La génétique des populations a révélé que la diversité génétique des espèces marines était très souvent distribuée de façon discrète dans l’espace, en mosaïque de patchs populationnels génétiquement homogènes délimités par des discontinuités appelées barrière au flux génique. L’objectif de cette thèse était de contribuer à mieux comprendre les processus expliquant l’origine, le maintien et la position des barrières génétiques au niveau de la zone de transition entre l’Atlantique et la Méditerranée. Dans un premier temps a été étudiée la structure génétique de la moule Mytilus galloprovincialis. Contrairement au cline abrupt et étroit reporté en Espagne, nous avons découvert en Algérie une vaste zone hybride mosaïque sur 600 km de côtes à l'Est du front océanique Almeria-Oran. Dans un deuxième temps a été menée une étude de la structure génétique du gastéropode marin Stramonita haemastoma. Nous avons découvert deux lignées cryptiques différentiellement fixées pour des haplogroupes mitochondriaux, et différenciées sur 3 marqueurs microsatellites développés dans cette thèse. La distribution spatiale en mosaïque est étonnante avec un patch de la lignée atlantique enclavé au nord de la Méditerranée occidentale et bordé par une zone hybride au sud dans la région de Valence. Ces deux études mettent en avant l’importance de l’isolement reproductif intrinsèque dans l’explication de la distribution mosaïque de la diversité génétique marine. Bien que les frontières entre patchs correspondent à des barrières physiques à la dispersion ou à des écotones, l’hydrographie et l’environnement n’expliquent sans doute que la position des discontinuités génétiques mais ni leur origine ni leur maintien. / Population genetics has revealed the genetic diversity of marine species is often subdivided into a mosaic of discrete patches, within which populations are genetically homogeneous, delineated by discontinuities called barriers to gene flow. The aim of this thesis was to contribute to better understand the processes explaining the origin, maintenance and location of genetic barriers at the Atlantic/Mediterranean transition zone. First, we studied the genetic structure of the mussel Mytilus galloprovincialis. In contrast to the abrupt narrow cline reported in Spain, we discovered along the Algerian coastline a 600 km wide mosaic hybrid zone eastward of the Almeria-Oran oceanic front. Second, we studied the genetic structure of a marine gastropod Stramonita haemastoma. We discovered two cryptic lineages differentially fixed for alternative mitochondrial haplogroups, and differentiated at three microsatellite markers developed in this PhD work. Surprisingly, the spatial distribution proved to be an unusual mosaic with a patch of the Atlantic lineage enclaved in the north of the Western Mediterranean Sea, bordered in the South by a hybrid zone in eastern Spain around Valencia. These two studies highlight the importance of intrinsic reproductive isolation in explaining the mosaic distribution of the marine genetic diversity. Although boundaries between patches coincide with physical barriers to dispersal or ecotones, hydrography and environment mainly explain the position of the genetic discontinuities but neither their origin nor their maintenance.

La transplantation d’hépatocytes est un procédé séduisant pour remplacer les cellules déficientes dans un foie anatomiquement normal. Dans les maladies métaboliques héréditaires hépatiques (MMHH), la thérapie cellulaire présente un potentiel espoir thérapeutique. Le remplacement d'un pourcentage restreint (5-10%) d’hépatocytes déficients par des hépatocytes normaux pourrait rétablir durablement la fonction métabolique. Les résultats des essais cliniques de transplantation d'hépatocytes génétiquement modifiés ou non sont moins concluants, montrent une prise de greffe insuffisante et, dans la plupart des études, un effet thérapeutique transitoire. L’efficacité limitée de la transplantation d’hépatocytes isolés dans le traitement des MMHH semble en partie liée au faible pourcentage de la masse hépatocytaire reconstituée par les hépatocytes définitivement greffés et fonctionnels. De nombreux modèles animaux ont été développés pour étudier les facteurs pouvant augmenter le nombre et le pourcentage d’hépatocytes transplantés et greffés. Cependant, la majorité de ces modèles ne sont pas transposables en clinique car ils présentent des risques importants ou mal évalués pour les patients. Les principaux objectifs de ce travail ont été d’étudier des moyens peu invasifs pour induire une régénération hépatique et une prise de greffe hépatocytaire significatives dans le but de développer une nouvelle approche de transplantation d’hépatocytes génétiquement modifiés ex vivo pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale. L’effet d’une embolisation portale partielle (EPP) réversible sur la prolifération hépatocytaire et la régénération hépatique a été évalué chez le macaque. A la différence de l’EPP par un produit non résorbable, il ne s’agit pas d’une approche potentiellement délétère à long terme. Une obstruction veineuse plus complète a été provoquée en utilisant le Curaspon®, une gélatine biodégradable, en forme de poudre. Nous avons démontré pour la première fois dans la littérature l’efficacité d’une EPP réversible à induire une importante prolifération hépatocytaire et régénération hépatique. Nos données suggèrent qu’une occlusion portale initiale et temporaire est suffisante pour déclencher les mécanismes responsables d’une régénération hépatique dans le foie non-embolisé. L’utilisation du Curaspon® en poudre peut être considérée comme la forme la plus évoluée d’EPP : très distale, résorbable, qui dure suffisamment pour induire l’hypertrophie hépatique. Cette technique pourrait être indiquée dans des situations cliniques nécessitant une régénération hépatique de courte durée (ex. le traitement des cancers du foie en plusieurs étapes) ou dans des cas qui ne nécessitent pas une résection hépatique, comme la transplantation d’hépatocytes pour le traitement de MMHH. Ces résultats nous ont permis d’évaluer cette approche dans notre protocole préclinique de thérapie génique pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale chez le primate, par autotransplantation d’hépatocytes génétiquement modifiés ex vivo par un vecteur lentiviral. Nous avons démontré que l’EPP réversible induit une régénération hépatique du foie non-embolisé et améliore notablement les résultats de la transplantation d’hépatocytes isolés génétiquement modifiés exprimant la GFP. Seize semaines après la transplantation, les hépatocytes transduits et greffés exprimaient le transgène contrôlé par le promoteur apo-AII humain. Notre protocole a montré pour la première fois chez un gros animal que l’EPP par un produit résorbable entraine avec des conditions de sécurité optimales une repopulation hépatique importante par des hépatocytes transduits par un vecteur lentiviral, et ceci même à distance de la transplantation hépatocytaire. Les résultats encourageants de ces travaux nous ont ouvert la voie pour avancer sur notre projet préclinique et envisager la réalisation d’une étude clinique de phase I/II pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale. / Hepatocyte transplantation is an attractive process for replacing deficient cells in an anatomically normal liver. In metabolic liver diseases, cell therapy could be an interesting alternative to orthotopic liver transplantation. The replacement of a small percentage (5-10%) of deficient hepatocytes by normal hepatocytes could restore the metabolic defect at a long term. Data from clinical studies of hepatocyte autotransplantation or allotransplantation, genetically modified or not, provided poor results, insufficient cell engraftment in the liver parenchyma and, in the majority of cases, a transient therapeutic effect. The limited efficacy of hepatocyte transplantation in metabolic liver diseases is mainly due to the poor percentage of engrafted and finally functional hepatocytes. Numerous animal models have been developed in order to study the factors that could increase the number and the percentage of transplanted and engrafted hepatocytes. However, the majority of these models cannot be used in patients since they present important risks for them. The aim of this work was to evaluate less invasive procedures for inducing liver regeneration and significant hepatocyte engraftment in order to develop a new approach of transplantation of ex vivo genetically modified hepatocytes for the treatment of familial hypercholesterolemia. The effect of reversible portal vein embolization (PVE) on liver regeneration and hepatocyte proleferation was evaluated in monkeys. In contrast to PVE by a permanent embolizing agent, reversible PVE has not a long term deleterious effect on embolized liver. A more complete venous occlusion was obtained by using the powdered form of an absorbable gelatin sponge (Curaspon®). We showed for the first time in the literature the safe and successful use of reversible PVE for inducing significant hepatocyte proliferation and liver regeneration. Our data support that an initial occlusion of the portal branch, even if not permanent, is sufficient to start the mechanisms of liver regeneration in the contralateral lobe. Embolization with Curaspon® powder could be considered to be the ultimate form of embolization: very distal, reversible and lasting sufficiently in order to induce substantial liver hypertrophy. Our findings suggest that this method could reliably be used for clinical purposes, particularly in situations in which short-term regeneration is required (i.e. multi-step management of hepatic malignancies) or in cases where resection of the liver is not finally necessary, such as in hepatocyte transplantation for the treatment of metabolic liver diseases. These promising results on reversible PVE allowed us to evaluate this approach in our preclinical study of gene therapy for the treatment of familial hypercholesterolemia in macaques. Our protocol consisted of an autotransplantation of ex vivo genetically modified hepatocytes by a lentiviral vector. We showed that reversible PVE induces liver regeneration of the non-embolized liver segments and improves considerably hepatocyte transplantation of genetically modified cells expressing Green Fluorescent Protein (GFP). Sixteen weeks after transplantation, transduced engrafted hepatocytes expressed the transgene, which was under control of the human apo-AII promoter. Our protocol showed for the first time in a big animal that PVE by an absorbable agent leads safely to an important and long-term repopulation of the liver by lentivirally transduced hepatocytes. The extremely encouraging results of this work opened our way advancing in our preclinical study and preparing a phase I/II clinical trial for the treatment of familial hypercholesterolemia based on our protocol of autotransplantation of ex vivo genetically modified hepatocytes by a lentiviral vector.

De par leurs propriétés d’autorenouvellement et de multipotentialité, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) présentent un intérêt médical majeur et sont au cœur de nombreuses thérapies génique et cellulaire. Cependant, leur utilisation en clinique est encore limitée par leur rareté, leur hétérogénéité fonctionnelle, et leur perte durant l’étape de manipulation in vitro qui précède la transplantation.Dans ce contexte, nous avons mis au point une stratégie de marquage cellulaire par des codes-barres moléculaires afin d’évaluer simultanément et quantitativement les capacités de repopulation des CSH in vivo. Cette stratégie nous a permis de cribler 1200 composés chimiques afin d’identifier des molécules capables (1) d’améliorer l’efficacité de transduction des CSH par un vecteur lentiviral, (2) de maintenir voire d’expandre, lors de l’étape de culture in vitro, les CSH capables de repopulation à long terme. Plusieurs molécules candidates sont en cours de validation.Par ailleurs, grâce au marquage par des codes-barres, nous avons révélé l’hétérogénéité des CSH en comparant leur capacité d’autorenouvellement, la taille de la descendance qu’elles génèrent et leur capacité de différenciation. Notre technique nous a permis non seulement de confirmer l’existence de CSH biaisées vers le lignage myéloïde ou vers le lignage lymphoïde, mais aussi de quantifier leur fréquence.L’application de cette stratégie à un autre système cellulaire nous a permis d’étudier l’influence de facteurs environnementaux et génétiques sur la croissance cellulaire de populations exprimant différentiellement l’-synucléine, une protéine impliquée dans la maladie de Parkinson et certains cancers. / Considerable hope is placed on the use of hematopoietic stem cells (HSC) in engineered gene- and cell- based therapy protocols. Their clinical utilization is, however to some extent, limited by their scarce representation, their heterogeneity and their loss during the ex vivo manipulation procedure. Within this context, we developed a barcode tagging strategy to simultaneously evaluate in vivo the repopulating capacity of HSC cultured in vitro. Barcode deconvolution demonstrated that our strategy constitute a powerful tool for tracking HSC quantitatively even using several dozens of different conditions. Using this strategy, we screened 1200 chemical compounds in order to identify molecules acting (1) on HSC transduction efficiency using a lentiviral vector, (2) on maintenance or even amplification during the in vitro culture step of long-term repopulating HSC. Several candidate molecules are currently under validation. In addition, using this barcoding strategy, we reveal heterogeneous behaviour of HSC examining their proliferation capacity, self-renewal ability and their differentiation lineage option. Our technique allowed us not only to confirm the occurrence of myeloid- and lymphoid-biased HSC, but also to quantify their frequency.We apply this strategy to another cell system to address the effect of different genetic and environmental factors on proliferation of cells expressing -synuclein, a protein involved in Parkinson disease and some cancers.

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont régulées par des récepteurs activateurs et inhibiteurs. La plupart des récepteurs inhibiteurs reconnaisse des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I, et protège les cellules saines des phénomènes d'auto-immunité médiés par les cellules NK. Cependant, certains récepteurs activateurs, incluant le récepteur killer cell Ig-like receptor (KIR) 2DS1, reconnaissent aussi des ligands CMH de classe I. Cela pose la question de savoir comment les cellules NK qui expriment des récepteurs activateurs deviennent tolérantes au soi. Nous avons cherché à déterminer si la présence de HLA-C2, le ligand du récepteurs 2DS1, peut induire les cellules NK qui expriment le 2DS1 à développer un état de tolérance au soi. Indépendamment de la présence ou de l'absence du ligand HLA-C2 dans le donneur, une activité anti-HLA-C2 a été identifiée in vitro dans certains clones NK 2DS1-positifs. La fréquence des clones NK avec réactivité anti-HLA-C2 était élevée parmi les donneurs homozygotes pour HLA-C1. De façon étonnante, nous n'avons pas constaté de différence statistiquement significative dans la fréquence de cytotoxicité anti-HLA-C2 entre les donneurs HLA-C2 hétérozygotes et les donneurs sans ligand HLA-C2. Par contre, les donneurs HLA-C2 homozygotes montrent une fréquence réduite de clones NK avec réactivité anti-HLA-C2 par rapport aux autres donneurs. Clones 2DS1-positifs qui co-expriment des KIR inhibiteurs spécifiques des molécules HLA de classe I du soi n’étaient pas communément cytotoxiques, et la cytotoxicité anti-HLA-C2 était limité presque exclusivement à des clones positifs seulement pour 2DS1 (« single positive » 2DS1 clones). Nous avons aussi identifié des clones 2DS1 « single positive » avec réactivité anti-HLA-C2 dans des patients recevant une greffe de cellules souches hématopoïétiques à partir de donneurs 2DS1. Ces résultats montrent que plusieurs cellules NK avec réactivité anti-HLA-C2 sont présentes dans des donneurs 2DS1 soit hétérozygotes soit homozygotes pour HLA-C1. En revanche, les clones 2DS1-positifs obtenus par des donneurs homozygotes pour HLA-C2 sont fréquemment tolérants aux antigènes HLA-C2. / NK cells are regulated by inhibiting and activating cell surface receptors. Most inhibitory receptors recognize MHC-class I antigens, and protect healthy cells from NK cell-mediated auto-aggression. However, certain activating receptors, including the human killer cell Ig-like receptor (KIR) 2DS1, also recognize MHC-class I. This raises the question of how NK cells expressing such activating receptors are tolerized to host tissues. We investigated whether the presence of HLA-C2, the cognate ligand for 2DS1, induces tolerance in 2DS1-expressing NK cells. Anti-HLA-C2 activity could be detected in vitro in some 2DS1 positive NK clones irrespective of presence or absence of HLA-C2 ligand in the donor. The frequency of anti-HLA-C2 reactivity was high in donors homozygous for HLA-C1. Surprisingly, there was no significant difference in frequency of anti-HLA-C2 cytotoxicity in donors heterozygous for HLA-C2 and donors without HLA-C2 ligand. However, donors homozygous for HLA-C2 had significantly reduced frequency of anti-HLA-C2 reactive clones as compared to all other donors. 2DS1 positive clones that express inhibitory KIR for self-HLA class I were commonly non-cytotoxic, and anti-HLA-C2 cytotoxicity was nearly exclusively restricted to 2DS1 single positive clones lacking inhibitory KIR. 2DS1 single positive NK clones with anti-HLA-C2 reactivity were also present post-transplantation in HLA-C2 positive recipients of hematopoietic stem cell transplants from 2DS1 positive donors. These results demonstrate that many NK cells with anti-HLA-C2 reactivity are present in HLA-C1 homozygous and heterozygous donors with 2DS1. In contrast, 2DS1 positive clones from HLA-C2 homozygous donors are frequently tolerant to HLA-C2.

Comprendre les déterminants du taux d’adaptation est une question primordiale en évolution moléculaire. En particulier, l’influence de la taille efficace de population sur la sélection positive, ainsi que la nature des changements d’acides aminés qui mènent à de l’adaptation sont des questions encore débattues. Pour y répondre, la méthode DFE-α, dérivée du test fondateur de McDonald & Kreitman, est un outil puissant pour mesurer le taux de substitution adaptatif. Elle est néanmoins sensible à certains biais. Au cours de cette thèse, nous avons identifié deux biais majeurs de cette méthode, les fluctuations de long-terme du régime de sélection-dérive via des fluctuations démographiques, et la conversion génique biaisée vers GC (gBGC). Via des simulations, nous avons montré que divers scénarios plausibles de fluctuations démographiques peuvent mener à une sur-estimation du taux de substitution adaptatif. Nous avons aussi obtenu des indications empiriques que le régime de sélection-dérive récent ne reflète pas le régime de sélection-dérive de long-terme chez diverses espèces animales, ce qui représente une violation d’une hypothèse forte de la méthode DFE-α. D’autre part, nous avons montré que la gBGC entraîne une sur-estimation du taux de substitution adaptatif chez les primates et les oiseaux. Via un jeu de données de neuf taxons de métazoaires et un total de 40 espèces, nous avons d’une part initié une analyse visant à identifier la nature des changements d’acides aminés qui mènent à l’adaptation, et montré que les changements radicaux sont soumis à une plus forte sélection purificatrice que les changements conservatifs. D’autre part, nous avons pu évaluer le lien entre la taille efficace et le taux de substitution adaptatif tout en prenant en compte les deux sources de biais explorées précédemment. Nous avons mis en évidence pour la première fois une relation négative entre le taux de substitution adaptatif et des traits d’histoire de vie représentatifs de la taille de population de long-terme. Ce résultat va à l’encontre de l’hypothèse canonique d’une adaptation plus efficace en grandes populations. / Understanding the determinants of the adaptive substitution rate is a central question inmolecular evolution. In particular, the influence of the effective population size N e on positiveselection as well as the nature of amino acid changes that lead to adaptation are still debated. TheDFE-α method, which was derived from the seminal McDonald & Kreitman test, is a powerful toolfor estimating the adaptive substitution rate. However, it is sensitive to various sources of bias. Inthis thesis, we identified two major sources of bias of this test, long-term fluctuations of theselective-drift regime through demographic fluctuations, and GC-biased gene conversion (gBGC).Using simulations, we showed that under plausible scenarios of fluctuating demography, the DFE-αmethod can lead to a severe over-estimation of the adaptive substitution rate. We also showed thatpolymorphism data reflect a transient selective-drift regime which is unlikely to correspond to theaverage regime experienced by genes and genomes during the long-term divergence betweenspecies. This violates an important assumption of the DFE-α method. Our results also indicate thatgBGC leads to an over-estimation of the adaptive substitution rate in primates and birds. Using adataset of nine metazoan taxa for a total of 40 species, we started an analysis aiming at identifyingthe type of amino acid changes that are more prone to adaptation, and evaluated the link between N eand the adaptive substitution rate while accounting for the two sources of bias previously explored.We reveal for the first time a negative relationship between the adaptive substitution rate and life-history traits representative of long-term N e . This result is in contradiction with the widespreadhypothesis that adaptation is more efficient in large populations.

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Le glioblastome (GBM) est la tumeur primitive du cerveau la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. Le mauvais pronostic de cette pathologie peut être expliqué par la présence de cellules résistantes aux traitements à l’origine des rechutes appelées cellules souches de glioblastome (CSG). Caractérisées par une plasticité cellulaire, elles sont capables de s’adapter aux environnements défavorables à leur survie. Ainsi, malgré des traitements multimodaux agressifs, les bénéfices de la prise en charge du GBM restent très modestes ; il est donc nécessaire de mieux caractériser ces cellules afin de développer de nouvelles thérapies ciblant les CSG. Le rôle des mécanismes post-transcriptionnels de régulation de l’expression génique dans le maintien des cellules souches cancéreuses a été démontré dans différentes tumeurs. Cependant, peu de protéines de liaison à l'ARN (RBP), régulateurs clés de ces événements, ont été identifiés dans le contexte des CSG. Mon projet de thèse s’inscrit dans le cadre de l’étude de RBP régulant les propriétés d’auto-renouvèlement et de survie des CSG afin d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes moléculaires qui contribuent à la formation ou récurrence des GBM. Dans un premier temps, j’ai cherché à définir un protocole permettant d’enrichir la population de CSG maintenues en conditions de culture non-adhérentes qui favorisent la formation de neurosphères et le maintien d’une hiérarchie cellulaire. Confrontée à une forte hétérogénéité de signatures moléculaires, j’ai choisi de prendre cette caractéristique en compte dans un second temps en menant une étude comparative du transcriptome de 5 modèles de cellules souches de glioblastome provenant de patients différents. Cette analyse inclut également des cellules différenciées in vitro à partir des CSG ainsi que des cellules souches neurales humaines. Grâce à une approche de séquençage de leur transcriptome, mes travaux de thèse ont permis d’identifier une famille de régulateurs post-transcriptionnels enrichis dans les CSG, les protéines nELAVL. Ces résultats ont pu être confirmés par l’analyse de leur expression protéique dans des modèles in vitro et dans des coupes de tumeurs provenant de différents patients atteints de GBM. Une co-expression des protéines nELAVL avec OLIG2 ou SOX2 a été observée confirmant ainsi leur association avec l’état souche. ELAVL4 correspond au membre de la famille nELAVL le plus réprimé lors de la différenciation des CSG. Des outils de modulation de son expression ont été développé en vue d’évaluer son rôle dans les CSG par des approches de perte d’expression ou de gain de fonction / Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive primary adult brain tumor. GBM dismal prognosis can be explained by the presence of treatment resistant cells responsible for tumor relapse known as glioblastoma stem cells (GSC). Characterized by cellular plasticity, they are able to adapt to hostile environments. Thus, despite aggressive multimodal treatments, GBM curative therapies have provided only a modest benefit; it is therefore necessary to better characterize these cells in order to develop new GSC targeted therapies. The role of posttranscriptional mechanisms of gene expression regulation in the maintenance of cancer stem cells has been demonstrated in different tumors. However, few RNA-binding proteins (RBPs), key regulators of these events, have been identified in GSC. My thesis project consists in identifying RBP that are critical for self-renewal and increased survival properties of GSC. The aim of this study is to deepen our knowledge of the underlying molecular mechanisms of GBM development or recurrence. At first, I established a protocol to enrich for GSC using nonadherent culture conditions that promote the formation of neurospheres comprising a cellular hierarchy. I chose to take into account the facing problem of GSC molecular heterogeneity in a second step and carried out a comparative study of the transcriptome of 5 glioblastoma stem cell cultures from different patients. This analysis also includes in vitro differentiated cells originating from GSC as well as human neural stem cells. Using a transcriptome sequencing approach, my thesis work has led to the identification of a family of post-transcriptional regulators enriched in GSC, nELAVL proteins. These results were confirmed by protein expression analysis in in vitro neurospheres and within tumor sections from different GBM patients. Co-expression of nELAVL proteins with OLIG2 or SOX2 was observed thus confirming their association with stemness. ELAVL4 repesents the most differentially expressed member of nELAVL family upon GSC differentiation. Knock-down and gain-offunction tools targeting ELAVL4 have been developed to further assess its roles in GSC maintenance

Ce mémoire analyse l’espérance du temps de fixation conditionnellement à ce qu’elle se produise et la probabilité de fixation d’un nouvel allèle mutant dans des populations soumises à différents phénomènes biologiques en uti- lisant l’approche des processus ancestraux. Tout d’abord, l’article de Tajima (1990) est analysé et les différentes preuves y étant manquantes ou incomplètes sont détaillées, dans le but de se familiariser avec les calculs du temps de fixa- tion. L’étude de cet article permet aussi de démontrer l’importance du temps de fixation sur certains phénomènes biologiques. Par la suite, l’effet de la sé- lection naturelle est introduit au modèle. L’article de Mano (2009) cite un ré- sultat intéressant quant à l’espérance du temps de fixation conditionnellement à ce que celle-ci survienne qui utilise une approximation par un processus de diffusion. Une nouvelle méthode utilisant le processus ancestral est présentée afin d’arriver à une bonne approximation de ce résultat. Des simulations sont faites afin de vérifier l’exactitude de la nouvelle approche. Finalement, un mo- dèle soumis à la conversion génique est analysé, puisque ce phénomène, en présence de biais, a un effet similaire à celui de la sélection. Nous obtenons finalement un résultat analytique pour la probabilité de fixation d’un nouveau mutant dans la population. Enfin, des simulations sont faites afin de détermi- nerlaprobabilitédefixationainsiqueletempsdefixationconditionnellorsque les taux sont trop grands pour pouvoir les calculer analytiquement. / The expected time for fixation given its occurrence, and the probability of fixa- tion of a new mutant allele in populations subject to various biological phe- nomena are analyzed using the approach of the ancestral process. First, the paper of Tajima (1990) is analyzed, and the missing or incomplete proofs are fully worked out in this Master thesis in order to familiarize ourselves with calculations of fixation times. Our study of Tajima’s paper helps to show the importance of the fixation time in some biological phenomena. Thereafter, we extend the work of Tajima (1990) by introducing the effect of natural selec- tion in the model. Using a diffusion approximation, the work of Mano (2009) provides an interesting result about the expected time of fixation given its oc- currence. We derived an alternative method that uses an ancestral process that approximates well Mani’s result. Simulations are made to verify the accuracy ofthenewapproach.Finally,onemodelsubjecttogeneconversionisanalyzed, since this phenomenon, in the presence of bias, has a similar effect as selection. We deduce an analytical result for the probability of fixation of a new mutant in the population. Finally, simulations are made to determine the probability of fixation and the time of fixation given its occurrence when rates are too large to be calculated analytically.

Les MAP kinases sont des enzymes essentielles impliquées dans 7 voies de signalisation distinctes qui permettent à la cellule de répondre de manière adéquate aux stimuli extra-cellulaires. Chez les mammifères, les MAP kinases les mieux caractérisées sont Erk1/2, Jnk, p38 et Erk5. Ces enzymes jouent un rôle important dans l’embryogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire ainsi que dans la réponse au stress. Erk4 est un membre atypique de la famille MAP kinase. D’une part, la boucle d’activation de Erk4 possède un motif SEG au lieu du motif TXY, très conservé chez les MAP kinases. D’autre part, Erk4 possède une extension en C-terminal du domaine kinase qui n’est pas présente chez les MAP kinases classiques. Jusqu’à présent aucune fonction n’a été attribuée à Erk4. De plus, la voie de signalisation ainsi que le mode de régulation conduisant à l’activation de Erk4 ne sont pas connus. Le seul substrat de Erk4 identifié jusqu’à maintenant est la MAPKAP kinase MK5. L’impact fonctionnel de cette interaction n’est également pas connu. Afin d’en apprendre davantage sur la MAP kinase atypique Erk4, nous avons étudié le mécanisme d’activation de cette kinase ainsi que sa fonction physiologique par une approche de délétion génique chez la souris. En ce qui concerne l’activation de Erk4, nous avons montré que la boucle d’activation de Erk4 (S186EG) est constitutivement phosphorylée in vivo et que cette phosphorylation n’est pas modulée par les stimuli classiques des MAP kinases dont le sérum et le sorbitol. Cependant, nous avons observé que la phosphorylation de la S186 augmente en présence de MK5 et que cette augmentation est indépendante de l’activité kinase de l’une ou l’autre de ces kinases. De plus, nous avons établi que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 est requise pour l’interaction stable entre Erk4 et MK5 ainsi que pour l’activation, et la relocalisation cytoplasmique de MK5. Ainsi, notre étude a permis de révéler que Erk4 est régulée de manière différente des MAP kinases classiques et que la phosphorylation de la boucle d’activation de Erk4 joue un rôle essentiel dans la régulation de l’activité de MK5. Parallèlement, nos résultats mettent en évidence l’existence d’une “Erk4 kinase”, dont le recrutement et/ou l’activation semble être facilité par MK5. Afin identifier la fonction physiologique de Erk4, nous avons généré des souris Erk4-déficientes. L’inactivation génique de Erk4 est viable et les souris ne présentent aucune anomalie apparente. Dans le but d’expliquer l’absence de phénotype, nous avons regardé si l’expression de Erk3, le paralogue de Erk4, pouvait compenser la perte de Erk4. Notre analyse a révélé que l’expression de Erk3 dans les souris Erk4-/- n’augmente pas au cours du développement embryonnaire ou dans les tissus adultes afin de compenser pour la perte de Erk4. Par la suite, nous avons adressé la question de redondance entre Erk4 et Erk3. Dans notre laboratoire, les souris Erk3-déficientes ont également été générées et le phénotype de ces souris a récemment été analysé. Cette étude a révélé que l’inactivation génique de Erk3 entraîne un retard de croissance intra-utérin, un défaut de maturation pulmonaire et la mort néo-natale des souriceaux. Nous avons donc regardé la contribution de Erk4 dans ces phénotypes. L’analyse des souris Erk4-/- a révélé que l’inactivation de Erk4 n’entraîne pas de retard de croissance ou de maturation du poumon. De plus, nous avons montré que l’inactivation additionnelle de Erk4 dans les souris Erk3-/- n’accentue pas le phénotype des souris Erk3-déficientes. Ainsi, notre étude a révélé que contrairement à Erk3, Erk4 n’est pas essentielle au développement murin dans des conditions physiologiques. Parallèlement, nous avons montré que Erk4 et Erk3 possèdent des fonctions non-redondantes in vivo. / MAP kinases are essential enzymes implicated in 7 distinct signaling pathways that allow cells to respond appropriately to extracellular stimuli. In mammals, Erk1/2, Jnk, p38 and Erk5 are the best characterized MAP kinases. These enzymes play important roles in embryogenesis, cell proliferation and differentiation and in response to cellular stresses. Erk4 is an atypical member of the MAP kinase family. First, its activation loop is composed of an SEG motif instead of the well conserved TXY motif found in MAP kinases. Second, Erk4 has a C-terminal extension following the kinase domain that is not present in classical MAP kinases. Despite its identification more than a decade ago, the function of Erk4 remains elusive. Moreover, the signaling pathway as well as the regulatory mechanism leading to Erk4 activation in still uncharacterized. The only identified substrate of Erk4 is the MAPKAP kinase MK5, but the functional relevance of this interaction is still unknown. To gain information about the atypical MAP kinase Erk4, we decided to study the activation mechanism of Erk4 and its physiological function using a gene targeted deletion approach in mice. Regarding the activation of Erk4, we showed that the activation loop of Erk4 (S186EG) is constitutively phosphosphorylated in vivo and that this phosphorylation is not modulated by classical MAP kinase stimuli such as serum and sorbitol. However, we observed that phosphorylation of S186 increases in the presence of MK5 and we showed that this increase is independent of the kinase activity of either kinases. Moreover, we established that phosphorylation of Erk4 activation loop is required for the stable interaction between Erk4 and MK5 as well as for the activation and cytoplasmic relocalisation of MK5. Thus, our study reveals that Erk4 is differently regulated than classical MAP kinases and that Erk4 activation loop phosphorylation is important for its role in the regulation of MK5 activity. In parallel, our results revealed the existence of an “Erk4 kinase” whose recruitment and/or activation seems to be facilitated by MK5. To gain information about the physiological function of Erk4 we generated Erk4 deficient mice. Gene-targeted inactivation of Erk4 is viable and these mice present no gross abnormality. To explain the absence of phenotype, we analyzed the expression of Erk3, the paralog of Erk4, to determine if it could compensate for the loss of Erk4. Our analysis revealed that Erk3 expression in Erk4-/- mice is not up-regulated during embryogenesis nor in adult mice tissues in order to compensate for the loss of Erk4. We next addressed the question of redundancy between Erk4 and Erk3. In our laboratory, Erk3-/- deficient mice were also generated and the phenotype of these mice was recently analyzed. This study revealed that gene inactivation of Erk3 leads to intra-uterine growth retardation, lung maturation defect and neo-natal lethality. We then investigated the contribution of Erk4 in these phenotypes. The analysis of Erk4-/- mice revealed that inactivation of Erk4 did not delay intra-uterine growth nor cause pulmonary maturation defect. Moreover, we showed that additional loss of Erk4 in Erk3-/-mice does not accentuate Erk3-deficient mice phenotype. Thus, this study reveals that, contrary to Erk3, Erk4 is dispensable for mice development under normal condition and that Erk4 and Erk3 have non-redundant functions in vivo.

L'huître plate européenne, espèce endémique des côtes européennes, est classée dans la catégorie des " espèces menacées et/ou en déclin ". En effet, les gisements naturels de cette huître ont été progressivement décimés par la sur-exploitation et par l'émergence successive de maladies parasitaires. Le parasite responsable de la bonamiose a notamment contribué à réduire de façon drastique l'exploitation de cette huître en France, et en Europe. Les mollusques bivalves marins présentent deux caractéristiques qui restreignent de fait le potentiel d'action pour lutter contre les maladies : ils sont cultivés en milieu ouvert, et possèdent un système immunitaire inné dépourvu de la capacité de réponse adaptative. Dans ce contexte, la sélection d'animaux naturellement résistants à la bonamiose est une voie prometteuse pour relancer la culture de l'huître plate européenne. Afin de mieux comprendre le phénomène de résistance à la bonamiose, plusieurs études ont porté sur les mécanismes de réponse de l'huître plate et sur l'identification de régions génomiques potentiellement impliquées dans les mécanismes de résistance à la maladie.Le présent travail de thèse consistait à améliorer la compréhension de la résistance de l'huître plate européenne vis-à-vis de la bonamiose, mais également à mieux caractériser la ressource génétique et la structuration de ses populations naturelles. L'huître plate n'étant pas un organisme modèle, seule une carte génétique préliminaire était disponible chez cette espèce. Il a donc été nécessaire de développer de nouveaux outils moléculaires afin d'optimiser la couverture de son génome. Des marqueurs de type SNP (polymorphisme d'une seule base) ont ainsi été développés par séquençage de produits PCR et par séquençage à haut débit. Afin d'améliorer la compréhension de la résistance à la bonamiose, trois expériences d'infection avec le parasite responsable de cette maladie ont été réalisées et ont permis de caractériser les phénotypes de réponse de l'huître plate à plusieurs échelles d'études.1- À l'échelle inter-familiale, il s'agissait de détecter des régions du génome (QTL) associées aux mécanismes de réponse (survie / mortalité) à la bonamiose chez plusieurs familles d'huîtres. Cette approche a permis d'identifier plusieurs régions génomiques d'intérêt communes entre les familles, et de nouvelles régions d'intérêt qui n'avaient pas encore été détectées.2- À l'échelle intra-familiale, il s'agissait de détecter des régions génomiques associées à la régulation d'activités hémocytaires (QTL) ou à l'expression de gènes (eQTL) préalablement identifiés comme potentiellement impliqués dans la réponse à la bonamiose. Cette approche, nouvelle chez un mollusque bivalve, a notamment permis de mettre en évidence une concordance positionnelle entre les régions génomiques impliquées dans la survie ou la mortalité à la bonamiose et celles impliquées dans la régulation des réponses cellulaires et/ou moléculaires.3- À l'échelle des populations, il s'agissait d'étudier un éventuel différentiel de réponse à la bonamiose chez des huîtres provenant de trois populations naturelles géographiquement et écologiquement distinctes. Cette étude a notamment permis d'identifier une possible adaptation à la parasitose des huîtres provenant de la baie de Quiberon. Afin de mieux caractériser les ressources naturelles de l'huître plate européenne, plusieurs populations couvrant l'ensemble de l'aire de distribution de l'espèce ont également été étudiées. Cette étude a permis de confirmer la forte diversité nucléotidique de l'huître plate, en évaluant pour la première fois la diversité génétique globale des populations naturelles d'un mollusque bivalve marin. Cette étude a également permis d'identifier une structuration génétique des populations, avec coïncidence entre les discontinuités dans la distribution des fréquences alléliques des marqueurs moléculaires sous sélection positive ou divergente et les barrières biogéographiques.