possuem a capacidade de controlar sua temperatura corporal, ficando então sujeitos a variações ambientais que podem inviabilizar processos metabólicos vitais, levando o organismo à morte. Assim, para compreender como o tambaqui e outros peixes amazônicos poderão reagir ao aumento nos níveis de CO2 e de temperatura, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos biológicos da exposição do tambaqui, uma espécie símbolo da Amazônia, aos principais cenários de mudanças climáticas previstos pelo IPCC para o ano 2100. Exemplares de tambaqui foram expostos durante 150 dias ao cenário atual e a três cenários climáticos B1, A1B e A2. Na primeira parte do estudo foram investigadas alterações na expressão gênica após 5 e 15 dias de exposição por meio da construção de oito bibliotecas de RNA-Seq, que foram sequenciadas em um sequenciador de nova geração SOLID 4. Os resultados obtidos possibilitaram a identificação de 32.512 genes do transcriptoma do tambaqui, sendo 236 e 209 diferencialmente expressos após 5 e 15 dias de exposição, respectivamente. O grande número de genes diferencialmente expressos identificados sugere que uma complexa combinação de genes está envolvida na resposta do tambaqui às mudanças climáticas, especialmente genes relacionados ao metabolismo energético, chaperonas, fatores de iniciação da transcrição e tradução e genes ribossomais. Na segunda parte do estudo foram investigadas a ocorrência de danos ao DNA de eritrócitos, diversos parâmetros hematológicos e aspectos de regulação iônica do tambaqui durante 150 dias de exposição. Os resultados revelaram aumento no número de quebras no DNA de eritrócitos após 30 dias de exposição, alterações em diversos parâmetros hematológicos, especialmente aqueles relacionados ao aumento no número de eritrócitos e um severo desbalanceamento na concentração de íons plasmáticos e na atividade das principais enzimas branquiais de regulação iônica. Dessa forma, concluímos que os três cenários de mudanças climáticas avaliados podem provocar graves desequilíbrios em processos metabólicos vitais que alteram a homeostase celular do tambaqui e podem colocar em risco a sobrevivência da espécie.

Made available in DSpace on 2019-03-29T23:27:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-18 / BACKGROUND: Diabetes mellitus is a chronic metabolic syndrome, characterized by hyperglycemia with potential to injure different organs, including eyes, kidneys, heart, blood vase, nerves and brain. If the anatomic and physiological changes resulting from the process of hyperglycemia has the potential to injure blood vase and nerves, it is believed that the organs responsible for hearing may also, be affected by diabetes, causing audio variations in these patients. OBJECTIVES: To evaluate the hearing of the type 2 diabetic patients, analyzing the audio threshold and cochlear function and to investigate the association between audiological findings, chronic complications and comorbidities. METHODS: The crosssectional analytical study was conducted at the Integrated Center of Hypertension and Diabetes of the State of Ceará. The sample was consisted of patients with diabetes mellitus type 2, regardless of sex, aged between 30 and 60 years, from April to July 2009. Was performed pure tone audiometry, transient evoked (TEOAE) and distortion product (DPOAE) from otoacoustic emissions. RESULTS: Of the study with 152 diabetic patients, 62.5% were female. The medium age was 53.4 ± 6.02 years. The average time in diagnosis of diabetes was 11.2 ± 6.3 years. The findings related to hearing showed audio loss in 63.2% of the patients, all of which were sensorineural with a predominance of bilateral and symmetric hearing losses, mild and flat configuration. The otoacoustic emissions analysis showed 114 (75%) patients with abnormal TEOAEs and 120 (78.9%) DPOAEs. The hearing thresholds average by frequency assumed values above 25dB from the frequency of 4 kHz, showing greater commitment to high frequencies. The association of hearing loss with the studied variables have shown a greater risk for males, aged over 50 and overweight (obesity). For TEOAEs was found more risk in men and in patients with obesity, and for the DPOAEs in men and in older age. CONCLUSION: The evaluation of hearing results showed a predominance of bilateral symmetrical sensorineural hearing loss, with more pronounced in high frequencies and greater involvement of the left side. The otoacoustic emissions analysis revealed a high percentage of changes, which have shown more injury in high frequencies and on the left side. The correlation between the results of audiometry and otoacoustic emissions have shown that the part of the sample had presented an absence of otoacoustic emissions before normal audibility thresholds, suggesting that the outer hair cells of the cochlea are damaged in this population. Sex, age and overweight/obesity were associated with hearing loss. Regarding to emissions, sex and overweight/obesity were associated with the absence of TEOAE; and sex and age with absence of DPOAE. The other variables have shown no statistically significant association for hearing disorders studied. / INTRODUÇÃO: O Diabetes mellitus é uma síndrome metabólica crônica, caracterizada por hiperglicemia, com potencial para lesionar diversos órgãos, entre eles: olhos, rins, coração, vasos sanguíneos, nervos e cérebro. Se as alterações anatomofisiológicas decorrentes do processo de hiperglicemia têm potencial para lesionar vasos sanguíneos e nervos, acredita-se que os órgãos responsáveis pela audição também possam ser afetados pela doença, causando alterações auditivas nos pacientes. OBJETIVOS: Caracterizar a audição do paciente diabético tipo 2, analisando o limiar de audibilidade e a função coclear e investigar a associação entre os achados audiológicos e as complicações crônicas e co-morbidades. METODOLOGIA: O estudo transversal e analítico foi realizado no Centro Integrado de Diabetes e Hipertensão do Estado do Ceará. A amostra foi composta por pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2, independente do sexo, com idades variando entre 36 e 60 anos, no período de abril a julho de 2009. Foram realizadas audiometria tonal liminar, emissões otoacústicas evocadas transientes (EOAT) e produto de distorção (EOAPD). RESULTADOS: Foram avaliados 152 pacientes diabéticos, 62,5% do sexo feminino. A média de idade foi de 53,4 ± 6,02 anos. O tempo médio de diagnóstico foi de 11,2 ± 6,3 anos. Os achados relacionados à audição mostraram perda auditiva em 63,2% dos pacientes, sendo todas do tipo sensorioneural, com predomínio das perdas bilaterais e simétricas, de grau leve e configuração plana. A análise das emissões otoacústicas mostrou 114 (75%) pacientes com alteração nas EOAT e 120 (78,9%) nas EOAPD. A média dos limiares de audibilidade por frequência assumiu valores acima de 25dB a partir da frequência de 4KHz, mostrando maior comprometimento de frequências agudas. A associação da perda auditiva com as variáveis estudadas mostrou mais risco para o sexo masculino, na faixa etária acima de 50 anos, e com sobrepeso, obesidade. Para as EOAT encontrou-se mais risco no sexo masculino e nos pacientes com sobrepeso ou obesidade; e para as EOAPD houve mais risco no sexo masculino e na faixa etária mais elevada. CONCLUSÃO: A avaliação da audição mostrou predomínio de perda auditiva sensorioneural bilateral simétrica, com prejuízo mais acentuado nas frequências agudas e maior comprometimento do lado esquerdo. A análise das emissões otoacústicas revelou elevada porcentagem de alterações, mostrando comprometimento maior nas frequências agudas e no lado esquerdo. A correlação entre os resultados da audiometria e das emissões otoacústicas mostrou que parte da amostra apresentou ausência de resposta das emissões otoacústicas diante de limiares de audibilidade normais, sugerindo que as células ciliadas externas da cóclea estão prejudicadas nesta população. O sexo, a faixa etária e o sobrepeso/obesidade apresentaram associação com a perda auditiva. Em relação às emissões otoacústicas, o sexo e o sobrepeso/obesidade apresentaram associação com a ausência de EOAT; e o sexo e a faixa etária com a ausência de EOAPD. As demais variáveis não apresentaram associação estatisticamente significante para as alterações auditivas estudadas.

A homeostase de metais é mantida nas células vegetais por transportadores especializados que compartimentalizam ou realizam o efluxo dos íons metálicos, mantendo as concentrações citosólicas dentro de uma faixa adequada. OsMTP1 e OsMTP11 são membros da família de transportadores de metais CDF/MTP em Oryza sativa, e acredita-se que eles possuem papéis importantes na homeostase de Zn e Mn em plantas de arroz, respectivamente. A complementação funcional do mutante de Arabidopsis mtp1-1 pela expressão ectópica de OsMTP1 demonstra que esta proteína transporta Zn in planta. Embora a localização subcelular de OsMTP1 tenha sido previamente caracterizada como de membrana plasmática, nossos resultados indicam localização no tonoplasto. A expressão heteróloga de OsMTP1 em levedura mutante zrc1 cot1 resgatou a hipersensibilidade do mutante a Zn; OsMTP1 também mitigou em algum nível a sensibilidade de zrc1 cot1 a Co; e complementou a hipersensibilidade a Fe e Cd dos mutantes ccc1 e ycf1, respectivamente, quando testados em baixas concentrações dos metais correspondentes. Esses resultados sugerem que OsMTP1 transporta Zn, mas também Co, Fe e Cd, talvez com afinidade mais baixa. Estudos com mutações sítio-dirigidas nos permitiram identificar duas substituições em OsMTP1, L82F e H90D, que parecem alterar a função de transporte de OsMTP1. OsMTP1ΔL82F ainda transporta baixos níveis de Zn, com afinidade aumentada pra Fe e Co, enquanto OsMTP1ΔH90D elimina completamente o transporte de Zn e aumenta o transporte de Fe. Além disso, mostramos evidências do papel de OsMTP11 no transporte de Mn. A expressão heteróloga de OsMTP11 no mutante de levedura pmr1 complementou parcialmente a hipersensibilidade deste a Mn. Identificamos quatro resíduos possivelmente envolvidos na função de transporte de OsMTP11: as substituições D267H, D162A e E213G reduziram o resgate da hipersensibilidade a Mn em diferentes níveis; enquanto L150S complementou totalmente a hipersensibilidade do mutante pmr1. Os resultados apresentados neste trabalho são novas contribuições para a área de nutrição mineral de plantas e podem ser úteis em aplicações biotecnológicas como fitorremediação e biofortificação. / Heavy metal homeostasis is maintained in plant cells by specialized transporters that compartmentalize or efflux metal ions, maintaining cytosolic concentrations within a narrow range. OsMTP1 and OsMTP11 are members of the CDF/MTP family of metal cation transporters in Oryza sativa, and are believed to play important roles in Zn and Mn homeostasis in rice, respectively. Functional complementation of the Arabidopsis T-DNA insertion mutant mtp1-1 demonstrates that OsMTP1 transports Zn in planta. Although OsMTP1 had been previously suggested to be targeted to the plasma membrane, results here indicate localization at the tonoplast. Heterologous expression of OsMTP1 in the yeast mutant zrc1 cot1 complemented the Zn-hypersensitivity of this mutant; OsMTP1 could also alleviate to some extent the Co sensitivity of zrc1 cot1; and rescue Fe and Cd hypersensitivity in ccc1 and ycf1 mutants, respectively, when tested at low concentrations of corresponding metals. These results suggest that OsMTP1 transports Zn but also Co, Fe and Cd, perhaps with lower affinity. Site-directed mutagenesis studies allowed us to identify two substitutions in OsMTP1, L82F and H90D, which appear to alter the transport function of OsMTP1. OsMTP1ΔL82F can still transport low levels of Zn, with enhanced affinity for Fe and Co, while OsMTP1ΔH90D completely abolishes Zn transport but improves Fe transport. In addition, we show evidence for a role of OsMTP11 in Mn transport. Heterologous expression of OsMTP11 in the yeast mutant pmr1 partially complemented the Mn-hypersensitivity of this mutant. It was identified four residues possibly involved in OsMTP11 transport function; D267H, D162A and E213G reduced the Mn-hypersensitivity rescuing capacity in different levels; and L150S fully rescued Mn-hypersensitivity in the pmr1 mutant. The results presented here are novel contributions to the field of plant mineral nutrition and may be useful in future biotechnological applications such as phytoremediation and biofortification.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5108_1.pdf: 4356374 bytes, checksum: 821d83f4d72de4ed3c01344036390c23 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / O presente trabalho estudou o efeito da deficiência em ácido ascórbico (AA) em cobaios machos adultos, durante 21 dias, sobre o peso e a histoarquitetura (histologia e histometria) do testículo e cauda do epidídimo, sobre a qualidade (número, motilidade e morfologia) dos espermatozóides e sobre os níveis plasmáticos de testosterona e a resposta secretória das células intersticiais testiculares ao estímulo gonadotrófico com hCG e ao tratamento in vitro com AA. A deficiência em AA causou diminuição de 32 % no peso corporal O peso absoluto do testículo foi reduzido em 30,5 % enquanto o seu peso relativo não foi modificado pela deficiência em AA. O peso absoluto e relativo da cauda do epidídimo diminuiram em 44,8 % e 25,2 %, respectivamente. A histoarquitetura dos dois órgãos foi alterada pela carência em AA. O parênquima do testículo apresentou alterações do epitélio germinativo dos túbulos seminíferos. A cauda do epidídimo apresentou diminuição na altura do epitélio colunar de revestimento e do número de espermatozóides na luz tubular. O número e motilidade dos espermatozóides diminuiram (73 % e 27,5 %, respectivamente), como também sua morfologia foi alterada pela deficiência em AA. Os níveis plasmáticos de testosterona foram reduzidos em 72,6 % nos animais deficientes em AA. A produção de testosterona pelas células intersticiais testiculares estimulada com uma dose elevada de hCG (10 mUI/ml) in vitro foi menor nos animais deficientes em AA. O tratamento com uma dose alta de AA (100 μM) in vitro não modificou a secreção basal de testosterona em nenhum dos grupos de animais, mas inibiu a secreção estimulada pelohCG no grupo controle, não modificando a secreção no grupo deficiente em AA. Nossos estudos confirmam prévias referências e fornecem evidências adicionais da importância do AA na manutenção da integridade estrutural e funcional do testículo e epidídimo. Os resultados também indicam que o efeito primário da deficiência em AA parece estar no testículo, reduzindo a produção de testosterona e, conseqüentemente, privando desse hormônio os órgãos da reprodução

La infertilitat és un problema que cada cop és més comú en la població actual. S’ha definit que la meitat dels casos de la infertilitat es deu a un factor masculí, no obstant, la gran majoria segueix sent d’etiologia desconeguda. Els grans objectius d’aquesta tesi es poden dividir en dos camps: (i) la cerca de factors genètics que puguin ser causa de la infertilitat masculina i (ii) la cerca de nous factors, com els RNAs i miRNAs, que puguin aclarir la patogenicitat de tipus determinats de infertilitat i el seu futur ús com a biomarcadors de la fertilitat. Vam utilitzar tres estratègies per identificar possibles gens candidats pel seu estudi mutacional: transcriptòmica diferencial, proteòmica diferencial i recerca bibliogràfica dels seus corresponents ratolins genoanul•lats. Els gens seleccionats van ser: (i) Protamina 1 (PRM1) i Protamina 2 (PRM2) (ii) Heat schock protein 2 (HSPA2) (iii) Subunitat 1 de la prohibitina (PHB1), (iv) Bromodomain testis specific (BRDT), (v) Bromodomain containing 2 (BRD2). Podem dividir els gens candidats seleccionats en dos tipus: (i) Gens candidats que la seva deleció en animals únicament comporten fallides en la fertilitat (PRM1, PRM2, HSPA2 i BRDT) i (ii) gens que els seus genoanul•lats presenten mort embrionària (PHB1 i BRD2). Els nostres resultats dels estudis mutacionals realitzats ens mostren que l’existència de variants potencialment patogèniques i d’alta penetrància són una causa infreqüent de la infertilitat masculina. Els nostres resultats van en concordança amb els resultats del primer estudi genome-wide en pacients azoospèrmics i oligozoospèrmics severs. Per tant, podem concloure que la infertilitat masculina possiblement sigui similar a la majoria de malalties complexes, degudes a un problema multigènic/multifactorial, on cap SNP sembla ser responsable d’una proporció considerable de casos d’infertilitat masculina idiopàtica. Per tant, cada variant rara que s’ha descrit pot tenir un petit efecte en el fenotip, però és el conjunt possiblement unit a l’ambient el que resulta en la infertilitat. Per tant, es necessita de més estudis en un nombre molt mes gran de individus, possiblement fent servir una estratègia de seqüenciació completa del genoma, per determinar els backgrounds genètics, possibles interaccions o efecte additiu entre variants i així començar a identificar les combinacions de factors responsables de la infertilitat masculina. Per altra banda tot i que l’avaluació dels paràmetres seminals és útil en el diagnosis de la infertilitat masculina té importants limitacions ja que no sempre bons paràmetres seminals són indicatius de un bon potencial de fertilitat. Per tant és necessari trobar marcadors addicionals que ens donin informació del potencial de fertilització de l’espermatozoide. S’ha descrit que l’espermatozoide humà madur conté RNA . Essencialment, hi ha dues hipòtesis que explicarien la presència de RNA en l’espermatozoide. Una és que podrien tenir una funció en la expressió de gens durant la embriogènesis primerenca. L’altra és que aquests RNA poden ser romanents de l’espermatogènesi però tot i aixo podrien ser útils com a marcadors de l’estat de fertilitat i per avaluar els esdeveniments passats que han ocorregut durant l’espermatogènesi. En aquest treball hem detectat en pacients astenozoospèrmics diversos RNAs amb una abundància alterada. Aquests resultats ens ofereixen la possibilitat d’aprofundir en l’ estudi dels mecanismes patogènics que poden actuar en l’astenozoospèrmia, com també en el plantejament de la futura utilització d’aquests RNAs alterats que hem detectat com a possibles futurs biomarcadors de la fertilitat, per tal d’aconseguir una millor caracterització dels pacients infèrtils. A més a més, els resultats ens mostren nous gens candidats per al seu estudi mutacional, amb la finalitat de cercar mutacions que ens puguin explicar les possibles alteracions en la seva transcripció, com en el cas de BRD2. En aquest treball també hem descrit un pool de miRNAs estables en els espermatozoides madurs de diferents mostres, el que ens fa pensar que aquests poden tenir una funció en els primers passos del desenvolupament embrionari o bé també ens poden explicar fets passats durant l’espermatogènesi. Per tant tenim tot un ampli camp a explorar per veure si alteracions en certs miRNAs poden estar associats a la infertilitat masculina. / There is some evidence that a significant proportion of idiopathic male infertility is due to recessive inheritance. Linkage analysis is applied in most hereditary diseases however are not appropriate in the case of infertility, because there are only one or few members’ affections in families studied. The alternative is performing mutational studies of candidate genes or genetic association studies using cases (infertile patients) and controls (fertile men). We had used three different strategies in order to identify candidate genes and therefore genetic factors associated with male infertility (comparative proteomics analysis, comparative transcriptomics analysis and bibliographic research of animal models infertile). We performed mutation analyses of 6 genes: PRM1, PRM2, HSPA2, PHB1, BRDT and BRD2 gene in different types of infertile patients. Our results in accordance with the first genome-wide study suggest that no pathogenic high penetrance mutations cause male infertility. The evaluation of seminal parameters is useful in the diagnosis of male infertility. However these parameters have important limitations since not always good seminal parameters are indicative of a good fertilization potential. Therefore there is a need for additional markers useful in the assessment of the sperm fertility potential. It is well known, that the mature human sperm cell contains RNA. Independently of the functions of the sperm RNA, the differences in RNA amounts between infertile patients and controls provide a means to assess the fidelity of past events of spermatogenesis. Therefore the analysis of the sperm RNA has the potential to be used as a marker to assess the fertility status. Our results identified several differential transcripts present in athenozoozospermic patients as compared to controls. These results open up the possibility to investigate the implication of these genes in the pathogenic mechanisms in asthenozoospermia and to consider their potential utility as infertility biomarkers.

Tesi realitzada al Servei de Bioquímica i Genètica Molecular / Hospital Clínic / Les alteracions cromosòmiques constitucionals representen una de les principals causes d’anomalies congènites a la població, i el seu diagnòstic durant l’etapa prenatal és el principal objectiu de la majoria de procediments invasius que es realitzen durant l’embaràs. Actualment, el cariotip convencional és el gold standard del diagnòstic citogenètic prenatal, però els avanços tecnològics dels últims anys han portat al desenvolupament de tècniques de citogenètica molecular que ofereixen característiques molt atractives, la principal de les quals és l’elevada resolució. Donat que el paper que han de tenir aquestes tècniques durant l’etapa prenatal encara no està ben definit, els objectius de la present tesi han estat: a) determinar el potencial diagnòstic i la utilitat del cariotip i les tècniques de citogenètica molecular Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) i Chromosomal Microarray-based Analysis (CMA) en diagnòstic prenatal, especialment per a l’estudi de gestacions amb troballes ecogràfiques; i b) valorar la necessitat de modificar els procediments actuals de diagnòstic citogenètic prenatal. En primer lloc, s’han revisat els resultats dels 29.883 cariotips en líquid amniòtic realitzats entre 1998 i 2009 a l’Hospital Clínic de Barcelona. Els resultats obtinguts corroboren que el cariotip és una eina efectiva i robusta per a l’obtenció del cariotip fetal, revelant alteracions cromosòmiques en el 2,9% de les gestacions que es sotmeten a un procediment invasiu. La translucidesa nucal incrementada i les anomalies ecogràfiques destaquen com a indicadors excel•lents d’anomalia cromosòmica. En segon lloc, s’ha avaluat la utilitat de l’MLPA subtelomèrica per a l’estudi de gestacions amb troballes ecogràfiques i cariotip normal. Dels 229 fetus analitzats, 3 presentaven desequilibris subtelomèrics críptics (1,3%). Donat que la freqüència d’aquests desequilibris és baixa, i a més la correlació genotip-fenotip observada és pobra, l’MLPA subtelomèrica no sembla ser una eina crucial per a l’estudi d’aquestes gestacions. D’altra banda, s’ha estudiat la idoneïtat de reemplaçar els estudis de FISH de la regió 22q11.2 per kits d’MLPA dissenyats per a l’estudi d’aquesta regió i altres regions genòmiques associades a cardiopaties. S’han analitzat mitjançant aquests kits 55 gestacions amb troballes cardíaques, cariotip normal i estudi de FISH negatiu per a la microdeleció típica de 22q11.2, i no s’ha detectat cap anomalia. Aquest fet, juntament amb que l’MLPA presenta una taxa de repetició i de no obtenció de resultats superiors a la FISH, i que generalment requereix cultiu cel•lular, indica que la FISH hauria de seguir sent la tècnica d’elecció per a l’estudi de fetus amb troballes cardíaques (enfront l’MLPA). També s’ha volgut determinar la freqüència dels diferents tipus d’alteracions cromosòmiques, tant microscòpiques com críptiques, en fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques. L’anàlisi retrospectiu dels resultats obtinguts en el període 2009-2011 a l’Hospital Clínic de Barcelona en aquest grup de gestacions (N=276) ha revelat una freqüència d’anomalies cromosòmiques microscòpiques i casos de Síndrome de la deleció cromosòmica 22q11.2 del 15,9% i 6,4%, respectivament; uns resultats que corroboren la forta associació existent entre troballes ecogràfiques cardíaques i anomalies cromosòmiques. A més, aquesta associació varia significativament en funció del tipus de troballa ecogràfica cardíaca i de la presència d’anomalies extracardíaques. D’altra banda, s’han analitzat mitjançant array CGH 51 fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques, cariotip normal, i sense estudi o resultat de FISH negatiu per a la Sd. de la deleció cromosòmica 22q11.2. En aquest grup de gestacions, la taxa de detecció de variants en número de còpia patogèniques ha estat del 2%, i no s’han detectat variants de significat clínic incert. Si en la nostra sèrie de 276 gestacions amb troballes ecogràfiques cardíaques s’hagués utilitzat l’estratègia QF-PCR + CMA enlloc de cariotip, totes les anomalies cromosòmiques amb repercussió clínica clara diagnosticades per citogenètica convencional s’haguessin identificat, s’haguessin detectat els casos de delecions de 22q11.2, i s’hagués incrementat un 2% el nombre de casos diagnosticats. Per tant, aquests resultats mostren el potencial de les plataformes de microarray per al diagnòstic prenatal de fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques. Finalment, s’han utilitzat les tècniques de citogenètica molecular FISH, MLPA i/o CMA per a la caracterització de 6 alteracions cromosòmiques visibles al cariotip però de difícil caracterització per citogenètica convencional. En tots els casos, la utilització d’aquestes tècniques ha contribuït a la correcte descripció de l’alteració identificada, posant de manifest la seva utilitat quan s’utilitzen de forma complementària al cariotip. L’elaboració d’aquesta tesi i la literatura recentment publicada evidencien la necessitat d’un nou plantejament dels protocols clínics de diagnòstic citogenètic prenatal, especialment en relació a la utilització de plataformes de microarray en diagnòstic prenatal. / Strategies for genetic diagnosis of fetuses with congenital malformations. Genotype-phenotype correlations. Constitutional chromosomal abnormalities represent one of the main causes of congenital abnormalities in the population, and their diagnosis during pregnancy is the main objective of most invasive procedures. Nowadays, conventional karyotyping is the gold standard for prenatal cytogenetic diagnosis, but recent technological advances have led to the development of molecular cytogenetic techniques which offer much higher resolution. Since there is still not a consensus on the role of these techniques in prenatal diagnosis, the goals of the present PhD work have been: a) to determine the diagnostic potential and usefulness of karyotype and molecular cytogenetic techniques Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) and Chromosomal Microarray-based Analysis (CMA) in prenatal diagnosis, especially in pregnancies with ultrasound findings; and b) to establish the need for modifications in current prenatal cytogenetic diagnostic protocols. The results obtained: - Corroborate the effectiveness and robustness of conventional karyotyping. The observed detection rate of chromosomal abnormalities in 29,883 consecutive amniotic fluid samples has been 2.9%, with increased nuchal translucency and ultrasound abnormalities being excellent indicators for chromosomal abnormalities. - Suggest that subtelomeric screening in pregnancies with ultrasound findings and normal karyotype is not a crucial tool, as detection rate of subtelomeric imbalances is low (1.3%; 3/229), and genotype-phenotype correlations are poor. - Reveal that FISH of 22q11.2 region is preferred to MLPA kits specific for this chromosome region and other genomic regions previously associated with congenital heart defects. - Reveal a strong association between cardiac ultrasound findings and chromosomal abnormalities, both microscopic and cryptic. In pregnancies with cardiac findings, the observed frequency of microscopic chromosomal abnormalities and chromosome 22q11.2 deletion syndrome has been 15.9% (44/276) and 6.4% (5/78), respectively. Moreover, CMA has been performed in 51 fetuses with cardiac ultrasound findings, normal karyotype and negative or no FISH study for chromosome 22q11.2 deletion syndrome, and the detection rate of pathogenic copy number variants has been 2%, without detection of variants of unknown clinical significance. If in the initial series of 276 pregnancies the strategy QF-PCR + CMA would have been applied; all the chromosomal abnormalities with clear clinical repercussion diagnosed by conventional cytogenetics would have been identified, together with the deletions of 22q11.2 region and an extra 2% of chromosomal abnormalities. These results show the potential of CMA for the prenatal diagnosis of these pregnancies. - Show the usefulness of the molecular cytogenetic techniques FISH, MLPA and CMA when used as a complement to conventional karyotyping in cases with chromosomal abnormalities not accurately characterizable by conventional cytogenetics. Accordingly, the results obtained suggest the need for updating current prenatal cytogenetic diagnostic protocols.

Tesi realitzada a la Unitat de Biofísica i Bioenginyeria - Facultat de Medicina / INTRODUCTION The pressure to contain health costs, particularly by avoiding hospitalizations and promoting the early discharge of patients, is generating a greater demand for home healthcare at a time when this resource is rapidly becoming less available. Telemedicine has been defined as the use of information and communications technologies (ICT), to deliver health services and transmit health information at distance for the purpose of improving patient’s care and education and to facilitate communication between patients and healthcare professionals. Most of the studies on telemedicine showed a lot of potentialities and possibilities, but did not develop further in the clinical routine because of problems and difficulties involving the use of this technology. Therefore, it seems clear the need of simple and straightforward applications, which can provide useful and widely applicable services to healthcare and as well as reliable data to assess the actual impact of telemedicine on homecare. 2) GENERAL AIM To design, develop, validate and assess the benefit of new Information and Communication Technology (ICT) applications in healthcare at patient’s home. 3) HYPOTHESES 1. An Internet-based support system for monitoring newborn patients after discharge from nursery would improve care, be well accepted by parents and reduce unplanned healthcare, particularly visits to the emergency department; 2. The development of a specific web-based tool could introduce a new strategy for the continuous positive airway pressure (CPAP) therapy follow-up of patients with obstructive sleep apnea syndrome (OSAS), which could improve the CPAP compliance, reduce face-to-face clinical visits, and be more cost-effective; 3. A new telemedicine system for remote CPAP therapy monitoring could provide valuable and useful data about treatment compliance and efficacy for the follow-up of OSAS patients. 4) STUDY 1 - A new Internet-based monitoring tool for the neonatal home care after discharge was successfully developed; - This new monitoring approach resulted in a high level of parental satisfaction with the service; - Using a societal perspective, the cost of the Internet-based follow-up resulted much lower than that of the conventional hospital-based follow-up. Additionally, ED visits in the first month of patients’ life decreased with the use of the Internet-based monitoring system. This telemedicine follow-up strategy proved absolute dominance (both more clinically effective and less costly) over the standard follow-up based on hospital visits; - This Internet-based tool has been effectively transferred to the health system since it is in routine clinical use at the Hospital de Sant Pau in Barcelona (www.petitsacasa.santpau.cat). 5) STUDY 2 - The opinion of the interviewed patients and medical staff about the helpfulness and satisfaction of the telemedicine monitoring approach indicated that the web-based support tool together with the televisit are potentially useful to support the home follow-up of CPAP treatment in OSAS patients; - The high patients’ compliance to the remote monitoring through the online questionnaire suggested this strategy to be helpful and practical for the long-period CPAP therapy control; - The multicenter support system we developed represents a new telemedicine approach to CPAP therapy follow-up for OSAS patients, which seeks enforcing patients’ confidence and improving therapy adherence; - The developed telemedicine support system has been effectively transferred to the health system since it is in use in a multinational clinical trial currently involving 18 hospitals (www.mi-cpap.com). 6) STUDY 3 - The geometry of the telemonitoring device (NOWAPI) does not influence the CPAP treatment; - NOWAPI showed good compatibility with the CPAP machines and an excellent performance in estimating the duration of the CPAP treatment and in detecting residual respiratory events in simulated OSAS patients. The results of this study demonstrated that NOWAPI system could be a valuable tool for telemonitoring the treatment of obstructive sleep apnea;

En aquesta tesi s'ha estudiat l'efecte de l'activació del canal de potassi dependent de ATP (KATP) amb un fàrmac activador, la diazoxida, sobre el perfil fenotípic de la microglia en dos models diferenciats: un de in vitro amb una línia cel•lular i un de in vivo en un model de lesió excitotòxica a l'hipocamp de la rata. També s'ha estudiat com aquesta modulació afecta a la progressió de la lesió excitotòxica i la neurogènesis que porta associada. Finalment, s'ha descrit la presència del canal de calci dependent de voltatge (VGCC) a microglia i com la seva inhibició també regula la activitat microglial in vivo i in vitro. / In this thesis we have studied the effect of the activation of the potassium channetl ATP-dependent (KATP channel) with the drug diazoxida, a KCO (potassium channel opener), over the phenotypic expression profile of microglial cells. We did it with two different approaches: an in vitro model with the murine cell line BV2; and an in vivo model of excitotòxic lesion in rat hippocampus. We have also studied how this modulation affects the progression of the damage of the excitotòxic lesion and the hipocampal neurogènesis associated. Finally, we have described the presence of voltage-gated calcium channels (VGCC) in microglia and how its regulation also affects to the activity of microglia in vivo and in vitro.