Os gangliosídios são glicoesfingolipídios caracterizados pela presença de ácido siálico em sua estrutura química e por suas altas concentrações nas membranas das células do sistema nervoso, além de desempenharem importantes funções celulares, como diferenciação, comunicação, maturação, plasticidade neuronal, entre outras. A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo, o que torna essa patologia alvo de muitos estudos para o entendimento dos mecanismos desencadeados que levam à morte neuronal, e ao mesmo tempo, com o objetivo de descobrir novos tratamentos farmacológicos. Neste estudo investigamos a ação neuroprotetora dos polifenóis resveratrol e daidzeína associando-a ao efeito destas substâncias sobre o perfil cromatográfico dos gangliosídios. Para isso, foi utilizado um modelo in vitro de privação de oxigênio-glicose (POG) em culturas organotípicas de hipocampo de rato. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com ambos polifenóis diminuiu significativamente a morte celular induzida pela POG. Através da análise do perfil cromatográfico dos gangliosídios, podemos observar uma diminuição de expressão para o gangliosídio GM1 no grupo POG, o que não aconteceu nos grupos POG tratados com os polifenóis. Além disso, os resultados de imuno-histoquímica analisados por microscopia confocal, permitiram visualizar uma maior fluorescência de GM1 localizada na região dos neurônios hipocampais, marcados pela proteína NeuN. Portanto, esses resultados sugerem que a ação neuroprotetora dos polifenóis possa ocorrer através da expressão do gangliosídio GM1 em neurônios hipocampais, prevenindo desta forma, a morte celular. / The gangliosides are glycosphingolipids characterized by the presence of sialic acid in their chemical structure and by their high concentrations in the nervous system cell membranes. Besides this, they have important cellular functions such as differentiation, communication, maturation, neuronal plasticity among others. Cerebral ischemia is one of the main causes of morbidity and mortality worldwide, making this disease the subject of many studies to understand the mechanisms that trigger the neuronal death. At the same time, the discovery of drugs that target these mechamisms could lead to new pharmacological treatments. We investigated the neuroprotective action of the polyphenols resveratrol and daidzein associating it to their effect on the chromatographic profile of gangliosides. For this, we used an in vitro model of oxygen-glucose deprivation (OGD) in organotypic cultures of rat hippocampus. Our results demonstrated that treatment with both polyphenols significantly decreased cell death induced by OGD. Through analysis of the chromatographic gangliosides profile, a decrease of GM1 ganglioside expression in OGD group was observed, which did not happen in the OGD groups treated with polyphenols. Furthermore, immunohistochemistry analysis by confocal microscopy, showed a greater GM1 fluorescence located in the region of hippocampal neurons, marked by NeuN protein. These results suggest that the polyphenols neuroprotective action may occur at the level of GM1 ganglioside expression in hippocampal neurons and may prevent cellular death.

A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa cuja patogenia não é completamente elucidada. Atribui-se ao peptídeo beta-amilóide (A ), em sua forma oligomérica ou fibrilada, um importante papel neste processo. Uma vez que a produção e a fibrilação do peptídeo ocorrem ao nível de membrana neural, sua dinâmica e composição lipídica podem modular a cascata amilóide e/ou interferir na extensão do dano gerado pela mesma. Tendo isto em vista e considerando o potencial sinalizatório dos glicoesfingolipídios, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do peptídeo betaamilóide (A 25-35), em sua forma fibrilada ou não-fibrilada, sobre a biossíntese dos gangliosídios em modelo de cultura organotípica de hipocampo. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar de 6-8 dias, dos quais o hipocampo foi dissecado, fatiado e submetido à cultura. No 28º dia de cultura foi adicionado A 25- 35 (25μM), em sua forma fibrilada ou não fibrilada; após 24h adicionou-se ao meio D- [1-14C]-galactose para avaliar a biossíntese dos gangliosídios; no 30º dia a morte celular foi analisada com iodeto de propídio. A partir das fatias, os gangliosídios radiomarcados foram extraídos, purificados, analisados por HPTLC, fluorografia e densitometria. Nossos resultados demonstraram uma alteração na biossíntese de gangliosídios induzida pelo peptídeo beta-amilóide A 25-35, um efeito que foi dependente de seu estado de fibrilação. Desta maneira, o A 25-35, em sua forma fibrilada, promoveu um aumento na biossíntese de GM3 e uma redução na biossíntese de GD1b, ao passo que o peptídeo não fibrilado levou a um aumento na síntese do gangliosídio GM1. Uma vez que o GM3 é considerado um gangliosídio apoptótico, quando expresso em neurônios adultos, um aumento em sua síntese pode estar relacionado aos eventos tóxicos desencadeados pelo peptídeo beta-amilóide fibrilado. O GM1, por sua vez, ainda não possui um papel suficientemente claro no desenvolvimento da doença de Alzheimer. Uma série de efeitos neuroprotetores são atribuídos a este gangliosídio enquanto fortes evidências sugerem que o GM1 poderia acelerar o processo de fibrilação do beta-amilóide, e assim influenciar a progressão da doença. A fim de investigar o papel do GM1 no presente modelo, realizamos uma série de experimentos com a finalidade de avaliar uma possível ação neuroprotetora deste gangliosídio. Como resultado, um pré-tratamento das fatias hipocampais com GM1(10μM) foi capaz de prevenir a toxicidade induzida pelo peptídeo beta-amilóide em sua forma fibrilada, como demonstram os resultados da captação de iodeto de propídio. Com o intuito de corroborar sua ação neuroprotetora, bem como investigar o mecanismo pelo qual esta neuroproteção seria mediada, analisamos o efeito de um tratamento com GM1 (1h, 6h, 12h ou 24h) sobre as alterações induzidas pelo peptídeo beta-amilóide no estado de fosforilação (ativação/inativação) da GSK3b. Nossos resultados demonstraram um importante efeito neuroprotetor do GM1 após 24 horas de tratamento, uma vez que nestas circunstâncias este gangliosídio foi capaz de reverter a ativação (defosforilação) da GSK3b, uma via de sinalização associada à morte celular programada. Como conclusão, nossos resultados dão suporte a participação dos gangliosídios em modelos de doença de Alzheimer, e sugerem uma ação neuroprotetora do gangliosídio GM1 frente à toxicidade induzida pelo beta-amilóide, o que, no futuro, pode ser explorado como uma alternativa terapêutica ao tratamento do Alzheimer. / Alzheimer disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose pathogenesis is still poorly understood. It is attributed to beta-amyloid peptide, in its fibrillar or nonfibrillar forms, an important role in the disease development and progression. Once the production and fibrillation of beta-amyloid peptide occurs on the neural membrane surface, the lipid dynamic and composition of these membranes could modulate amyloid cascade and/or interfere in the damage triggered by it. Taking this into account, and considering the potential signalling role of glycosphingolipids, the objective of this study was to investigate the effect of fibrillar and non-fibrillar beta-amyloid peptide (Ab25-35) upon ganglioside biosynthesis in a model of organotypic hippocampal culture. In order to do this, we used 6-8 days old Wistar rats, whose hippocampi were dissected, sliced and subjected to culture. On the 28th in vitro day, A 25-35 (25μM) was added to the culture medium, in its fibrillar or non-fibrillar forms. After 24h incubation, D-[1-C14]-galactose was added to the medium with the purpose of labeling ganglioside; on day 30th in vitro day cell death was analyzed by PI uptake. The radiolabeled gangliosides were extracted from the hippocampal slices, purified, and analyzed by HPTLC, fluorography and densitometry. Our results demonstrated an Ab25-35 induced alteration in ganglioside biosynthesis, an effect which seemed to be dependent on the peptide fibrillation state. Furthermore, the fibrillar Ab25-35 caused an increase in GM3 and a reduction in GD1b biosynthesis, whereas the non-fibrillar form of this peptide was able to enhance the synthesis of GM1 ganglioside. Once GM3 is an apoptotic ganglioside, when expressed in adult neurons, an increase in its synthesis could take part of the toxic events triggered by the fibrillar betaamyloid peptide. GM1, in turn, has a still poorly understood participation in Alzheimer development. A sort of neuroprotective effects are attributed to this ganglioside while several evidences suggest that GM1 could accelerate the endogenous fibril formation, and thence influence the disease progression. To further investigate the role of GM1 ganglioside in our model, we have performed some experiments in order to test a possible neuroprotective effect of this gangliosides. As a result, a pre-treatment of the hippocampal slices with 10μM GM1 was able to prevent the toxicity triggered by the fibrillar beta-amyloid peptide, when measured by PI uptake protocol. In order to corroborate its neuroprotective action, as well as to investigate a candidate mechanism by which GM1 could promote neuroprotection, we have analyzed the effect of GM1 treatment (1h, 6h, 12h and 24h) upon the amyloid-induced alterations in GSK3b phosphorylation/dephosphorylation state. Our results demonstrated an important effect of GM1 after 24h incubation, once it was able to reverse the amyloid-induced dephosphorilation (activation) of GSK3b, a signalling pathway involved in apoptosis triggering. Taken together, our results provides new and important support for the ganglioside participation in Alzheimer models, and suggests a protective role of GM1 upon the amyloid induced toxicity, which, in the future, could expand the therapeutic strategy available for Alzheimer disease treatment.

O monossialogangliosídeo (GM1) é um glicoesfingolipídio presente na maioria das membranas celulares que possui propriedades antioxidantes e neuroprotetoras. O GM1 protege o sistema nervoso central de vários agentes ou condições neurotóxicas, como exposição ao ácido aspártico, MPTP, ácido glutâmico, metilmalônico e glutárico, anóxia e isquemia, doença de Parkinson e Alzheimer. Os mecanismos neuroquímicos envolvidos na neuroproteção induzida pelo GM1 não são completamente conhecidos, mas a variedade de situações em que ele tem efeito neuroprotetor sugere que o GM1 interage com uma via comum, envolvida no desenvolvimento de dano celular, como o estresse oxidativo. A catalase (EC 1.11.1.6) é uma enzima antioxidante intracelular que catalisa a reação do peróxido de hidrogênio à água e oxigênio molecular, e é particularmente abundante nos eritrócitos, onde metaboliza cerca de 90% do peróxido de hidrogênio. Devido à sua baixa expressão no cérebro, ela tem sido considerada uma enzima secundária no controle dos radicais livres neste órgão. Contudo, alguns autores argumentam que, devido à sua baixa atividade ela seria um ponto de vulnerabilidade no metabolismo das espécies reativas no sistema nervoso central. Neste estudo, investigamos o efeito do GM1 sobre a atividade da catalase ex vivo e in vitro. Além disso, avaliamos o efeito da remoção dos eritrócitos dos vasos sanguíneos cerebrais, sobre a atividade da catalase, com a finalidade de estimar a contribuição da catalase eritrocitária para o aumento da catalase cerebral induzida por GM1. Nós também avaliamos se o GM1 altera o conteúdo de hemoglobina nas amostras cerebrais e a espessura dos vasos sanguíneos cerebrais. Os animais receberam duas injeções de GM1 (50 mg/kg, i.p.) ou salina (0.9 % NaCl, 1 ml/kg, i.p.), em 24 h. Trinta minutos após a segunda injeção, eles foram sacrificados por decapitação e seus cérebros foram removidos e usados nos ensaios bioquímicos. A atividade da catalase e o conteúdo de hemoglobina foram analisados no hipocampo, córtex e estriado de ratos. A administração de GM1 aumentou a atividade da catalase e o conteúdo de hemoglobina nas amostras cerebrais, mas não teve efeito sobre a catalase sanguínea. Esses efeitos foram abolidos pela perfusão transcardíaca com solução salina heparinizada. Calculamos a atividade da catalase cerebral na ausência de eritrócitos por regressão linear, utilizando os dados dos animais perfundidos e não-perfundidos, e não foi observada alteração pelo tratamento com GM1. Além disso, a adição de GM1 (100 – 1000 μM) não aumentou a atividade da catalase em fatias de córtex cerebral in vitro, sugerindo que a integridade do sistema vascular é requerida para o efeito facilitatório sobre a atividade da catalase pelo GM1. O efeito vasodilatador do GM1 foi confirmado in vivo, pois a injeção sistêmica de GM1 (50 mg/kg, i.p.) aumentou (1.5-2.5 vezes) a espessura dos vasos sanguíneos cerebrais de pequeno diâmetro. Neste estudo, nós mostramos que a vasodilatação está envolvida no aumento da atividade da catalase cerebral induzida pelo GM1. Nós sugerimos que a atividade da catalase eritrocitária tem papel antioxidante no sistema nervoso central, e que uma terapia adjunta com GM1 é válida em condições clínicas onde o aumento do fluxo sanguíneo é associado a um melhor prognóstico, como doenças vasculares obstrutivas e doenças neurodegenerativas. / Monosialoganglioside (GM1) is a glycosphingolipid present in most cell membranes that has antioxidant and neuroprotective properties. GM1 protects the central nervous system against various neurotoxic agents or conditions, such as aspartic acid, MPTP, glutamic acid, methylmalonic acid and glutaric acid exposure, anoxia and ischemia, Parkinson’s and Alzheimer’s diseases. The neurochemical mechanisms underlying GM1-induced neuroprotection are not completely known, but the wide range of situations in which GM1 is neuroprotective suggests that it may interact with common pathways involved in the development of cell injury, such as oxidative stress. Catalase (EC 1.11.1.6) is an intracellular antioxidant enzyme that catalyzes the reaction of hydrogen peroxide to water and molecular oxygen, and is particularly enriched in erythrocytes, where it metabolizes 90% of the hydrogen peroxide. Due to its poor expression in the brain, catalase has been considered a secondary enzyme in controlling free radical-induced damage in this organ. In the present study we evaluated the effect of GM1 on cerebral catalase activity ex vivo and in vitro. Moreover, the effect of erythrocyte removal on cerebral catalase activity of control and GM1-treated animals was also evaluated, in order to estimate the contribution of erythrocyte-derived catalase for the increase of catalase activity in the brain induced by the systemic injection of GM1. In addition, we investigated whether GM1 alters the content of hemoglobin in cerebral samples and the width of pial vessels of rats. Animals received two injections of GM1 (50 mg/kg, i.p.) or saline (0.9 % NaCl, 1 ml/kg, i.p.), spaced 24 h apart. Thirty minutes after the second GM1 or saline injection, they were sacrificed by decapitation and their brains were rapidly removed and used for biochemical assays. Catalase activity and content of hemoglobin were analyzed in hippocampus, cortex and striatum and blood of rats. GM1 administration increased catalase activity and hemoglobin content in brain samples, but had no effect on blood catalase activity. GM1-induced increase of catalase activity and the content of hemoglobin were abolished by transcardiac perfusion with heparinized ice-cold saline. Brain catalase activity in the absence of erythrocytes, estimated by regression analysis of data from perfused and non-perfused animals, was not altered by the systemic injection of GM1. Moreover, the addition of GM1 (100 – 1000 μM) did not increase catalase activity in slices of cerebral cortex in vitro, further suggesting that an intact vascular system is required for the facilitatory effect of GM1 on brain catalase activity. The vasodilatory effect of GM1 was confirmed in vivo, since the systemic injection of GM1 (50 mg/kg, i.p.) increased (1.5-2.5 times) the width of pial vessels. In summary, in this study we showed that vasodilation underlies the GM1- induced increase of catalase activity in brain homogenates. We suggest that erythrocyte catalase activity may play an important antioxidant role in the central nervous system, and that the adjunct therapy with GM1 may be of value in clinical conditions in which increased blood flow is associated to a better prognosis, such as obstructive vascular and neurodegenerative diseases.

Os gangliosídios são glicoesfingolipídios caracterizados pela presença de ácido siálico em sua estrutura química e por suas altas concentrações nas membranas das células do sistema nervoso, além de desempenharem importantes funções celulares, como diferenciação, comunicação, maturação, plasticidade neuronal, entre outras. A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo, o que torna essa patologia alvo de muitos estudos para o entendimento dos mecanismos desencadeados que levam à morte neuronal, e ao mesmo tempo, com o objetivo de descobrir novos tratamentos farmacológicos. Neste estudo investigamos a ação neuroprotetora dos polifenóis resveratrol e daidzeína associando-a ao efeito destas substâncias sobre o perfil cromatográfico dos gangliosídios. Para isso, foi utilizado um modelo in vitro de privação de oxigênio-glicose (POG) em culturas organotípicas de hipocampo de rato. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com ambos polifenóis diminuiu significativamente a morte celular induzida pela POG. Através da análise do perfil cromatográfico dos gangliosídios, podemos observar uma diminuição de expressão para o gangliosídio GM1 no grupo POG, o que não aconteceu nos grupos POG tratados com os polifenóis. Além disso, os resultados de imuno-histoquímica analisados por microscopia confocal, permitiram visualizar uma maior fluorescência de GM1 localizada na região dos neurônios hipocampais, marcados pela proteína NeuN. Portanto, esses resultados sugerem que a ação neuroprotetora dos polifenóis possa ocorrer através da expressão do gangliosídio GM1 em neurônios hipocampais, prevenindo desta forma, a morte celular. / The gangliosides are glycosphingolipids characterized by the presence of sialic acid in their chemical structure and by their high concentrations in the nervous system cell membranes. Besides this, they have important cellular functions such as differentiation, communication, maturation, neuronal plasticity among others. Cerebral ischemia is one of the main causes of morbidity and mortality worldwide, making this disease the subject of many studies to understand the mechanisms that trigger the neuronal death. At the same time, the discovery of drugs that target these mechamisms could lead to new pharmacological treatments. We investigated the neuroprotective action of the polyphenols resveratrol and daidzein associating it to their effect on the chromatographic profile of gangliosides. For this, we used an in vitro model of oxygen-glucose deprivation (OGD) in organotypic cultures of rat hippocampus. Our results demonstrated that treatment with both polyphenols significantly decreased cell death induced by OGD. Through analysis of the chromatographic gangliosides profile, a decrease of GM1 ganglioside expression in OGD group was observed, which did not happen in the OGD groups treated with polyphenols. Furthermore, immunohistochemistry analysis by confocal microscopy, showed a greater GM1 fluorescence located in the region of hippocampal neurons, marked by NeuN protein. These results suggest that the polyphenols neuroprotective action may occur at the level of GM1 ganglioside expression in hippocampal neurons and may prevent cellular death.

O monossialotetra-hexosilgangliosídeo (GM1) é um glicoesfingolipídio presente nas membranas celulares que exerce propriedades antioxidantes e neuroprotetoras. Os mecanismos neuroquímicos envolvidos na neuroproteção induzida pelo GM1 não são completamente conhecidos. Recentemente, foi demonstrado que o GM1 aumenta a quantidade da enzima catalase no SNC por causar vasodilatação, e sugeriu-se que a vasodilatação possa ser responsável pelas suas propriedades neuroprotetoras. Contudo, o mecanismo pelo qual o GM1 causa vasodilatação não foi determinado. Dado o papel central do óxido nítrico (NO), bem como de canais de potássio no controle do tonus do músculo liso, o objetivo deste trabalho foi determinar a participação do NO e de canais de K+ na vasodilatação induzida pelo GM1. Primeiramente, avaliamos o efeito da administração de L-NAME (metil éster de NGnitro- L-arginina, 60 mg/kg, i.p.), um inibidor da enzima óxido nítrico sintase (NOS), na vasodilatação cerebral induzida pelo GM1 (50 mg/kg, i.p.) em ratos Wistar machos adultos. Verificamos que o L-NAME preveniu o aumento do diâmetro dos vasos cerebrais induzido pelo GM1. Tendo em vista a participação do NO no efeito vasodilatador do GM1, determinamos o conteúdo de nitritos e nitratos (NOx), bem como de hemoglobina (Hb) no hipocampo e no córtex cerebral, 15, 30 e 60 min após a administração de GM1. Observamos um aumento no conteúdo de Hb e uma redução dos níveis de NOx após 60 min. Dado que nitritos e nitratos podem ser removidos in vivo pelo sangue por ligação com a Hb, um possível efeito do GM1 sobre o conteúdo de NOx poderia ser mascarado. No intuito de contornar essa situação, determinamos os níveis de NOx em fatias de córtex cerebral incubadas com GM1 (0, 10, 30 e 100 µM). Verificamos que o GM1 (100 µM) aumentou os níveis de NOx em 30 min e, reduziu o conteúdo em 60 min, sem alterar o conteúdo de Hb. Ainda, mostramos que o L-NAME (100 µM) reverte o aumento de NOx induzida pela incubação com GM1 (100 µM, por 30 minutos) em fatias de córtex cerebral, sem alterar o conteúdo de Hb. Tendo em vista a participação do NO no efeito vasodilatador do GM1, e conhecendo a capacidade de ligação da Hb com o NO, determinamos a via de relaxamento muscular mediada pelo NO em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos. Verificamos que o GM1 causou relaxamento vascular através de uma curva cumulativa de concentrações (10 nM a 3 mM), e também determinamos que a participação do endotélio é fundamental para este efeito. O efeito vasorelaxante do GM1 além de ser dependente da presença do endotélio vascular, é completamente bloqueado pela presença de L-NAME (1 µM), da mesma forma que os resultados encontrados nos experimentos com vasos cerebrais. Considerando que o NO formado no endotélio ativa a guanilato ciclase (GCs), também testamos o efeito do inibidor desta enzima (ODQ-1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one) no efeito vasorelaxante do GM1. Neste caso, o efeito do GM1 foi bloqueado parcialmente pelo ODQ (10 µM). Além da participação da GCs, avaliamos o papel dos canais de K+ no efeito vasorelaxante do GM1. Verificamos que o tetraetilamônio (1 mM), um bloqueador não seletivo, assim como a glibenclamida (10 µM), bloqueador dos canais de K+ sensíveis ao ATP bloquearam parcialmente o efeito do GM1. Por outro lado, a apamina (50 nM), um bloqueador de canais de K+ dependentes voltagem e Ca²+ (KCa) de baixa condutância não alterou o efeito do GM1, enquanto que a caribdotoxina (50 nM), um bloqueador de KCa de alta condutância deslocou a curva de relaxamento para a direita. Em resumo, neste trabalho mostramos a participação do NO e dos canais de K+ na vasodilatação induzida pelo GM1. Embora mais estudos sejam necessários para estabelecer o mecanismo vasodilatador do GM1, sugerimos que uma terapia adjunta com GM1 ou com drogas correlatas é válida em condições clínicas onde o aumento do fluxo sanguíneo é associado a um melhor prognóstico, como doenças vasculares obstrutivas e doenças neurodegenerativas. / Monosialotetra-hexosylganglioside (GM1) is a glycosphingolipid present in most cell membranes which displays antioxidant and neuroprotective properties. Additionally, it has been recently demonstrated that GM1 increases catalase content in the CNS due to vasodilation, and it has been suggested that vasodilation may be responsible, at least in part, for the neuroprotective properties of GM1. However, the mechanisms underlying GM1-induced vasodilation have not been determined. Given the pivotal role of nitric oxide and potassium channels in the control of vascular tonus, we decided to investigate whether these mediators are involved in the vasodilation induced by GM1. Initially, we investigated the effect of L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester, 60 mg/kg, i.p.), an inhibitor of nitric oxide sinthase (NOS), on the cerebral vasodilation induced by GM1 (50 mg/kg, i.p.) in male wistar rats. L-NAME fully prevented the increase in outer diameter of pial vessels induced by GM1. In addition, we investigated the content of stable NO end products, namely, nitrites and nitrates (NOx), as well as the content of the hemoglobin (Hb) in the hipocampus and cerebral cortex 15, 30 and 60 min after GM1 administration. Interestingly, GM1 increased Hb content and decreased NOx content 60 min after administration. Since it has been demonstrated that NO end products like NOx can be removed from brain in vivo by blood flow, a possible effect of GM1 on NOx levels could be masked. Therefore, we decided to investigated the effect of GM1 (0, 10, 30 e 100 µM) on NOx content in slices of cerebral cortex. The incubation of slices with GM1 (100 µM) for 30 min significantly increased NOx levels. In addition, we observed decreased NOx levels after 60 min of incubation, without changes in Hb content. In order to obtain pharmacological evidence for the role of nitric oxide synthase (NOS) in GM1-induced increase of NOx content in situ, cortical slices were incubated with L-NAME (100 µM) in the presence or absence of GM1 (100 µM) for 30 minutes, and the NOx content was measured. L-NAME blunted GM1-induced increase of NOx content. Since it has been demonstrated that GM1 induces pial vessel vasodilation and increases NOx content in cerebral cortex, which are fully prevented by the nitric oxide synthase inhibitor L-NAME, we further investigated whether GM1 relaxes larger vessels, as well as the mechanisms by which GM1 causes vasorelaxation. We found that GM1 (10, 30, 100, 300 µM, 1 and 3 mM) induced vascular relaxation of the rat mesenteric artery, as determined by isometric tension studies in arterial rings contracted with 1 µM phenylephrine. The vasorelaxation induced by GM1 was abolished by endothelium removal, by incubation with LNAME (1 µM) and partially inhibited by the blockade of potassium channels by 1 mM tetraethylammonium, 10 μM glibenclamide, by the soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one (10 µM), and by 50 nM charybdotoxin, a blocker of large and intermediate conductance calcium-activated potassium channels. Moreover, GM1- induced relaxation was not affected by apamin (50 nM), a small conductance calcium-activated potassium channel blocker. Althogether, these results indicate that nitric oxide and potassium channels participate in the vasodilation induced by GM1. Although more studies are necessary to definitely establish the mechanisms underlying the GM1-induced vasodilation, we suggest that vasodilation may underlie some of the biological effects of exogenous GM1 ganglioside and that adjunct therapy with GM1 may be of value in clinical conditions in which increased blood flow is associated to a better prognosis, such as obstructive vascular and neurodegenerative diseases. We found that GM1 (10, 30, 100, 300 µM, 1 and 3 mM) induced vascular relaxation of the rat mesenteric artery, as determined by isometric tension studies in arterial rings contracted with 1 µM phenylephrine. The vasorelaxation induced by GM1 was abolished by endothelium removal, by incubation with LNAME (1 µM) and partially inhibited by the blockade of potassium channels by 1 mM tetraethylammonium, 10 μM glibenclamide, by the soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one (10 µM), and by 50 nM charybdotoxin, a blocker of large and intermediate conductance calcium-activated potassium channels. Moreover, GM1- induced relaxation was not affected by apamin (50 nM), a small conductance calcium-activated potassium channel blocker. Althogether, these results indicate that nitric oxide and potassium channels participate in the vasodilation induced by GM1. Although more studies are necessary to definitely establish the mechanisms underlying the GM1-induced vasodilation, we suggest that vasodilation may underlie some of the biological effects of exogenous GM1 ganglioside and that adjunct therapy with GM1 may be of value in clinical conditions in which increased blood flow is associated to a better prognosis, such as obstructive vascular and neurodegenerative diseases.

A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa cuja patogenia não é completamente elucidada. Atribui-se ao peptídeo beta-amilóide (A ), em sua forma oligomérica ou fibrilada, um importante papel neste processo. Uma vez que a produção e a fibrilação do peptídeo ocorrem ao nível de membrana neural, sua dinâmica e composição lipídica podem modular a cascata amilóide e/ou interferir na extensão do dano gerado pela mesma. Tendo isto em vista e considerando o potencial sinalizatório dos glicoesfingolipídios, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do peptídeo betaamilóide (A 25-35), em sua forma fibrilada ou não-fibrilada, sobre a biossíntese dos gangliosídios em modelo de cultura organotípica de hipocampo. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar de 6-8 dias, dos quais o hipocampo foi dissecado, fatiado e submetido à cultura. No 28º dia de cultura foi adicionado A 25- 35 (25μM), em sua forma fibrilada ou não fibrilada; após 24h adicionou-se ao meio D- [1-14C]-galactose para avaliar a biossíntese dos gangliosídios; no 30º dia a morte celular foi analisada com iodeto de propídio. A partir das fatias, os gangliosídios radiomarcados foram extraídos, purificados, analisados por HPTLC, fluorografia e densitometria. Nossos resultados demonstraram uma alteração na biossíntese de gangliosídios induzida pelo peptídeo beta-amilóide A 25-35, um efeito que foi dependente de seu estado de fibrilação. Desta maneira, o A 25-35, em sua forma fibrilada, promoveu um aumento na biossíntese de GM3 e uma redução na biossíntese de GD1b, ao passo que o peptídeo não fibrilado levou a um aumento na síntese do gangliosídio GM1. Uma vez que o GM3 é considerado um gangliosídio apoptótico, quando expresso em neurônios adultos, um aumento em sua síntese pode estar relacionado aos eventos tóxicos desencadeados pelo peptídeo beta-amilóide fibrilado. O GM1, por sua vez, ainda não possui um papel suficientemente claro no desenvolvimento da doença de Alzheimer. Uma série de efeitos neuroprotetores são atribuídos a este gangliosídio enquanto fortes evidências sugerem que o GM1 poderia acelerar o processo de fibrilação do beta-amilóide, e assim influenciar a progressão da doença. A fim de investigar o papel do GM1 no presente modelo, realizamos uma série de experimentos com a finalidade de avaliar uma possível ação neuroprotetora deste gangliosídio. Como resultado, um pré-tratamento das fatias hipocampais com GM1(10μM) foi capaz de prevenir a toxicidade induzida pelo peptídeo beta-amilóide em sua forma fibrilada, como demonstram os resultados da captação de iodeto de propídio. Com o intuito de corroborar sua ação neuroprotetora, bem como investigar o mecanismo pelo qual esta neuroproteção seria mediada, analisamos o efeito de um tratamento com GM1 (1h, 6h, 12h ou 24h) sobre as alterações induzidas pelo peptídeo beta-amilóide no estado de fosforilação (ativação/inativação) da GSK3b. Nossos resultados demonstraram um importante efeito neuroprotetor do GM1 após 24 horas de tratamento, uma vez que nestas circunstâncias este gangliosídio foi capaz de reverter a ativação (defosforilação) da GSK3b, uma via de sinalização associada à morte celular programada. Como conclusão, nossos resultados dão suporte a participação dos gangliosídios em modelos de doença de Alzheimer, e sugerem uma ação neuroprotetora do gangliosídio GM1 frente à toxicidade induzida pelo beta-amilóide, o que, no futuro, pode ser explorado como uma alternativa terapêutica ao tratamento do Alzheimer. / Alzheimer disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose pathogenesis is still poorly understood. It is attributed to beta-amyloid peptide, in its fibrillar or nonfibrillar forms, an important role in the disease development and progression. Once the production and fibrillation of beta-amyloid peptide occurs on the neural membrane surface, the lipid dynamic and composition of these membranes could modulate amyloid cascade and/or interfere in the damage triggered by it. Taking this into account, and considering the potential signalling role of glycosphingolipids, the objective of this study was to investigate the effect of fibrillar and non-fibrillar beta-amyloid peptide (Ab25-35) upon ganglioside biosynthesis in a model of organotypic hippocampal culture. In order to do this, we used 6-8 days old Wistar rats, whose hippocampi were dissected, sliced and subjected to culture. On the 28th in vitro day, A 25-35 (25μM) was added to the culture medium, in its fibrillar or non-fibrillar forms. After 24h incubation, D-[1-C14]-galactose was added to the medium with the purpose of labeling ganglioside; on day 30th in vitro day cell death was analyzed by PI uptake. The radiolabeled gangliosides were extracted from the hippocampal slices, purified, and analyzed by HPTLC, fluorography and densitometry. Our results demonstrated an Ab25-35 induced alteration in ganglioside biosynthesis, an effect which seemed to be dependent on the peptide fibrillation state. Furthermore, the fibrillar Ab25-35 caused an increase in GM3 and a reduction in GD1b biosynthesis, whereas the non-fibrillar form of this peptide was able to enhance the synthesis of GM1 ganglioside. Once GM3 is an apoptotic ganglioside, when expressed in adult neurons, an increase in its synthesis could take part of the toxic events triggered by the fibrillar betaamyloid peptide. GM1, in turn, has a still poorly understood participation in Alzheimer development. A sort of neuroprotective effects are attributed to this ganglioside while several evidences suggest that GM1 could accelerate the endogenous fibril formation, and thence influence the disease progression. To further investigate the role of GM1 ganglioside in our model, we have performed some experiments in order to test a possible neuroprotective effect of this gangliosides. As a result, a pre-treatment of the hippocampal slices with 10μM GM1 was able to prevent the toxicity triggered by the fibrillar beta-amyloid peptide, when measured by PI uptake protocol. In order to corroborate its neuroprotective action, as well as to investigate a candidate mechanism by which GM1 could promote neuroprotection, we have analyzed the effect of GM1 treatment (1h, 6h, 12h and 24h) upon the amyloid-induced alterations in GSK3b phosphorylation/dephosphorylation state. Our results demonstrated an important effect of GM1 after 24h incubation, once it was able to reverse the amyloid-induced dephosphorilation (activation) of GSK3b, a signalling pathway involved in apoptosis triggering. Taken together, our results provides new and important support for the ganglioside participation in Alzheimer models, and suggests a protective role of GM1 upon the amyloid induced toxicity, which, in the future, could expand the therapeutic strategy available for Alzheimer disease treatment.

O monossialotetra-hexosilgangliosídeo (GM1) é um glicoesfingolipídio presente nas membranas celulares que exerce propriedades antioxidantes e neuroprotetoras. Os mecanismos neuroquímicos envolvidos na neuroproteção induzida pelo GM1 não são completamente conhecidos. Recentemente, foi demonstrado que o GM1 aumenta a quantidade da enzima catalase no SNC por causar vasodilatação, e sugeriu-se que a vasodilatação possa ser responsável pelas suas propriedades neuroprotetoras. Contudo, o mecanismo pelo qual o GM1 causa vasodilatação não foi determinado. Dado o papel central do óxido nítrico (NO), bem como de canais de potássio no controle do tonus do músculo liso, o objetivo deste trabalho foi determinar a participação do NO e de canais de K+ na vasodilatação induzida pelo GM1. Primeiramente, avaliamos o efeito da administração de L-NAME (metil éster de NGnitro- L-arginina, 60 mg/kg, i.p.), um inibidor da enzima óxido nítrico sintase (NOS), na vasodilatação cerebral induzida pelo GM1 (50 mg/kg, i.p.) em ratos Wistar machos adultos. Verificamos que o L-NAME preveniu o aumento do diâmetro dos vasos cerebrais induzido pelo GM1. Tendo em vista a participação do NO no efeito vasodilatador do GM1, determinamos o conteúdo de nitritos e nitratos (NOx), bem como de hemoglobina (Hb) no hipocampo e no córtex cerebral, 15, 30 e 60 min após a administração de GM1. Observamos um aumento no conteúdo de Hb e uma redução dos níveis de NOx após 60 min. Dado que nitritos e nitratos podem ser removidos in vivo pelo sangue por ligação com a Hb, um possível efeito do GM1 sobre o conteúdo de NOx poderia ser mascarado. No intuito de contornar essa situação, determinamos os níveis de NOx em fatias de córtex cerebral incubadas com GM1 (0, 10, 30 e 100 µM). Verificamos que o GM1 (100 µM) aumentou os níveis de NOx em 30 min e, reduziu o conteúdo em 60 min, sem alterar o conteúdo de Hb. Ainda, mostramos que o L-NAME (100 µM) reverte o aumento de NOx induzida pela incubação com GM1 (100 µM, por 30 minutos) em fatias de córtex cerebral, sem alterar o conteúdo de Hb. Tendo em vista a participação do NO no efeito vasodilatador do GM1, e conhecendo a capacidade de ligação da Hb com o NO, determinamos a via de relaxamento muscular mediada pelo NO em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos. Verificamos que o GM1 causou relaxamento vascular através de uma curva cumulativa de concentrações (10 nM a 3 mM), e também determinamos que a participação do endotélio é fundamental para este efeito. O efeito vasorelaxante do GM1 além de ser dependente da presença do endotélio vascular, é completamente bloqueado pela presença de L-NAME (1 µM), da mesma forma que os resultados encontrados nos experimentos com vasos cerebrais. Considerando que o NO formado no endotélio ativa a guanilato ciclase (GCs), também testamos o efeito do inibidor desta enzima (ODQ-1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one) no efeito vasorelaxante do GM1. Neste caso, o efeito do GM1 foi bloqueado parcialmente pelo ODQ (10 µM). Além da participação da GCs, avaliamos o papel dos canais de K+ no efeito vasorelaxante do GM1. Verificamos que o tetraetilamônio (1 mM), um bloqueador não seletivo, assim como a glibenclamida (10 µM), bloqueador dos canais de K+ sensíveis ao ATP bloquearam parcialmente o efeito do GM1. Por outro lado, a apamina (50 nM), um bloqueador de canais de K+ dependentes voltagem e Ca²+ (KCa) de baixa condutância não alterou o efeito do GM1, enquanto que a caribdotoxina (50 nM), um bloqueador de KCa de alta condutância deslocou a curva de relaxamento para a direita. Em resumo, neste trabalho mostramos a participação do NO e dos canais de K+ na vasodilatação induzida pelo GM1. Embora mais estudos sejam necessários para estabelecer o mecanismo vasodilatador do GM1, sugerimos que uma terapia adjunta com GM1 ou com drogas correlatas é válida em condições clínicas onde o aumento do fluxo sanguíneo é associado a um melhor prognóstico, como doenças vasculares obstrutivas e doenças neurodegenerativas. / Monosialotetra-hexosylganglioside (GM1) is a glycosphingolipid present in most cell membranes which displays antioxidant and neuroprotective properties. Additionally, it has been recently demonstrated that GM1 increases catalase content in the CNS due to vasodilation, and it has been suggested that vasodilation may be responsible, at least in part, for the neuroprotective properties of GM1. However, the mechanisms underlying GM1-induced vasodilation have not been determined. Given the pivotal role of nitric oxide and potassium channels in the control of vascular tonus, we decided to investigate whether these mediators are involved in the vasodilation induced by GM1. Initially, we investigated the effect of L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester, 60 mg/kg, i.p.), an inhibitor of nitric oxide sinthase (NOS), on the cerebral vasodilation induced by GM1 (50 mg/kg, i.p.) in male wistar rats. L-NAME fully prevented the increase in outer diameter of pial vessels induced by GM1. In addition, we investigated the content of stable NO end products, namely, nitrites and nitrates (NOx), as well as the content of the hemoglobin (Hb) in the hipocampus and cerebral cortex 15, 30 and 60 min after GM1 administration. Interestingly, GM1 increased Hb content and decreased NOx content 60 min after administration. Since it has been demonstrated that NO end products like NOx can be removed from brain in vivo by blood flow, a possible effect of GM1 on NOx levels could be masked. Therefore, we decided to investigated the effect of GM1 (0, 10, 30 e 100 µM) on NOx content in slices of cerebral cortex. The incubation of slices with GM1 (100 µM) for 30 min significantly increased NOx levels. In addition, we observed decreased NOx levels after 60 min of incubation, without changes in Hb content. In order to obtain pharmacological evidence for the role of nitric oxide synthase (NOS) in GM1-induced increase of NOx content in situ, cortical slices were incubated with L-NAME (100 µM) in the presence or absence of GM1 (100 µM) for 30 minutes, and the NOx content was measured. L-NAME blunted GM1-induced increase of NOx content. Since it has been demonstrated that GM1 induces pial vessel vasodilation and increases NOx content in cerebral cortex, which are fully prevented by the nitric oxide synthase inhibitor L-NAME, we further investigated whether GM1 relaxes larger vessels, as well as the mechanisms by which GM1 causes vasorelaxation. We found that GM1 (10, 30, 100, 300 µM, 1 and 3 mM) induced vascular relaxation of the rat mesenteric artery, as determined by isometric tension studies in arterial rings contracted with 1 µM phenylephrine. The vasorelaxation induced by GM1 was abolished by endothelium removal, by incubation with LNAME (1 µM) and partially inhibited by the blockade of potassium channels by 1 mM tetraethylammonium, 10 μM glibenclamide, by the soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one (10 µM), and by 50 nM charybdotoxin, a blocker of large and intermediate conductance calcium-activated potassium channels. Moreover, GM1- induced relaxation was not affected by apamin (50 nM), a small conductance calcium-activated potassium channel blocker. Althogether, these results indicate that nitric oxide and potassium channels participate in the vasodilation induced by GM1. Although more studies are necessary to definitely establish the mechanisms underlying the GM1-induced vasodilation, we suggest that vasodilation may underlie some of the biological effects of exogenous GM1 ganglioside and that adjunct therapy with GM1 may be of value in clinical conditions in which increased blood flow is associated to a better prognosis, such as obstructive vascular and neurodegenerative diseases. We found that GM1 (10, 30, 100, 300 µM, 1 and 3 mM) induced vascular relaxation of the rat mesenteric artery, as determined by isometric tension studies in arterial rings contracted with 1 µM phenylephrine. The vasorelaxation induced by GM1 was abolished by endothelium removal, by incubation with LNAME (1 µM) and partially inhibited by the blockade of potassium channels by 1 mM tetraethylammonium, 10 μM glibenclamide, by the soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one (10 µM), and by 50 nM charybdotoxin, a blocker of large and intermediate conductance calcium-activated potassium channels. Moreover, GM1- induced relaxation was not affected by apamin (50 nM), a small conductance calcium-activated potassium channel blocker. Althogether, these results indicate that nitric oxide and potassium channels participate in the vasodilation induced by GM1. Although more studies are necessary to definitely establish the mechanisms underlying the GM1-induced vasodilation, we suggest that vasodilation may underlie some of the biological effects of exogenous GM1 ganglioside and that adjunct therapy with GM1 may be of value in clinical conditions in which increased blood flow is associated to a better prognosis, such as obstructive vascular and neurodegenerative diseases.

A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa cuja patogenia não é completamente elucidada. Atribui-se ao peptídeo beta-amilóide (A ), em sua forma oligomérica ou fibrilada, um importante papel neste processo. Uma vez que a produção e a fibrilação do peptídeo ocorrem ao nível de membrana neural, sua dinâmica e composição lipídica podem modular a cascata amilóide e/ou interferir na extensão do dano gerado pela mesma. Tendo isto em vista e considerando o potencial sinalizatório dos glicoesfingolipídios, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do peptídeo betaamilóide (A 25-35), em sua forma fibrilada ou não-fibrilada, sobre a biossíntese dos gangliosídios em modelo de cultura organotípica de hipocampo. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar de 6-8 dias, dos quais o hipocampo foi dissecado, fatiado e submetido à cultura. No 28º dia de cultura foi adicionado A 25- 35 (25μM), em sua forma fibrilada ou não fibrilada; após 24h adicionou-se ao meio D- [1-14C]-galactose para avaliar a biossíntese dos gangliosídios; no 30º dia a morte celular foi analisada com iodeto de propídio. A partir das fatias, os gangliosídios radiomarcados foram extraídos, purificados, analisados por HPTLC, fluorografia e densitometria. Nossos resultados demonstraram uma alteração na biossíntese de gangliosídios induzida pelo peptídeo beta-amilóide A 25-35, um efeito que foi dependente de seu estado de fibrilação. Desta maneira, o A 25-35, em sua forma fibrilada, promoveu um aumento na biossíntese de GM3 e uma redução na biossíntese de GD1b, ao passo que o peptídeo não fibrilado levou a um aumento na síntese do gangliosídio GM1. Uma vez que o GM3 é considerado um gangliosídio apoptótico, quando expresso em neurônios adultos, um aumento em sua síntese pode estar relacionado aos eventos tóxicos desencadeados pelo peptídeo beta-amilóide fibrilado. O GM1, por sua vez, ainda não possui um papel suficientemente claro no desenvolvimento da doença de Alzheimer. Uma série de efeitos neuroprotetores são atribuídos a este gangliosídio enquanto fortes evidências sugerem que o GM1 poderia acelerar o processo de fibrilação do beta-amilóide, e assim influenciar a progressão da doença. A fim de investigar o papel do GM1 no presente modelo, realizamos uma série de experimentos com a finalidade de avaliar uma possível ação neuroprotetora deste gangliosídio. Como resultado, um pré-tratamento das fatias hipocampais com GM1(10μM) foi capaz de prevenir a toxicidade induzida pelo peptídeo beta-amilóide em sua forma fibrilada, como demonstram os resultados da captação de iodeto de propídio. Com o intuito de corroborar sua ação neuroprotetora, bem como investigar o mecanismo pelo qual esta neuroproteção seria mediada, analisamos o efeito de um tratamento com GM1 (1h, 6h, 12h ou 24h) sobre as alterações induzidas pelo peptídeo beta-amilóide no estado de fosforilação (ativação/inativação) da GSK3b. Nossos resultados demonstraram um importante efeito neuroprotetor do GM1 após 24 horas de tratamento, uma vez que nestas circunstâncias este gangliosídio foi capaz de reverter a ativação (defosforilação) da GSK3b, uma via de sinalização associada à morte celular programada. Como conclusão, nossos resultados dão suporte a participação dos gangliosídios em modelos de doença de Alzheimer, e sugerem uma ação neuroprotetora do gangliosídio GM1 frente à toxicidade induzida pelo beta-amilóide, o que, no futuro, pode ser explorado como uma alternativa terapêutica ao tratamento do Alzheimer. / Alzheimer disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose pathogenesis is still poorly understood. It is attributed to beta-amyloid peptide, in its fibrillar or nonfibrillar forms, an important role in the disease development and progression. Once the production and fibrillation of beta-amyloid peptide occurs on the neural membrane surface, the lipid dynamic and composition of these membranes could modulate amyloid cascade and/or interfere in the damage triggered by it. Taking this into account, and considering the potential signalling role of glycosphingolipids, the objective of this study was to investigate the effect of fibrillar and non-fibrillar beta-amyloid peptide (Ab25-35) upon ganglioside biosynthesis in a model of organotypic hippocampal culture. In order to do this, we used 6-8 days old Wistar rats, whose hippocampi were dissected, sliced and subjected to culture. On the 28th in vitro day, A 25-35 (25μM) was added to the culture medium, in its fibrillar or non-fibrillar forms. After 24h incubation, D-[1-C14]-galactose was added to the medium with the purpose of labeling ganglioside; on day 30th in vitro day cell death was analyzed by PI uptake. The radiolabeled gangliosides were extracted from the hippocampal slices, purified, and analyzed by HPTLC, fluorography and densitometry. Our results demonstrated an Ab25-35 induced alteration in ganglioside biosynthesis, an effect which seemed to be dependent on the peptide fibrillation state. Furthermore, the fibrillar Ab25-35 caused an increase in GM3 and a reduction in GD1b biosynthesis, whereas the non-fibrillar form of this peptide was able to enhance the synthesis of GM1 ganglioside. Once GM3 is an apoptotic ganglioside, when expressed in adult neurons, an increase in its synthesis could take part of the toxic events triggered by the fibrillar betaamyloid peptide. GM1, in turn, has a still poorly understood participation in Alzheimer development. A sort of neuroprotective effects are attributed to this ganglioside while several evidences suggest that GM1 could accelerate the endogenous fibril formation, and thence influence the disease progression. To further investigate the role of GM1 ganglioside in our model, we have performed some experiments in order to test a possible neuroprotective effect of this gangliosides. As a result, a pre-treatment of the hippocampal slices with 10μM GM1 was able to prevent the toxicity triggered by the fibrillar beta-amyloid peptide, when measured by PI uptake protocol. In order to corroborate its neuroprotective action, as well as to investigate a candidate mechanism by which GM1 could promote neuroprotection, we have analyzed the effect of GM1 treatment (1h, 6h, 12h and 24h) upon the amyloid-induced alterations in GSK3b phosphorylation/dephosphorylation state. Our results demonstrated an important effect of GM1 after 24h incubation, once it was able to reverse the amyloid-induced dephosphorilation (activation) of GSK3b, a signalling pathway involved in apoptosis triggering. Taken together, our results provides new and important support for the ganglioside participation in Alzheimer models, and suggests a protective role of GM1 upon the amyloid induced toxicity, which, in the future, could expand the therapeutic strategy available for Alzheimer disease treatment.

Os gangliosídios são glicoesfingolipídios caracterizados pela presença de ácido siálico em sua estrutura química e por suas altas concentrações nas membranas das células do sistema nervoso, além de desempenharem importantes funções celulares, como diferenciação, comunicação, maturação, plasticidade neuronal, entre outras. A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo, o que torna essa patologia alvo de muitos estudos para o entendimento dos mecanismos desencadeados que levam à morte neuronal, e ao mesmo tempo, com o objetivo de descobrir novos tratamentos farmacológicos. Neste estudo investigamos a ação neuroprotetora dos polifenóis resveratrol e daidzeína associando-a ao efeito destas substâncias sobre o perfil cromatográfico dos gangliosídios. Para isso, foi utilizado um modelo in vitro de privação de oxigênio-glicose (POG) em culturas organotípicas de hipocampo de rato. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com ambos polifenóis diminuiu significativamente a morte celular induzida pela POG. Através da análise do perfil cromatográfico dos gangliosídios, podemos observar uma diminuição de expressão para o gangliosídio GM1 no grupo POG, o que não aconteceu nos grupos POG tratados com os polifenóis. Além disso, os resultados de imuno-histoquímica analisados por microscopia confocal, permitiram visualizar uma maior fluorescência de GM1 localizada na região dos neurônios hipocampais, marcados pela proteína NeuN. Portanto, esses resultados sugerem que a ação neuroprotetora dos polifenóis possa ocorrer através da expressão do gangliosídio GM1 em neurônios hipocampais, prevenindo desta forma, a morte celular. / The gangliosides are glycosphingolipids characterized by the presence of sialic acid in their chemical structure and by their high concentrations in the nervous system cell membranes. Besides this, they have important cellular functions such as differentiation, communication, maturation, neuronal plasticity among others. Cerebral ischemia is one of the main causes of morbidity and mortality worldwide, making this disease the subject of many studies to understand the mechanisms that trigger the neuronal death. At the same time, the discovery of drugs that target these mechamisms could lead to new pharmacological treatments. We investigated the neuroprotective action of the polyphenols resveratrol and daidzein associating it to their effect on the chromatographic profile of gangliosides. For this, we used an in vitro model of oxygen-glucose deprivation (OGD) in organotypic cultures of rat hippocampus. Our results demonstrated that treatment with both polyphenols significantly decreased cell death induced by OGD. Through analysis of the chromatographic gangliosides profile, a decrease of GM1 ganglioside expression in OGD group was observed, which did not happen in the OGD groups treated with polyphenols. Furthermore, immunohistochemistry analysis by confocal microscopy, showed a greater GM1 fluorescence located in the region of hippocampal neurons, marked by NeuN protein. These results suggest that the polyphenols neuroprotective action may occur at the level of GM1 ganglioside expression in hippocampal neurons and may prevent cellular death.

O monossialogangliosídeo (GM1) é um glicoesfingolipídio presente na maioria das membranas celulares que possui propriedades antioxidantes e neuroprotetoras. O GM1 protege o sistema nervoso central de vários agentes ou condições neurotóxicas, como exposição ao ácido aspártico, MPTP, ácido glutâmico, metilmalônico e glutárico, anóxia e isquemia, doença de Parkinson e Alzheimer. Os mecanismos neuroquímicos envolvidos na neuroproteção induzida pelo GM1 não são completamente conhecidos, mas a variedade de situações em que ele tem efeito neuroprotetor sugere que o GM1 interage com uma via comum, envolvida no desenvolvimento de dano celular, como o estresse oxidativo. A catalase (EC 1.11.1.6) é uma enzima antioxidante intracelular que catalisa a reação do peróxido de hidrogênio à água e oxigênio molecular, e é particularmente abundante nos eritrócitos, onde metaboliza cerca de 90% do peróxido de hidrogênio. Devido à sua baixa expressão no cérebro, ela tem sido considerada uma enzima secundária no controle dos radicais livres neste órgão. Contudo, alguns autores argumentam que, devido à sua baixa atividade ela seria um ponto de vulnerabilidade no metabolismo das espécies reativas no sistema nervoso central. Neste estudo, investigamos o efeito do GM1 sobre a atividade da catalase ex vivo e in vitro. Além disso, avaliamos o efeito da remoção dos eritrócitos dos vasos sanguíneos cerebrais, sobre a atividade da catalase, com a finalidade de estimar a contribuição da catalase eritrocitária para o aumento da catalase cerebral induzida por GM1. Nós também avaliamos se o GM1 altera o conteúdo de hemoglobina nas amostras cerebrais e a espessura dos vasos sanguíneos cerebrais. Os animais receberam duas injeções de GM1 (50 mg/kg, i.p.) ou salina (0.9 % NaCl, 1 ml/kg, i.p.), em 24 h. Trinta minutos após a segunda injeção, eles foram sacrificados por decapitação e seus cérebros foram removidos e usados nos ensaios bioquímicos. A atividade da catalase e o conteúdo de hemoglobina foram analisados no hipocampo, córtex e estriado de ratos. A administração de GM1 aumentou a atividade da catalase e o conteúdo de hemoglobina nas amostras cerebrais, mas não teve efeito sobre a catalase sanguínea. Esses efeitos foram abolidos pela perfusão transcardíaca com solução salina heparinizada. Calculamos a atividade da catalase cerebral na ausência de eritrócitos por regressão linear, utilizando os dados dos animais perfundidos e não-perfundidos, e não foi observada alteração pelo tratamento com GM1. Além disso, a adição de GM1 (100 – 1000 μM) não aumentou a atividade da catalase em fatias de córtex cerebral in vitro, sugerindo que a integridade do sistema vascular é requerida para o efeito facilitatório sobre a atividade da catalase pelo GM1. O efeito vasodilatador do GM1 foi confirmado in vivo, pois a injeção sistêmica de GM1 (50 mg/kg, i.p.) aumentou (1.5-2.5 vezes) a espessura dos vasos sanguíneos cerebrais de pequeno diâmetro. Neste estudo, nós mostramos que a vasodilatação está envolvida no aumento da atividade da catalase cerebral induzida pelo GM1. Nós sugerimos que a atividade da catalase eritrocitária tem papel antioxidante no sistema nervoso central, e que uma terapia adjunta com GM1 é válida em condições clínicas onde o aumento do fluxo sanguíneo é associado a um melhor prognóstico, como doenças vasculares obstrutivas e doenças neurodegenerativas. / Monosialoganglioside (GM1) is a glycosphingolipid present in most cell membranes that has antioxidant and neuroprotective properties. GM1 protects the central nervous system against various neurotoxic agents or conditions, such as aspartic acid, MPTP, glutamic acid, methylmalonic acid and glutaric acid exposure, anoxia and ischemia, Parkinson’s and Alzheimer’s diseases. The neurochemical mechanisms underlying GM1-induced neuroprotection are not completely known, but the wide range of situations in which GM1 is neuroprotective suggests that it may interact with common pathways involved in the development of cell injury, such as oxidative stress. Catalase (EC 1.11.1.6) is an intracellular antioxidant enzyme that catalyzes the reaction of hydrogen peroxide to water and molecular oxygen, and is particularly enriched in erythrocytes, where it metabolizes 90% of the hydrogen peroxide. Due to its poor expression in the brain, catalase has been considered a secondary enzyme in controlling free radical-induced damage in this organ. In the present study we evaluated the effect of GM1 on cerebral catalase activity ex vivo and in vitro. Moreover, the effect of erythrocyte removal on cerebral catalase activity of control and GM1-treated animals was also evaluated, in order to estimate the contribution of erythrocyte-derived catalase for the increase of catalase activity in the brain induced by the systemic injection of GM1. In addition, we investigated whether GM1 alters the content of hemoglobin in cerebral samples and the width of pial vessels of rats. Animals received two injections of GM1 (50 mg/kg, i.p.) or saline (0.9 % NaCl, 1 ml/kg, i.p.), spaced 24 h apart. Thirty minutes after the second GM1 or saline injection, they were sacrificed by decapitation and their brains were rapidly removed and used for biochemical assays. Catalase activity and content of hemoglobin were analyzed in hippocampus, cortex and striatum and blood of rats. GM1 administration increased catalase activity and hemoglobin content in brain samples, but had no effect on blood catalase activity. GM1-induced increase of catalase activity and the content of hemoglobin were abolished by transcardiac perfusion with heparinized ice-cold saline. Brain catalase activity in the absence of erythrocytes, estimated by regression analysis of data from perfused and non-perfused animals, was not altered by the systemic injection of GM1. Moreover, the addition of GM1 (100 – 1000 μM) did not increase catalase activity in slices of cerebral cortex in vitro, further suggesting that an intact vascular system is required for the facilitatory effect of GM1 on brain catalase activity. The vasodilatory effect of GM1 was confirmed in vivo, since the systemic injection of GM1 (50 mg/kg, i.p.) increased (1.5-2.5 times) the width of pial vessels. In summary, in this study we showed that vasodilation underlies the GM1- induced increase of catalase activity in brain homogenates. We suggest that erythrocyte catalase activity may play an important antioxidant role in the central nervous system, and that the adjunct therapy with GM1 may be of value in clinical conditions in which increased blood flow is associated to a better prognosis, such as obstructive vascular and neurodegenerative diseases.