La thérapie génique consiste à introduire du matériel génétique dans des cellules dans l’objectif de traiter une pathologie. Le plus souvent, la thérapie génique s’effectue au moyen d’un vecteur viral, transportant le gène jusque dans les cellules cibles. Dans le cas des maladies monogéniques, l’adeno-associated virus (AAV) s’est imposé progressivement comme un vecteur de choix. Son absence de pathogénicité, son large tropisme et sa capacité à transduire des cellules quiescentes sont autant d’avantages comparés à d’autres vecteurs utilisés en thérapie génique. L’utilisation d’AAV est approuvé en Europe pour le traitement d’un déficit rare en lipoprotéine lipase et vient récemment d’être approuvé par les autorités américaines pour le traitement d’un déficit de la vision. Toutefois, les essais de thérapies géniques se heurtent souvent aux réponses immunitaires dirigées contre l’AAV. En effet, les différents composants de ce vecteur viral ont été identifiés comme pouvant déclencher des réponses immunitaires s’opposant à l’efficacité à long terme de la thérapie génique. De plus, la protéine transgénique peut s’avérer immunogène, ce qui conduit au déclenchement de réponses immunitaires, à la destruction des cellules transduites et in fine à l’échec de la thérapie génique. En clinique, des immunosuppresseurs sont utilisés pour palier à ses effets indésirables. Toutefois, de par leurs effets secondaires infectieux et tumorigènes, des stratégies visant plutôt à induire de la tolérance vis-à-vis de la protéine transgénique, associées à un bénéfice pour la santé des patients, se sont développées.L’objectif de ce travail de thèse a été d’implémenter une nouvelle stratégie visant à étudier l’effet immunorégulateur et tolérogène de protéines de fusion dérivées de CTLA-4/Fc et de PD-L1/Fc. Pour cela, nous avons utilisé un modèle murin récapitulant les réponses immunitaires induites par un AAV permettant l’expression d’une protéine modèle fortement immunogène, l’ovalbumine (Ova). Ensuite, des AAV codant pour les protéines au potentiel immunorégulateur ont été synthétisés et injectés aux souris conjointement à l’AAV-Ova. Cette stratégie d’immunorégulation vectorisée (VIR) nous a permis d’évaluer la capacité de chacune des protéines à moduler les réponses immunitaires dirigées contre l’Ova directement in vivo. Au total, ce travail a permis de mettre en évidence i) l’intérêt et les limites de la stratégie VIR, ii) celui du rôle délétère de CTLA-4/Fc au long terme sur les lymphocytes Tregs CD4+FoxP3+, périphériques et centraux, iii) et de démontrer l’intérêt de 2 nouvelles molécules dérivées PD-L1/Fc sur la persistance de l’Ova. / Gene therapy consist into introducing genetic material into cells to treat genetic disorders. Most gene therapies use viral vectors to carry the gene within target cells. In case of monogenic disorders, adeno-associated viruses (AAV) has become a vector of choice because of its lack of pathogenicity, its large tropism and its capacity to transduce quiescent cells. The use of AAV is approved in Europe to treat a rare lysosomal storage disease and has recently been approved by the FDA to treat a genetic cause of blindness. However, most clinical trials face immune responses directed against AAV components which may be highly immunogenic. This deleterious immunogenicity often lead to the trial failure. In addition, transgenic protein can also be immunogenic, aimaing to the destruction of transduced cells and ultimatly to gene therapy failure. In clinic, immunosuppressive drug remain the only option to counteract unwanted immune responses. These drugs possess infectious and tumorigenic side effects, therefore strategies aiming to rather capable to induce tolerance toward the transgenic protein are being developped and needed. The objectif of this work was to implement a new strategy aiming to study the immunoregulatory and tolerogenic effect of fusion proteins derived from CTLA-4 and PD-L1. We used a murin model recapitulating the immunes responses induced by an AAV coding for an immunogenic model protein, ovalbumin (Ova) presented in previous studies by our group and others. Then, we synthesized AAV coding for our newly designed immunoregulatory protein and injected them into mice along with AAV-Ova. This strategy of vectorized immunoregulation (VIR) allowed to evaluate the intrinsic capacity of each individual proteins to modulate immune responses against Ova directly in vivo. Eventually, this work allow to 1) assess the benefits and limits of the VIR strategy, 2) the deletrious long-term effects of CTLA-4/Fc on central and peripheral Tregs in mice, 3) to demonstrate the interest of new molecules specifically derived from PD-L1/Fc over the immune tolerance through the long-term persistance of Ova transgene.

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Les dinoflagellés sont une famille d'eucaryotes unicellulaires trouvés dans les écosystèmes marins et d'eau douce et sont d'importants producteurs primaires. Ils sont réputés pour plusieurs comportements distinctifs, notamment la formation de proliférations d'algues nuisibles appelées « marées rouges », l'émission de bioluminescence dans l'océan et leur contribution à la formation de récifs coralliens. Leur structure génomique est inhabituelle avec de grandes quantités d'ADN et des chromosomes condensés en permanence à toutes les étapes du cycle cellulaire. L’ADN est sans nucléosome et se trouve dans une structure de cristaux liquides. Plusieurs gènes sont codés dans de multiples répétitions situées dans des réseaux en tandem produisant des protéines pratiquement identiques sans aucun élément conservé détecté dans les régions présumées promotrices en amont de la séquence codante. Ces caractéristiques uniques rendent difficile à comprendre comment les cellules régulent l'expression des gènes. Cette thèse examine l’hypothèse que la régulation de transcription est difficile et peu utilisée chez les dinoflagellés. Les dinoflagellés présentent une rareté des facteurs de transcription, les protéines du domaine de choc froid (CSP) représentant la majorité des protéines de liaison à l'ADN potentielles dans le transcriptome de Lingulodinium polyedra et le génome de Symbiodinium kawagutii. Le potentiel des CSP de dinoflagellés à agir en tant que facteurs de transcription spécifiques à la séquence a été testé en utilisant des tests de déplacement de mobilité électrophorétique. Ces études ont révélé que quatre CSP différentes ont montré une préférence pour l'ARN par rapport à l'ADN simple et double brin. Une deuxième approche a examiné le ciblage de la séquence spécifique par des tests de sélection et de liaison d'amplification, et cela n'a révélé aucun motif consensus détectable dans la liaison à l'ADN. Nous concluons que les CSP dinoflagellés sont plus susceptibles de fonctionner comme des protéines de liaison à l'ARN que comme des facteurs de transcription. Il a été rapporté que l'expression de nombreux gènes chez plusieurs espèces de dinoflagellés était régulée par l'exposition à la lumière. Cela a été testé pour trois gènes, dont l'expression régulée par la lumière chez l'espèce formant des récifs Symbiodinium kawagutii. La régulation de ces gènes a été rapportée dans la littérature suggérant la possibilité d’identifier les éléments régulateurs dans le promoteur. Cependant, l'analyse par transfert de Northern n'a pas pu valider le modèle d'expression de ces trois gènes chez S. kawagutii. De plus, le séquençage d'ARN à haut débit a confirmé que ces trois gènes n'étaient pas induits par la lumière. Au total, seuls sept gènes ont été exprimés de manière différentielle à l'aube et au crépuscule en utilisant RNA-Seq, et tous étaient de moindre abondance à la fin de la période de lumière sur un 12: 12 cycle L: D. Trois des sept ont également été examinés en utilisant une analyse qPCR, et seule deux des trois ont pu être confirmés comme étant altérés, mais avec une différence de facteur inférieure à celle observée avec RNA-Seq. Nous en concluons qu'il y a peu de régulation lumineuse de l'expression génique dans cette espèce dinoflagellé. Dans l’ensemble, les études décrites ici appuient l’hypothèse que les dinoflagellés ont un moins grande dépendance sur la régulation transcriptionnelle que d’autres organismes. / Dinoflagellates are a large family of unicellular eukaryotes found in marine and freshwater ecosystems and are important primary producers in marine ecosystem. They are famous for several distinctive behaviors including forming harmful algal blooms called “red tides”, emission of bioluminescence in the ocean, and contributing to the formation of coral reefs. They have an unusual genome structure with large amounts of DNA and permanently condensed chromosomes throughout all stages of the cell cycle. The chromatin lacks observable nucleosomes and has a liquid crystal structure. Some genes are encoded in multiple repeats located in tandem arrays producing virtually identical proteins without any known conserved elements detected in the upstream promoter regions or intergenic spacers. These unique features make it difficult to understand how gene expression is regulated. This thesis describes two experimental tests for the hypothesis that transcriptional regulation is difficult and is not the primary means of regulating gene expression in dinoflagellates. Dinoflagellates show a paucity of transcription factors, and of these, cold shock domain proteins (CSPs) account for the majority of potential DNA binding proteins in the transcriptome. Here, the potential of dinoflagellate CSPs from free-living Lingulodinium polyedra and reef-forming Symbiodinium kawagutii (recently renamed to Fugacium kawagutii) to act as sequence specific transcription factors was tested. These studies using four different CSPs showed a preference for RNA over both single and double stranded DNA using electrophoretic mobility shift assays (EMSA). A second approach, testing for specific sequence binding by three cycles of selection and amplification binding (SAAB) did not enrich any consensus motif for any of the four proteins. We conclude dinoflagellate CSPs are more likely to function as RNA binding proteins than as transcription factors. Expression of many genes in many dinoflagellate species has been reported to be regulated by light. This was tested for three genes whose expression was reported to be light-regulated in Symbiodinium kawagutii. The availability of a genome sequence for this species suggested that it might be possible to identify potential regulatory elements in the promoter of these genes. However, Northern blot analysis was unable to confirm differential expression of these three genes over a 24 hour light-dark cycle. Furthermore, RNA-Seq of samples taken at the end of the day and night also indicated these three genes were not light-induced. In total, only seven genes were found to be differentially expressed at dawn and dusk using RNA-Seq in triplicate with a false discovery rate (FDR) of 0.1. All were of lower abundance at the end of the light period on a 12:12 L:D cycle suggesting possible repression by light. Three of these seven, picked at random, were examined using qPCR analysis. Only two of the three had lower abundance at the end of the day by this technique, and the fold difference was less than what was observed with RNA-Seq. We conclude from this that there is little light regulation of gene expression in this dinoflagellate species. Taken together, the studies described here support the hypothesis that dinoflagellates do not rely on regulation of genes at the transcriptional level to the same extent as other organisms.

Chez l’embryon précoce, une vague de reprogrammation majeure survient et permet de réinitialiser les profils de méthylation d’ADN de l’ensemble du génome. Lors de cette reprogrammation, les régions différentiellement méthylées (DMRs) (i.e., gènes empreintes) doivent toutefois être protégées de la déméthylation par une action continue de DNMT1 (Méthyltransférase d’ADN 1) pour assurer le développement adéquat de l’épigénome du fœtus. Sachant que l’induction d’une perte temporaire d’expression de Dnmt1 dans un modèle de cellules souches embryonnaires de souris entraîne la perte permanente des patrons de méthylation d’ADN aux régions DMRs et DMR-like, mon projet de recherche vise à comprendre pourquoi ces régions sont incapables de retrouver leurs patrons de méthylation d’ADN initiaux. Notre hypothèse est qu’une adaptation épigénétique (i.e. réarrangement erroné de certaines modifications d’histones) survient aux régions régulatrices de l’expression des gènes (promoteurs et enhancers) et empêche directement ou indirectement le retour au paysage épigénétique initial aux régions affectées. L’objectif du projet est donc de précisément définir comment la perte temporaire de Dnmt1 remodèle le paysage épigénétique aux régions promotrices (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K9me3, méthylation d’ADN) et comment les adaptations épigénétiques sont associées avec des changements de l’expression des gènes (ex : gènes des régions DMRs et DMRs-like). / In early embryos, a major reprogramming wave occurs and permits to reset DNA methylation profiles genome-wide. During the reprogramming wave, differentially methylated regions (DMRs) (imprinted genes) must be protected from demethylation by the continuous action of DNMT1 (DNA Methyltransferase 1) to ensure the proper development of the foetal epigenome. As the induction of a temporary loss of Dnmt1 expression in a mouse embryonic stem cell model leads to permanent losses of DNA methylation at DMR and DMR-like regions, my project aims to understand why those regions are unable to re-establish their initial DNA methylation patterns. Our hypothesis is that an epigenetic adaptation (erroneous rearrangement of certain histone modifications) occurs at regulatory regions controlling gene expression (promoters and enhancers) and impede directly or indirectly the affected regions to return to their initial epigenetic landscape. The goal of this project is thus to define how the temporary loss of Dnmt1 remodels the epigenetic landscape at promoter regions (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K9me3, DNA methylation) and how the epigenetic adaptations are associated with changes in gene expression (ex: genes in DMR and DMR-like regions).

Les mutations somatiques sur le variant d’histone H3.3 et les régulateurs épigénétiques associés à H3.3 ont été identifiés dans 30 % des glioblastomes pédiatriques. Ces mutations sont caractérisées par des substitutions d'acides aminés à des positions spécifiques dans la région N-terminale de l'histone H3.3 telles que la glycine 34 en valine/arginine (G34V/R), l'alanine 29 en proline (A29P), ou une haplo-insuffisance de la protéine Zinc Finger MYND-Type Containing 11 (ZMYND11). ZMYND11 est un co-répresseur de la transcription qui se lie spécifiquement à H3.3K36me3 pour moduler l'activité de l'ARN polymérase II. De plus, il est intéressant de mentionner que l’interaction entre ZMYND11 et H3.3K36me3 est altérée lorsque le résidu G34 est muté en G34V. Récemment, les mutations germinales H3.3G34V, H3.3A29P et ZMYND11 ont été identifiées chez des patients présentant une déficience neurologique. Nous émettons l'hypothèse que les mutants H3.3G34V et H3.3A29P empêchent ZMYND11 de se lier à H3.3K36me3 et pourrait converger mécaniquement avec la perte de fonction de ZMYND11, ce qui perturberait la neurogenèse. À l'aide de la technologie CRISPR Cas9, nous avons généré des modèles mutants isogéniques à partir de cellules souches pluripotentes (iPSC) pour H3F3B-A29P, H3F3B-G34V et ZMYND11-knock-out (KO). Par la suite, nous avons stimulé la différenciation de ces modèles vers des lignées neuronales afin d’identifier si ces mutations affectent la neurogenèse. Enfin, en utilisant des méthodes de séquençage à haut-débit nous avons analysé le profil épigénomique et transcriptomique pour déterminer comment l’interaction entre ZMYND11 et H3K36me3 est perturbée et à quels degrés ces mutations impactent sur les modifications post-traductionnelles des histones. Ce projet permettra de mieux comprendre les fonctions de ZMYND11 sur le remodelage de la chromatine et sa fonction biologique au cours du développement cérébral. / Somatic mutations on the histone 3 variant H3.3 and H3.3-associated chromatin modifiers have been identified in 30% of pediatric high-grade gliomas (pHGG). The mutations are characterized by amino acid substitutions at specific positions within the histone H3.3 tail such as glycine 34 to valine/arginine (G34V/R), alanine 29 to proline (A29P), or haploinsufficiency of the chromatin reader Zinc Finger MYND-Type Containing 11 (ZMYND11). ZMYND11 is a transcriptional co-repressor that specifically reads H3.3K36me3 to modulate RNA polymerase II activity. Notably, binding of ZMYND11 to H3.3K36me3 is altered when G34 residue is mutated to G34V. Recently, germline mutations of H3.3G34V, H3.3A29P, and ZMYND11 have been identified in patients with Intellectual disability. We hypothesize that H3.3 G34V and H3.3A29P mutants impede the binding of ZMYND11 to H3.3K36me3 and may mechanistically converge with ZMYND11 loss-of-function mutation to perturb neurogenesis. Using CRISPR Cas9-mediated gene editing, we will generate isogenic human induced pluripotent stem cell (iPSC) models for H3F3B-A29P, H3F3B-G34V and ZMYND11-KO, and perform in vitro neural differentiation to identify whether specific neural lineages are affected. Next, using epigenomic and transcriptomic profiling we will study whether binding between ZMYND11 and H3K36me3 is disrupted, and the downstream impact on Post-Translational Modifications of histones (PTMs) and transcription. This project will lead to a better understanding of the crucial role of the chromatin reader ZMYND11 on chromatin remodeling and the biological function during neural development.

Durant le développement embryonnaire, une seule cellule, le zygote, est à l’origine de la formation de tous les types de cellules de l’organisme. L’information génétique nécessaire au destin d’une cellule y est gardé dans la chromatine condensée, d’abord inaccessible, et se déploie progressivement au moment opportun de la différenciation cellulaire grâce à des facteurs pionniers. Les facteurs de transcription pionniers sont des acteurs clés des cascades génétiques et épigénétiques déterminant le destin cellulaire. Les facteurs pionniers ont la propriété unique de reconnaître leurs cibles dans la chromatine fermée. Leur action permet d’augmenter l’accessibilité à un répertoire d’enhancers spécifique à un destin cellulaire, ouvrant la voie aux autres facteurs de transcription. Les aspects entourant la reconnaissance initiale des facteurs pionniers à leurs cibles dans la chromatine fermée sont mal compris. Dans l’hypophyse, le facteur pionnier Pax7 est spécifique aux cellules du lobe intermédiaire et met en place le programme génétique mélanotrope. Pour se faire, Pax7 repère les régions régulatrices clé de l’identité mélanotrope dans la chromatine fermée, afin d’accroître l’accessibilité à l’ADN permettant la liaison d’autres facteurs non-pionniers. Pax7 possède deux domaines de liaison à l’ADN, le domaine paired (PD) et l’homéodomaine (HD), chacun liant un motif de séquence caractéristique. De plus, une séquence cible composite, formé de la juxtaposition des motifs reconnus par PD et HD, est enrichie aux sites pionniers de Pax7. Dans le but de définir les propriétés de liaison à l’ADN de Pax7, nous avons caractérisé les interactions de Pax7 avec ses différentes séquences cibles. Nous avons démontré par des expériences de liaison à l’ADN in vitro (retard sur gel) que l’interaction de Pax7 avec le motif composite est d’affinité supérieure et sous forme de monomère où le PD est principalement impliqué. Comme les sites cibles de Pax7 dans l’hétérochromatine sont marqués par la méthylation de l’ADN, nous avons montré que la méthylcytosine dans le motif de liaison n’interfère pas avec la liaison à l’ADN par Pax7. De plus, des mutations ponctuelles aux domaines de liaison à l’ADN de Pax7 ont montré que les deux domaines de liaison à l’ADN sont nécessaires pour le recrutement aux sites dans la chromatine fermée, a fortiori pour l’ouverture de la chromatine. Des études antérieures ayant identifié des transcrits alternatifs de Pax7, nous avons étudié l’impact fonctionnel des variants Pax7. Les quatre isoformes Pax7 comportent des résidus d’acides aminés alternatifs au niveau du PD : elles ont des propriétés de liaison à l’ADN in vitro ainsi qu’un potentiel de transactivation très similaires. Bien que les isoformes de Pax7 aient des activités pionnières variables, leur action différentielle n’est pas dû à leurs propriétés intrinsèques de liaison à l’ADN ou de transactivation. Nos travaux ont identifié les particularités de Pax7 par rapport à d’autres facteurs pionniers dans les mécanismes de reconnaissance des sites dans l’hétérochromatine. Ainsi, les enhancers sujet à l’action pionnière de Pax7 contiennent typiquement plus de motifs cibles que les cibles d’action transcriptionnelle et l’action pionnière de Pax7 un recrutement fort aux sites pionniers ; de plus, les deux domaines de liaison à l’ADN intacts sont essentiels pour ce recrutement et l’action pionnière. Nos travaux ont défini les paramètres requis pour le reprogrammage cellulaire par un pionnier, Pax7, tout particulièrement en regard des sites de recrutement dans la chromatine fermée. La reprogrammation de cellules souches pour la production de cellules différenciées présente un potentiel thérapeutique unique en médecine régénérative et nos travaux supportent le rôle critique des pionniers dans ce contexte. / During embryonic development, a single cell, the zygote, is responsible for the formation of all cell types in the body. The genetic information necessary for cell fates is stored there in condensed chromatin, initially inaccessible, and is gradually deployed at the opportune moment of cell differentiation by the pioneer factors. Pioneer transcription factors are key determinants in the genetic and epigenetic cascades leading to cell fate. Pioneer factors have the unique property of recognizing their DNA targets in closed chromatin. Their action provides accessibility to a repertoire of enhancers specific to a cell fate, opening the way for other transcription factors. We poorly understand initial recognition of pioneer factors at their targets in closed chromatin. In the pituitary gland, the pioneer factor Pax7 is specific to the intermediate lobe and implements the melanotrope genetic program. To do so, Pax7 identifies key regulatory regions of melanotrope identity in closed chromatin to provide DNA accessibility allowing the binding of other non-pioneer factors. Pax7 has two DNA binding domains (DBD), the paired domain (PD) and the homeodomain (HD), each binding a characteristic sequence motif. In addition, a composite target sequence, formed from the juxtaposition of PD and HD motifs, is enriched at the pioneer sites of Pax7. In order to define the DNA binding properties of the pioneer factor Pax7, we characterized the interactions of Pax7 with its different target sequences. We have demonstrated by in vitro DNA binding experiments (gel shift) that the interaction of Pax7 with the composite motif is of higher affinity and as a monomeric form in which the PD is primarily involved. As Pax7 target sites in heterochromatin are marked by DNA methylation, we showed that methylcytosine within the binding motif does not interfere with Pax7 DNA binding. Using point mutations in the Pax7 DBDs, we showed that both DBDs are required for the recruitment to sites in closed chromatin, furthermore for chromatin opening. Since previous studies identified alternative Pax7 transcripts, we investigated the functional impact of Pax7 variants. The four Pax7 isoforms contain alternative amino acid residues in the PD: they have similar in vitro DNA binding properties and transactivation potential. Although Pax7 isoforms have varying pioneering activities, their differential action is not due to their intrinsic DNA-binding or transactivation properties. Our work has identified the particularities of Pax7 compared to other pioneering factors in the mechanisms of site recognition in heterochromatin. Thus, the enhancers subject to the pioneer action of Pax7 typically contain more target motifs than the targets of transcriptional action and the pioneer action of Pax7 a strong recruitment to the pioneer sites; moreover, the two intact DNA-binding domains are essential for this recruitment and pioneering action. Our work has defined the parameters required for cellular reprogramming by a pioneer, Pax7, particularly with regard to recruitment to sites in closed chromatin. The reprogramming of stem cells for the production of differentiated cells has unique therapeutic potential in regenerative medicine and our work supports the critical role of pioneers in this context.

Le chitosane est un polysaccharide naturel, généralement reconnu pour sa biocompatibilité et biodégradabilité. Sa notoriété se doit non seulement à la diversité de ses applications biomédicales, mais aussi à la disponibilité des groupes fonctionnels qui permettent la modification de ses caractéristiques physicochimiques. Dans le contexte de la thérapie génique, le chitosane est reconnu pour son potentiel en tant que nanovecteur, pour transporter du matériel génique à l’intérieur des cellules. Notre laboratoire a mis au point la synthèse d’un diéthylaminoéthyl-chitosane-polyéthylène glycol-acide folique (DEAE12-CH-PEG-FA2), qui a déjà démontré sa capacité de transfection in vitro sur plusieurs lignées cellulaires et son potentiel thérapeutique en tant que nanoparticule dans un modèle animal d’arthrite. Ces résultats prometteurs ont encouragé la suite de nos recherches. Ainsi, l’évaluation des propriétés cytotoxiques et hémotoxiques de notre chitosane modifié et de ses nanoparticules s’est avérée une étape essentielle pour continuer vers une potentielle application clinique. Étant donné les résultats contradictoires des rapports sur les caractéristiques hémocompatibles de ce polymère, en plus du manque de témoins d’interférence, de l’absence de données sur le niveau de contamination aux endotoxines des formulations et l’hétérogénéité des protocoles expérimentaux dans la littérature, nous avons employé les lignes directrices de l’ISO, l’ASTM et le NCL pour estimer son profil toxicologique. Dans cette étude, nous avons approfondi les connaissances sur l'hémocompatibilité des nanoparticules de DEAE12-CH-PEG-FA2/siRNA dans un cadre contrôlé et informatif. Cette évaluation a montré une faible réponse hémolytique et d’agrégation plaquettaire, et aucun effet sur le système du complément et sur le temps de coagulation du plasma. Également, la mesure du niveau de radicaux libres (ROS et NO) n’a pas décelé une réponse biologique reliée au stress oxydatif. Cependant, la viabilité cellulaire et le niveau de libération de la lactate déshydrogénase (LDH) ont révélé une relation en fonction de la concentration, du temps d’exposition et du type cellulaire étudié. Enfin, l’expression de cytokines telles que le TNF-α, l’IL-6, l’IL-4 et l’IL-10 ont été comparables à ceux du témoin négatif, le PBS. Dans cette quête de l’estimation des propriétés biocompatibles de notre chitosane, notre projet s’est dirigé vers l’étude des mécanismes moléculaires. C’est ainsi que nous avons étudié les voies de signalisation reliées aux récepteurs de surface cellulaire susceptibles de reconnaître le chitosane, notamment le récepteur toll-like 4 (TLR-4) et les récepteurs de lectine de type C (CLR). Nos données révèlent que les nanoparticules de DEAE12-CH-PEG-FA2/siRNA, à différentes concentrations et à différentes périodes d’incubation, n’activent pas les voies de signalisation des IKK/NF-κβ, MAPKs, AKT et SYK. Ces résultats ont été supportés par l’absence d’une réponse pro-inflammatoire mesurée à partir de l’expression de médiateurs clés comme le TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2 et iNOS. Au vu de nos découvertes, nous pouvons déduire le potentiel d’innocuité de notre chitosane modifié (DEAE12-CH-PEG-FA2), indispensable pour son application dans la thérapie génique. Également, nous suggérerons la possibilité que des récepteurs cellulaires qui n’ont pas encore été identifiés soient impliqués dans la reconnaissance et l’internalisation du chitosane, ce qui mérite la réalisation d’études plus approfondies. / Chitosan is a natural polysaccharide, generally known for its biocompatibility and biodegradability. Its notoriety is due not only to the diversity of its biomedical applications but also to the presence of functional groups in its chain, which allow the modification of its physiochemical properties. In gene therapy applications, chitosan is known for its potential as a nanovector to transport genetic material to cells. Our laboratory has synthesized a modified-chitosan diethylaminoethyl-chitosan-polyethylene glycol-folic acid (DEAE12-CH-PEG-FA2), which has already shown in vitro transfection efficiency in several cell lines and a therapeutic potential as a nanoparticle in an animal arthritis model. These promising results encouraged further research. Thus, the evaluation of the cytotoxic and hemotoxic properties of our modified chitosan and its nanoparticles became an essential step to continue towards potential clinical applications. Given the existing contradictory outcomes about the hemocompatible characteristics of this polymer, as well as the lack of interference controls, the absence of data on endotoxin levels in nanoformulations and the diversity of the experimental protocols, we used ISO, ASTM and NCL’s guidelines to estimate its toxicological profile. In this study, we discovered new information about DEAE12-CH-PEG-FA2/siRNA nanoparticle hemocompatibility, in a controlled and informative framework. This evaluation showed low hemolytic properties, low platelet aggregation capacity with no effect on the complement and coagulation systems. Moreover, detection of free radical levels (ROS and NO) did not show a biological response related to oxidative stress. Nevertheless, cell viability and the levels of lactate dehydrogenase (LDH) release revealed concentration-, incubation time- and cell-dependent outcomes. Regarding cytokine expression, TNF-α, IL-6, IL-4 and IL-10 levels were equivalent to those of the negative control, PBS. In the quest to evaluate the biocompatible properties of chitosan, our project focused on the study of its molecular mechanisms. Therefore, we studied signaling pathways related to receptors that have been associated to chitosan recognition such as toll-like receptor 4 (TLR-4) and C-type lectin receptors (CLRs). Our data revealed that DEAE12-CH-PEG-FA2/siRNA nanoparticles, at the studied concentrations and time courses, did not activate the IKK/NF-κB, MAPKs, AKT nor SYK signaling pathways. These results were supported by the absence of an inflammatory response measured by the expression of key mediators such as TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2 and iNOS. In view of our findings, we deduced the safety potential of our modified chitosan (DEAE12-CH-PEG-FA2) which is mandatory for gene therapy applications. Moreover, we suggest the involvement of unidentified cellular receptors in the recognition and uptake of chitosan which warrant further investigation.

Bien que la majeure partie du génome humain soit présente en deux copies (une copie héritée de chaque parent), certains segments peuvent être délétés (une copie) ou dupliqués (trois copies). La recherche a montré que plusieurs variations du nombre de copies (CNVs) augmentent le risque de troubles neurodéveloppementaux (e.g. autisme, TDAH, schizophrénie). Or, on connait peu les effets des CNVs sur le développement et le fonctionnement cérébral. L’électroencéphalographie (EEG) au repos s’avère être une méthode adaptée pour étudier les perturbations de l’activité neuronale chez les porteurs de CNVs. L’objectif de ce projet était de déterminer s’il existe des signatures EEG à l’état de repos qui sont caractéristiques des enfants porteurs de CNVs pathogéniques. L’activité cérébrale au repos de 109 porteurs de CNVs (66 délétions, 43 duplications) âgés de 3 à 17 ans a été enregistrée en EEG durant 4 minutes. Pour mieux prendre en compte les variations développementales, les indices EEG (puissance spectrale et connectivité fonctionnelle) ont été corrigés avec un modèle normatif estimé à partir de 256 contrôles du Heatlhy Brain Network. Les résultats ont montré une puissance bêta et gamma accrue dans les régions postérieures ainsi qu’une sous-connectivité globale à des échelles temporelles distinctes chez les porteurs de CNVs. Les porteurs d’une délétion et d’une duplication pouvaient être différenciés par leur connectivité dans les fréquences bas-alpha: la connectivité des porteurs d’une duplication était plus perturbée que celle des porteurs d’une délétion. Les perturbations distinctives en connectivité se sont avérées plus proéminentes à l’adolescence. Les résultats suggèrent que les porteurs de CNVs présentent des altérations électrophysiologiques par rapport aux témoins neurotypiques, indépendamment de la région génomique affectée. / Although most of the human genome is present in two copies (one copy inherited from each parent), some segments can be deleted (one copy) or duplicated (three copies). Research has shown that many copy number variations (CNVs) increase the risk of neurodevelopmental disorders (e.g. autism, ADHD, schizophrenia). However, little is known about the effects of CNVs on brain development and function. Resting-state electroencephalography (EEG) is a suitable method to study the disturbances of neuronal functioning in CNVs. We aimed to determine whether there are resting-state EEG signatures that are characteristic of children with pathogenic CNVs. Resting-state brain activity of 109 CNVs carriers (66 deletions, 43 duplications) aged 3 to 17 years was recorded in EEG for 4 minutes. To better account for developmental variations, EEG indices (power spectral density and functional connectivity) were corrected with a normative model estimated from 256 Heatlhy Brain Network controls. Results showed increased beta and gamma power in posterior regions as well as a global under-connectivity at distinct frequency bands in CNVs carriers. Deletion and duplication carriers can be differentiated by their connectivity in low alpha frequencies: the connectivity of the duplication carriers was more disrupted than that of the deletion carriers. The distinctive connectivity perturbations were found to be most prominent during adolescence. The results suggest that CNVs carriers show electrophysiological alterations compared to neurotypical controls, regardless of the gene dosage effect and of their affected genomic region. Moreover, a specific signature of the molecular alterations associated with deletions was found.

La délivrance intracytoplasmique de petites molécules hydrophiles et de gènes (ADN, ARN) est un défi majeur pour l’industrie pharmaceutique, puisque ces composés sont incapables de franchir les membranes biologiques par eux-mêmes. L’utilisation de nanovecteurs lipidiques permet de surmonter les étapes d’instabilité sanguine du gène thérapeutique, de pénétration cellulaire et d’échappement endosomal. Nous reportons dans cette thèse l’élaboration de nouveaux vecteurs lipidiques pH-sensibles, basés sur une bascule moléculaire capable de changer de conformation et déstabiliser le nanovecteur après protonation à pH acide, favorisant ainsi l’échappement endosomal du fragile contenu thérapeutique. Ce mécanisme de pH-sensibilité est non reporté dans la littérature jusqu’alors. Dans un premier temps, l’élaboration de lipides bascules pH-sensibles non-cationiques destinés à la délivrance liposomale de principes actifs hydrophiles est reportée. Ce premier travail introduit les lipides bascules, valide l’implication de la bascule moléculaire pH-sensible et apporte une première preuve de concept in vitro de faisabilité. Dans un second temps est introduit l’utilisation de nouveaux lipides bascules cationiques pH-sensibles pour la thérapie génique (délivrance in vitro et in vivo de siRNA), validant encore une fois l’implication de la bascule moléculaire dans l’efficacité de délivrance intracytoplasmique des siRNA. A l’issue de cette thèse sont identifiés deux lipides bascules (2 et CSL3) capables d’être introduits dans des nanoparticules lipidiques pour la délivrance de drogues et de gènes respectivement. De telles formulations permettraient la délivrance intracytoplasmique de composés hydrophiles thérapeutiques (drogues, gènes) pour le traitement du cancer ou pour des applications d’édition génomique. / Intracytoplasmic delivery of small hydrophilic molecules and genes (DNA, RNA) is a major challenge for the pharmaceutical industry, since these compounds are unable to cross biological membranes by themselves. Use of lipid nanocarriers enables overcoming the stages of blood instability of the therapeutic gene, cellular penetration, and endosomal escape. In this thesis, we report the development of new pH-sensitive lipid carriers, based on a molecular switch capable of changing its conformation upon protonation and destabilizing the nanocarrier, thus favoring endosomal escape of the therapeutic content. This pH-sensitivity mechanism has not been reported in the literature to date. Firstly, we report the elaboration of non-cationic pH-sensitive switchable lipids for liposomal delivery of hydrophilic active ingredients. This initial work introduces switchable lipids, validates the involvement of the pH-sensitive molecular switch, and provides early evidence of in vitro concept feasibility. Secondly, we present the use of pH-sensitive cationic switchable lipids for gene therapy (siRNA delivery in vitro and in vivo), again validating the involvement of the molecular switch in the effectiveness of intracytoplasmic delivery of siRNA. The two lead compounds identified during this thesis (2 and CSL3) can be included into lipid nanoparticles for drug and gene delivery, respectively. Such formulations allow intracytoplasmic delivery of therapeutic hydrophilic compounds (drugs, genes) and could be used to treat diseases such as cancer or for genome editing applications.

Grâce à de récentes percées scientifiques, certains médiateurs clés dans divers états pathologiques ont été identifiés et de nouveaux composés thérapeutiques ont été développés pour les inhiber. Bien que très efficaces, ces composés possèdent souvent des propriétés physico-chimiques incompatibles avec celles du corps humain et deviennent, donc, difficiles à formuler. Au cours des dernières décennies, les systèmes de vectorisation de médicaments ont été étudiés comme une solution potentielle promettant une augmentation de la concentration du médicament au site d'action tout en atténuant les problèmes de stabilité et de solubilité. Plus particulièrement, les polymères ont démontré un succès en tant que matière première dans la conception de ces formulations. Cependant, un obstacle majeur à leur développement clinique est le faible niveau d’encapsulation du principe actif. Afin de remédier à cette limitation, les travaux présentés dans cette thèse se sont concentrés sur l'utilisation de copolymères blocs en forme d'étoile et à base d'acide cholique pour faciliter l'encapsulation. Divers principes actifs aux propriétés physico-chimiques variables ont été encapsulés dans nos systèmes polymères, témoignant ainsi de leur grande efficacité et ceci à travers une large gamme de médicaments. Dans un premier temps, les propriétés physico-chimiques de notre système ont été étudiées. Les copolymères bloc sont composés d'un noyau d'acide cholique (CA) sur lequel le poly (allyl glycidyl éther) (PAGE) et le poly (éthylène glycol) (PEG) sont polymérisées séquentiellement pour donner lieu au CA-(PAGE-b-PEG)4 amphiphiles à quatre branches. De plus, le bloc PAGE a été fonctionnalisé pour porter des groupements amines primaires. Les effets de la longueur du bloc PEG et des groupements amines sur le comportement thermosensible des polymères dans l'eau ont été examinés. Cette thermosensibilité a aussi été étudiée en présence de diverses concentrations de sels. Il a été découvert que l'augmentation de la longueur du PEG augmente la température du point de trouble. De même, la fonctionnalisation des blocs PAGE pour porter des groupements amines a augmenté le point de trouble en l'absence de sel, mais a significativement diminué en présence de sel. Cette observation a été attribuée au « salting-out » des polymères. Dans un second temps, employée comme un médicament hydrophobe modèle, la doxorubicine (Dox) a été encapsulée à l’aide de nos copolymères blocs CA-(PAGE-b-PEG)4. Dans ce cas, les interactions polymère-médicament régissant l’encapsulation de la Dox ont été étudiées. Plus précisément, les interactions hydrophobes et électrostatiques ont été comparées pour leur influence sur la charge de médicament à l'intérieur des copolymères blocs. Une charge élevée de Dox a été obtenue à l’aide des interactions électrostatiques par rapport aux interactions hydrophobes avec ou sans la présence d'acide oléique comme co-tensioactif. De plus, les interactions électrostatiques conféraient au système de relargage une réactivité au pH permettant ainsi un relargage de la Dox en présence d’un pH acide. Les copolymères blocs ont présenté une bonne biocompatibilité lors d’essai in vitro. Les nouveaux copolymères blocs en étoile et à base d'acide cholique ont montré un grand potentiel en tant que vecteurs de relargage de médicaments pour l’encapsulation de la Dox. Pour démontrer l’étendue de l’application de notre système, des petits acides ribonucléiques interférant (pARNi) ont été encapsulés à l’aide des copolymères blocs CA-(PAGE-b-PEG)4 où le PAGE a été fonctionnalisé pour porter des groupements amines. Les pARNi sont des composés thérapeutiques hydrophiles chargés négativement et nécessitant une méthodologie d’encapsulation différente de celle utilisée pour la Dox. Les groupements allyles du bloc PAGE ont été fonctionnalisés pour porter des amines primaires ou tertiaires. Également, l'acide folique a été greffé sur l'extrémité de la chaîne PEG pour augmenter l'absorption cellulaire. Les (CA-PAGE-b-PEG)4 fonctionnalisés avec des amines primaires ou tertiaires ont présenté une forte complexation des pARNi. Des agrégats micellaires uniformes ont ainsi été obtenus. De plus, des lipides ont été ajoutés comme co-tensioactifs pour aider à stabiliser les nanoparticules dans les milieux de culture cellulaire. Ces systèmes micellaires mixtes avaient une charge élevée de pARNi et une absorption cellulaire améliorée avec une augmentation concomitante de la transfection des pARNi dans des cellules modèles de HeLa et HeLa-GFP, respectivement. Les résultats présentés dans cette thèse témoignent du grand potentiel de l'utilisation de copolymères blocs en forme d'étoile et à base d'acide cholique dans la conception de systèmes de vectorisation de médicaments. Ces résultats offrent des conclusions pertinentes sur les différents paramètres clés contrôlant l’efficacité des systèmes de vectorisation des médicaments à base de polymères pouvant être traduits dans d'autres systèmes. Les stratégies développées ici aideront grandement au développement des systèmes de vectorisation de médicaments et accéléreront potentiellement leur évolution vers la clinique. / Recent scientific breakthroughs have fostered the identification of key mediators of various diseased states while permitting the development of novel therapeutic compounds to address them. Although very potent, these compounds often possess physico-chemical properties that are incompatible with those of the human body and are becoming increasingly difficult to formulate. In the recent decades, drug delivery systems have been studied as a potential solution in the formulation of these therapeutic compounds promising improved accumulation at the site of action while mitigating issues of stability and solubility. Most notably, polymers have shown tremendous success as starting material in the design of these drug formulations. However, one major hurdle curtailing their clinical translatability is their low drug loading levels. In an effort to address this limitation, the work presented in this thesis focused on the use of cholic acid-based star-shaped block copolymers for the encapsulation of active pharmaceutical ingredients with varying physico-chemical properties thereby demonstrating their successful application to a broad range of compounds. First, the physico-chemical properties of our proposed system were studied. The block copolymers are composed of a cholic acid (CA) core onto which poly(allyl glycidyl ether) (PAGE) and poly(ethylene glycol) (PEG) are polymerized sequentially to afford an amphiphilic CA-(PAGE-b-PEG)4 with four branches. The PAGE block was further functionalized to bear pendant amine groups. The effects of PEG length and of the amine groups on the thermoresponsive behavior of the polymers in water at various salt concentrations were examined. It was discovered that increasing the length of PEG increases the cloud point temperature. Similarly, functionalizing the PAGE blocks to bear pendant amine groups increased the cloud point in the absence of salt, but significantly decreased the cloud point in the presence of salt. This observation was attributed to the salting-out of the polymers. Acting as a model hydrophobic drug, doxorubicin (Dox) was first encapsulated using our proposed CA-(PAGE-b-PEG)4 block copolymers. In this case, the polymer-drug interactions driving the loading of Dox was studied. Specifically, hydrophobic and electrostatic interactions were compared for their influence on the drug loading inside the block copolymers. A high loading of Dox was achieved vis electrostatic interactions compared to hydrophobic interactions with or without the presence of oleic acid as a cosurfactant. Also, the electrostatic interactions conferred a pH responsiveness to the system where the Dox remained encapsulated at physiological pH but was released in acidic pH. The block copolymers displayed good biocompatibility in vitro. The new functionalized star block copolymers based on cholic acid showed great potential as drug delivery carriers for the loading of Dox. To demonstrate the widespread application of our proposed system, small interfering RNA (siRNA) was loading using the CA-(PAGE-b-PEG)4 block copolymers where PAGE was functionalized with amine. siRNA is a hydrophilic, negatively charged therapeutic compound necessitating a different loading methodology than that used for Dox. The allyl groups of PAGE were functionalized to bear primary or tertiary amines and folic acid was grafted onto the PEG chain end to increase cell uptake. (CA-PAGE-b-PEG)4 functionalized with either primary or tertiary amines show high siRNA complexation. Uniform micellar aggregates were obtained. Lipids were added as co-surfactants to help stabilize the nanoparticles in the cell culture media. The mixed micelles had high siRNA loading and improved cell uptake with a concomitant increase in siRNA transfection in HeLa and HeLa-GFP model cells, respectively. The results presented in this thesis, demonstrate the feasibility of using cholic acid-based star-shaped block copolymers in the design of drug delivery systems and offers insights into key parameters controlling their efficacy which can be translated to other polymer-based systems. The strategies developed herein will greatly aid in the development of drug delivery systems and potentially accelerate their progress into the clinic.