Objetivando aferir uma possível relação entre a contaminação de fontes aquáticas com o manejo de animais, o presente estudo buscou detectar a presença de rotavírus em amostras de fezes bovinas e águas coletadas nos municípios de Rolante, Riozinho e Taquara, no Rio Grande do Sul. Nestas localidades, pertencentes ao Vale do Paranhana, foram coletadas 104 amostras de água de diferentes origens, incluindo água de torneira, açude, poço cavado, poço artesiano, arroio, rio e vertente. As coletas de água foram realizadas nas proximidades das propriedades rurais e nas mesmas. Além disso, foram coletadas 38 amostras de fezes bovinas em propriedades de gado de leite. As amostras de água foram submetidas a um processo de concentração de partículas virais e o RNA foi extraído seguindo metodologia padronizada. Para detecção de RNA genômico, foi empregada a reação de transcriptase reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) tendo como alvo o gene mais conservado dos rotavírus, codificante da proteína VP6. Para avaliar a presença de vírus infeccioso, as amostras foram inoculadas em células MA-104, HEp-2 e CRIB. Das amostras de água, 25 (24%) continham genoma de rotavírus, sendo 8,6% amostras do município de Rolante, 4,8% de Riozinho e 10,6% amostras coletadas em Taquara. Estas 25 amostras contendo genoma viral foram subsequentemente submetidas ao isolamento em cultivos celulares, em nenhuma delas foi observado efeito citopático característico de rotavírus (CPE). A extração de RNA desses cultivos, após três passagens consecutivas, não revelou a presença de genoma viral. Em relação às amostras de fezes examinadas, em nenhuma delas foi detectada a presença de genoma de rotavírus. Conclui-se que o isolamento, como empregado no presente estudo, não teve sensibilidade suficiente para viabilizar seu uso como técnica para identificar rotavírus como contaminante de águas. Vinte e quatro por cento das amostras de água continham rotavírus, mas sua origem ainda deve ser determinada. / The aim of present study was to assess a possible relationship between the contamination of water sources with animal husbandry in the region. In the localities belonging to Paranhana valley, the municipalities of Taquara, Rolante e Riozinho, were collected 104 water samples from different sources including tap water, ponds, dug wells, boreholes, streams, river and slopes. The water samplings were conducted in the vicinity of farms and on them. In addition, 38 fecal samples were collected from cattle dung from animals on propertie of dairy in Taquara.Water samples were subjected to a process of viral particles concentration and RNA extraction following standard methodology. For genomic RNA detection, were used reverse transcriptase followed by polymerase chain reaction (RT-PCR) targeting the most conserved gene of rotaviruses, gene encoded the viral protein 6 (VP6).To evaluate the presence of infective viruses samples were inoculated on MA-104 cells, HEp-2 and CRIB. Of all water samples, 25 (24%) contained genome of rotavirus, 8,66% samples from Rolante, 4,81% samples from Riozinho and 10, 59 samples collected on Taquara. The 25 samples containing viral genome which all were subsequently subjected to isolation in cultured cells, none were observed cytopathic effect typical of rotavirus (CPE). RNA extraction of these inoculations after three consecutive passages did not reveal the presence of rotavirus genomes. Regarding the stool samples, none were detected presence of rotavirus genome. Viral isolation, as used in this study did not have sufficient sensitivity to enable its use as a technique for rotavirus identification as water contamination.

O objetivo deste trabalho foi caracterizar astrovírus em amostras fecais coletadas de crianças com e sem diarréia, em São Paulo, Brasil, e divididas em dois grupos, EPM e HU, de acordo com a origem. A detecção foi realizada utilizando-se RT-PCR, com primers específicos. Os resultados para as amostras EPM mostram que 66/234 (28,2%) foram positivas para astrovírus. Para as amostras HU, 18/187 (9,6%) foram positivas. A genotipagem foi realizada com a técnica de nested/RT-PCR. De 66 amostras positivas (EPM), 19 (28,7%) foram caracterizadas como HAstV-1, 4 (6,0%) como HAstV-2, 2 (3,0%) como HAstV-3, 1 (1,5%) como HAstV-5 e 3 (4,5%) como HAstV-8. Das 18 positivas do HU, 1 (5,5%) amostra foi caracterizada como HAstV-1, 7 (38,8%) como HAstV-2 e 1 (5,5%) como HAstV-8. As amostras genotipadas em ambos os grupos foram submetidas ao seqüenciamento de nucleotídeos para confirmação dos resultados. Detecção e genotipagem de astrovírus em casos de diarréias pediátricas são técnicas são importantes e descrevem como esse vírus está circulando em São Paulo, Brasil. / The purpose of this study was to characterize astrovirus in faecal samples collected from children with and without diarrhea in São Paulo city, Brazil, and grouped into two distinct groups, EPM and HU. Detection was carried out using RT-PCR with specific primers. Results for EPM set showed that 66/234 (28,2%) were positive. In the HU set of samples, 18/187 (9,6%) were positive for astrovirus. Genotyping was carried out with nested/RT-PCR. Out of 66 astrovirus positive EPM samples, 19 (28,7%) were characterized as HAstV-1, 4 (6,0%) as HAstV-2, 2 (3,0%) as HAstV-3, 1 (1,5%) as HAstV-5 and 3 (4,5%) as HAstV-8. Among 18 astrovirus positive HU samples, 1 (5,5%) was characterized as HAstV-1, 7 (38,8%) as HAstV-2 and 1 (5,5%) as HAstV-8. Genotyped samples were confirmed by nucleotide sequencing. Detection and genotyping of astrovirus in pediatric diarrhea are important and describes how this virus is circulating in São Paulo, Brazil.

De um total de 187 amostras fecais coletadas no ambulatório do Hospital Universitário/USP, entre 1994 a 1996, 54 (28,9%) foram positivas para rotavírus. Entre as amostras caracterizadas por EGPA foram identificados nove perfis eletroforéticos longos, dois curtos e um tipo não usual. O subgrupo II e o sorotipo G2 foram os mais freqüentemente identificados. Foram caracterizadas três amostras com misturas de sorotipos. As amostras positivas e mais 163 amostras, coletadas em um laboratório particular, em 2000, foram genotipadas. Os genótipos G2P[4] e G1P[8] foram os mais freqüentes nos anos de 1994-1996 e G1P[8] e G9P[8], os mais freqüentes em 2000. Os genótipos G3 e G4 foram detectado em menor freqüência. No HU, 20 (38,5%) amostras foram caracterizadas como misturas de genótipos G e 16 (29,6%), como misturas de genótipos P; não foram identificadas misturas em 2000. Dezoito amostras foram caracterizadas como P[10] por RT-PCR mas a análise da seqüência de nucleotídeos mostrou uma homologia de 90,7 a 98,0% com a amostra padrão P[8]. / From 187 fecal samples collected from outpatients at Hospital Universitário (HU)/ USP, between 1994 to 1996, 54 (28,9%) were positive for rotavirus. Positive samples were submitted to electropherotyping, subgrouping, and G serotype. Electropherotypes were characterized as nine different long genome profiles, one short and one unusual profile. Subgroup II and G2 serotype were the most frequently found and three samples showed mixed serotypes. Rotavirus samples and an additional 163 positive fecal samples, collected in a private laboratory in 2000, were G and P genotyped. Genotypes G2P[4] and G1P[8] were the most frequently found in 1994-1996 and, in 2000, G1P[8] and G9P[8] were the most frequent. Genotype G3 and G4 were detected as minor strains in both years. For HU, G genotype mixtures were found in 20 (38.5%) samples and P mixtures were found in 16 (29.6%). No mixtures were identified in 2000. Nucleotide sequencing and phylogenetic analysis of 18 P[10] samples by RT-PCR showed 90.7 to 98.0% homology with the P[8] prototype.

As gastroenterites ainda são um importante problema de saúde pública nos países em desenvolvimento e as Escherichia colí são as principais causas de diarréias. Adultos brasileiros apresentam anticorpos reativos com E. colí enteropatogênica (EPEC), que apresenta muitas semelhanças com E. colí enterohemorágica (EHEC) e pode ser responsável por complicações como a síndrome hemolítica urêmica e a colite hemorrágica. Ambas as bactérias apresentam um mecanismo patogênico comum: a formação da lesão \"attaching and effacing\" nos microvilus dos enterócitos, mediadas por fatores de virulência, como Intimina, Tir e as Esps. Os lipopolissacarídeos (LPS) são componentes da membrana externa das bactérias gram-negativas, incluindo E. colí. A infecção por EHEC 0157 resulta na produção de anticorpos séricos antiLPS 0157, que geralmente são indicativos de infecção recente. Neste trabalho, nós investigamos a presença de anticorpos séricos IgG e IgM anti-EHEC 0157:H7, EHEC 0111:H- e EPEC 0111:H- em adultos brasileiros, da Grande São Paulo. Amostras de soro foram coletadas de 200 adultos saudáveis, doadores de sangue, e um pool foi formado com 100 amostras. Anticorpos foram determinados em 100 amostras individuais por ELlSA com bactérias íntegras e anti-LPS para a determinação de anticorpos específicos anti-LPS 0111 e 0157 com o \"pool\" de soro como controle, em relação às concentrações de IgG e IgM totais determinadas simultaneamente. Os resultados foram submetidos a análise estatística. O repertório de anticorpos IgG e IgM para as três bactérias foi investigado por \"immunoblotting\" (18). A presença de anticorpos anti-bacterianos e anti-LPS foi confirmada. Existe uma correlação positiva entre os anticorpos reativos com as três bactérias, e entre os anticorpos anti-bactéria e anti-LPS. As concentrações de IgM anti-LPSs foi mais alta que IgG, o que está de acordo com o mecanismo imune esperado para um antígeno timo-independente. As concentrações de anti-LPS 0157 foram altas, apesar da baixa freqüência da bactéria 0157 em nosso meio. Os ensaios de 18 mostraram anticorpos reativos com bandas antigênicas sugestivas de fatores de virulência. A origem destes em nossa população poderia ser o contato com bactérias da microbiota ou do ambiente, de animais ou alimentos. Alternativamente, nossa população pode estar exposta à EHEC mais freqüentemente do que imaginado até agora. / Gastroenteritis is still an important public health problem in developing countries and Escherichia coli are frequent agents of diarrhea. Brazilian adults present antibodies reactive with the principal virulence factors of enteropathogenic E. coli (EPEC), which have many genetic and antigenic similarities with enterohemorrhagic E. coli (EHEC), that may be responsible for complications following diarrhea, as haemolytic uremic syndrome (HUS) and hemorrhagic colitis (HC). Both bacteria present a common pathogenic mechanism, with the formation of “attaching and effacing” lesion in microvilis’ enterocytes, mediated by virulence factors codified by the patogenicity island LEE, as Intimin, Tir e Esps. Lipopolysaccharides (LPS) are components of outer membrane and important virulence factors of Gram-negative bacteria including E. coli. The infection with EHEC O157 results in the production of serum antibodies to the O157 LPS antigens, and usually they are indicators of recent infection. In this work we investigated IgG and IgM serum antibodies reactive with EHEC O157:H7, EHEC O111:H- and EPEC O111:H- antigens in healthy Brazilian adults, living in São Paulo. Serum samples were collected from 200 healthy adults (blood donors) and a pool was formed with 100 samples. The antibody levels were determined by ELISA for 100 individual serum samples by means of a whole cell ELISA with the three bacteria and an anti-LPS ELISA for the determination of the concentrations of specific antibodies anti-LPS O111 and O157, using the serum pool as control, in relation to the total IgG and IgM concentrations determined simultaneously. The results were submitted to statistical analysis. The repertoire of IgG and IgM antibodies to the three bacteria was investigated by immunoblotting (IB). The presence of anti-bacterial and anti-LPS seric antibodies was confirmed. There is a positive correlation between the titers of antibodies reactive with the three bacteria and between anti-bacteria and anti-LPS antibodies. The concentrations of IgM anti-LPSs were significantly higher than IgG, which is in accordance with the immune mechanism expected to a thymus-independent antigen. Surprisingly the concentrations of anti-LPS O157 were high taking into account the low frequency of O157 bacteria isolation in our country. The IB assays showed the presence of antibodies, mainly IgG, reactive with many antigenic bands suggestive of virulence factors. The origin of anti-EHEC antibodies in our population could be the contact with microbiota or environment bacteria, and animal or human E. coli strains, pathogenic or not. Alternatively, our people may be exposed to EHEC more frequently than previously thought.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Acute diarrhea is one of the most common infectious diseases and still one of the leading causes of morbidity and mortality in the pediatric world, a global public health problem. Several efforts have been made over the years to reduce infant mortality, despite the commitment of diarrhea still occupy a significant space of malnutrition in children under 5 years. A wide spectrum of enteric pathogens can cause acute childhood diarrhea, among which we can mention Rotavirus, Norovirus and Cryptosporidium spp. Rotavirus is one of the most important. Currently two live attenuated live Rotavirus vaccines have been licensed and are available globally: a human monovalent strain (RV1) (Rotarix®, GlaxoSmithKline Biologicals) and a pentavalent bovine-human rearrangement (RV5) (Rotateq®). Brazil was one of the first countries to integrate the vaccine into its national immunization program (2006), and it was possible to observe significant improvements in reducing infant mortality and hospitalizations for diarrheal diseases in children from Rotavirus. However, diarrhea continues to be a serious health problem, and can be avoidable and treatable. Several etiological agents may be related to these intestinal infections and deserve to be investigated. The objective of this study was to verify the presence of the three etiological agents Cryptosporidium spp., Rotavirus and Norovirus, associated with diarrhea in children aged 0 to 11 years old, attended at Sergipe Emergency Hospital (HUSE). The samples were tested by Elisa for Cryptosporidium spp and Rotavirus for fecal antigen detection and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for Norovirus detection. A total of 92 diarrheic stool specimens were analyzed, of which 62% were positive for one of the pathogens studied, 49% positive for Norovirus, 10% for Rotavirus, 4% for Crysptoporidium spp and 37% of diarrheal samples were not positive for any enteropathogen studied. Norovirus was the main cause of childhood diarrhea in the period studied, with predominance (98%) of the GII genotype. The most affected age group were children younger than 24 months. Infections have shown similar symptoms. Complementary studies are needed to discover other etiological agents involved in gastroenteritis in the State of Sergipe, since a significant number of children with diarrhea did not present positivity to any of the pathogens studied. / A diarreia aguda é uma das doenças infecciosas mais comuns e ainda uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo pediátrico, um problema global de saúde pública. Diversos esforços vêm sendo realizados no decorrer dos anos para redução da mortalidade infantil, apesar do empenho as diarreias ainda ocupam um significativo espaço da desnutrição em menores de 5 anos. Um amplo espectro de patógenos entéricos pode provocar a diarreia infantil aguda, dentre esses podemos citar os Rotavírus, Norovírus e Cryptosporidium spp, sendo o Rotavírus um dos mais importantes. Atualmente duas vacinas orais contra o Rotavírus, de vírus vivos atenuados foram licenciadas e estão disponíveis globalmente: uma cepa monovalente humana (RV1) (Rotarix®, GlaxoSmithKline Biologicals) e um rearranjo bovino-humano pentavalente (RV5) (Rotateq®). O Brasil foi um dos primeiros países a integrar a vacina em seu programa nacional de imunizações (2006), e foi possível observar melhorias significativas na redução da mortalidade infantil e nas hospitalizações por doenças diarreicas em crianças decorrentes de Rotavírus. No entanto, as diarreias continuam sendo um grave problema de saúde, podendo ser evitável e tratável. Diversos agentes etiológicos podem estar relacionados a essas infecções intestinais e merecem ser investigados. O objetivo desse estudo foi verificar a presença dos três agentes etiológicos Cryptosporidium spp., Rotavírus e Norovírus, associados aos quadros de diarreia aguda em crianças de 0 a 11 anos atendidas no Hospital de Urgência de Sergipe (HUSE). As amostras foram testadas por Elisa para Cryptosporidium spp e Rotavírus, para detecção de antígenos nas fezes, e reação de cadeia em polimerase após transcrição reversa (RT-PCR) para detecção de Norovírus. Foram analisadas 92 amostras de fezes diarreicas das quais 62% apresentaram positividade para um dos patógenos estudados, 49% positivos para Norovírus, 10% para Rotavírus, 4% para Crysptoporidium spp e 37% das amostras diarreicas não apresentaram positividade para nenhum enteropatógeno estudado. Norovírus foi o principal causador da diarreia infantil no período estudado, com predominância (98%) do genótipo GII. A faixa etária mais acometida foi de crianças menores de 24 meses. As infecções demonstraram sintomas semelhantes. Estudos complementares são necessários para descobrir outros agentes etiológicos envolvidos em gastroenterites do Estado de Sergipe, visto que uma quantidade significativa de crianças com diarreia não apresentou positividade para nenhum patógeno estudado. / São Cristóvão, SE

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thiago Mariani.pdf: 242649 bytes, checksum: a75685740b7af91a43aa27e9d0a87b10 (MD5) Previous issue date: 2013-04-24 / We investigated the risk factors to the excretion of Escherichia coli in a population of 149 dogs with and without clinical gastroenteritis profile attended and kept under internment in the Hospital Veterinário do Centro Universitário da Grande Dourados - Unigran Dourados, MS, from July of 2010 to July of 2011. The investigation was carried out through the analysis of the medical records, of the fecal culture and the results of the antibiograms. From the 149 evaluated cases, 28% (42 isolated lineages) showed positive isolation for E. coli. From the 42 isolated lineages, 20 were from dogs with diarrhea and 22 from non diarrheal dogs. Among the risk factors associated to the fecal excretion of E. coli just the feeding was significant (p<0.05), throughout the observation of dogs which consumed human food showed 2.27 times more chances to excrete the agent. From the analysis of the antibiograms we elaborated a resistance phenotype with predominance of resistant lineages to amoxicillin, ampicillin, azithromycin, sulfonamides and tetracyclines. The phenotypes data for sensibility and resistance to enrofloxacin and ciprofloxacin were concordant in 41 (97.6%) from the 42 isolated. Similar data were observed to ampicillin and amoxicillin, that showed concordant results to 40 (95.2%) from 42 isolated. We concluded that hospitalized dogs can excrete E. coli multiresistant to the environment. / Foram investigados os fatores de risco para excreção de Escherichia coli em uma população de 149 cães com e sem quadro de gastroenterite atendidos e mantidos sob internação no Hospital Veterinário do Centro Universitário da Grande Dourados - Unigran Dourados/MS, no período de julho de 2010 a julho de 2011. A investigação se deu através da análise dos prontuários, das culturas fecais e do resultado dos antibiogramas. Dos 149 casos avaliados, 28% (42 linhagens isoladas) apresentaram isolamento positivo para E.coli. Das 42 linhagens isoladas, 20 foram provenientes de cães com diarréia e 22 de cães não diarréicos. Entre os fatores de risco associados a excreção fecal de E. coli apenas a alimentação fora significativa (p<0,05), através da observação de que cães que consumiam comida humana apresentaram 2,27 vezes mais chances de excretar o agente. A partir da análise dos antibiogramas elaborou-se um fenótipo avaliando os perfis de resistência. Observou-se 26 padrões fenotípicos de resistência com predominância das linhagens resistentes a amoxicilina, ampicilina, azitromicina, sulfonamidas e tetraciclinas. Os dados fenotípicos para sensibilidade e resistência frente ao enrofloxacino e ciprofloxacino foram concordantes em 41 (97,6%) dos 42 isolados. Dados similares foram observados para a ampiclina e amoxicilina, que apresentaram resultados concordantes para 40 (95,2%) dos 42 isolados. Concluiu-se que cães hospitalizados podem excretar E. coli multirresistente para o ambiente.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thiago Mariani.pdf: 242649 bytes, checksum: a75685740b7af91a43aa27e9d0a87b10 (MD5) Previous issue date: 2013-04-24 / We investigated the risk factors to the excretion of Escherichia coli in a population of 149 dogs with and without clinical gastroenteritis profile attended and kept under internment in the Hospital Veterinário do Centro Universitário da Grande Dourados - Unigran Dourados, MS, from July of 2010 to July of 2011. The investigation was carried out through the analysis of the medical records, of the fecal culture and the results of the antibiograms. From the 149 evaluated cases, 28% (42 isolated lineages) showed positive isolation for E. coli. From the 42 isolated lineages, 20 were from dogs with diarrhea and 22 from non diarrheal dogs. Among the risk factors associated to the fecal excretion of E. coli just the feeding was significant (p<0.05), throughout the observation of dogs which consumed human food showed 2.27 times more chances to excrete the agent. From the analysis of the antibiograms we elaborated a resistance phenotype with predominance of resistant lineages to amoxicillin, ampicillin, azithromycin, sulfonamides and tetracyclines. The phenotypes data for sensibility and resistance to enrofloxacin and ciprofloxacin were concordant in 41 (97.6%) from the 42 isolated. Similar data were observed to ampicillin and amoxicillin, that showed concordant results to 40 (95.2%) from 42 isolated. We concluded that hospitalized dogs can excrete E. coli multiresistant to the environment. / Foram investigados os fatores de risco para excreção de Escherichia coli em uma população de 149 cães com e sem quadro de gastroenterite atendidos e mantidos sob internação no Hospital Veterinário do Centro Universitário da Grande Dourados - Unigran Dourados/MS, no período de julho de 2010 a julho de 2011. A investigação se deu através da análise dos prontuários, das culturas fecais e do resultado dos antibiogramas. Dos 149 casos avaliados, 28% (42 linhagens isoladas) apresentaram isolamento positivo para E.coli. Das 42 linhagens isoladas, 20 foram provenientes de cães com diarréia e 22 de cães não diarréicos. Entre os fatores de risco associados a excreção fecal de E. coli apenas a alimentação fora significativa (p<0,05), através da observação de que cães que consumiam comida humana apresentaram 2,27 vezes mais chances de excretar o agente. A partir da análise dos antibiogramas elaborou-se um fenótipo avaliando os perfis de resistência. Observou-se 26 padrões fenotípicos de resistência com predominância das linhagens resistentes a amoxicilina, ampicilina, azitromicina, sulfonamidas e tetraciclinas. Os dados fenotípicos para sensibilidade e resistência frente ao enrofloxacino e ciprofloxacino foram concordantes em 41 (97,6%) dos 42 isolados. Dados similares foram observados para a ampiclina e amoxicilina, que apresentaram resultados concordantes para 40 (95,2%) dos 42 isolados. Concluiu-se que cães hospitalizados podem excretar E. coli multirresistente para o ambiente.

Vibrio cholerae y Shigella dysenteriae, entre otras bacterias enteropatógenas, causan enfermedades gastrointestinales, la segunda causa de muerte en niños menores de cinco años en el mundo. Los sucesos de gastroenteritis que desencadenan dichos microorganismos son mediados por la acción molecular de toxinas secretadas de tipo AB, CTX y STX, respectivamente para V, cholerae y S, dysenteriae. Dichas toxinas causan desbalances iónicos y lisis celular, generando deshidratación, pérdida de electrolitos y nutrientes. El correcto funcionamiento de ambas toxinas requiere una relación estricta de cinco subunidades de la proteína B por cada subunidad A, sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan la expresión y mantienen la relación 5:1 entre las subunidades son poco entendidos. El objetivo de este estudio es analizar la regulación post transcripcional de las toxinas CTX y STX mediante aproximaciones experimentales in vitro y usando reacciones libres de células, en un entorno altamente puro y controlado. Nuestros resultados in vitro indican que CTX se expresa de manera más eficiente que STX. En el caso de CTX, la subunidad B tuvo mayor expresión que A, con una relación cercana a 5:1 como visto en estudios previos realizados in vivo. Por el contrario, STX fue sintetizada con baja eficiencia independientemente de la presencia o ausencia de la región codificantes para STXA, desviándose notablemente de una relación activa de 5 B por cada subunidad A. La adición de ppGpp, molécula implicada en la respuesta al estrés en bacterias, resultó en una ligera disminución de la expresión de ambas toxinas. En conclusión, nuestros resultados indican que la relación de 5 a 1 entre B y A de las toxinas CTX de V. cholerae es regulada durante la síntesis de proteínas. Por el contrario, la ausencia de regulación a nivel transcripcional o traduccional de STX del presente estudio in vitro, fue también observada en estudios in vivo, indicando que en la célula existen otros factores que podrían modular la estequiometría de síntesis. Si bien ambas toxinas, CTX y STX, permanecen a la misma familia de exotoxinas, los resultados del presente estudio indican que la regulación de su expresión difiere ampliamente entre ellas. Los resultados aquí reportados brindan nuevas perspectivas para el desarrollo de moléculas inhibidoras, con especial énfasis en perturbar el ribosoma de V, cholerae, para un desbalance en la síntesis de la toxina CTX y así reducir la patogenicidad de la bacteria. / Vibrio cholerae and Shigella dysenteriae, among other enteropathogenic bacteria, cause gastrointestinal diseases, the second cause of death in children under five years of age in the world. The events of gastroenteritis that trigger these microorganisms are mediated by the molecular action of secreted toxins of type AB, CTX and STX, respectively for V. cholerae and S. dysenteriae. These toxins cause ionic imbalances and cell lysis, generating dehydration, loss of electrolytes and nutrients. The correct functioning of both toxins requires a strict relationship of five subunits of protein B for each subunit A, however, the molecular mechanisms that regulate expression and maintain the 5: 1 ratio between the subunits are poorly understood. The objective of this study is to analyze the post transcriptional regulation of CTX and STX toxins by in vitro experimental approaches and using cell-free reactions, in a highly pure and controlled environment. Our in vitro results indicate that CTX is expressed more efficiently than STX. In the case of CTX, subunit B had greater expression than A, with a ratio close to 5: 1 as seen in previous studies conducted in vivo. In contrast, STX was synthesized with low efficiency regardless of the presence or absence of the region coding for STXA, deviating markedly from an active ratio of 5 B for each subunit A. The addition of ppGpp, a molecule involved in the stress response in bacteria, resulted in a slight decrease in the expression of both toxins. In conclusion, our results indicate that the ratio of 5 to 1 between B and A of CTX toxins of V. cholerae is regulated during protein synthesis. On the contrary, the absence of transcriptional or transcriptional STX regulation of the present in vitro study was also observed in in vivo studies, indicating that the cell may harbor other factors that could modulate the synthesis stoichiometry. Although both toxins, CTX and STX, belong to the same family of exotoxins, the results of the present study indicate that the regulation of their expression differs widely. The results reported here provide new perspectives for the development of inhibitory molecules, with special emphasis on disturbing the ribosome of V. cholerae, to provoke an imbalance in the synthesis of CTX toxin and thus to reduce the pathogenicity of the bacteria. / Tesis

Os norovírus (NV) são uma importante causa de hospitalização infantil. Crianças internadas por gastroenterite por NV (GENV) são consideradas portadoras de diarreia grave. O objetivo desse estudo, realizado na cidade do Rio de Janeiro, Brasil, é descrever as características clínicas e a frequência da diarreia por NV em crianças hospitalizadas, comparando as taxas de detecção de NV em crianças vacinadas e não vacinadas contra rotavírus (Rotarix). Foram coletadas 659 amostras de fezes de igual número de crianças e encaminhadas para análise pela reação em cadeia pela polimerase, precedida de transcrição reversa no período de janeiro de 2004 a dezembro de 2009. O percentual de amostras positivas para os NV foi de 27,3% nesse período. Das 180 amostras positivas para NV, 55% tiveram origem na comunidade (aqCo) e 45% foram de aquisição nosocomial (aqNo). O percentual de GENV nos dois anos anteriores (2004 e 2005) à introdução da vacina Rotarix foi de 28,3%, sendo 11,3% o percentual de amostras aqCo. Nos dois anos posteriores (2008 e 2009), a GENV significou 24,4%, e as amostras aqCo foram 14,9% (p<0,05). Em 647 crianças, 494 não receberam a vacina Rotarix, enquanto 151 crianças receberam, pelo menos, uma dose. O percentual de GENV foi de 23,8% e 39,7%, respectivamente (p<0,05). Apesar do comportamento sazonal dos casos de GENV aqCo, esse fato não teve significância estatística. Das 180 crianças, 61,6% tinham peso &#8804; p10 do NCHS, 82,2% tinham idade &#8804; 5anos. As crianças com idade &#8804; 2 anos foram mais acometidas nos casos de aqCo do que àquelas de aqNo (p<0,05). Foram observados em 82 crianças: vômitos (73,2%), febre (54,9%), tosse (20,7%), coriza (2,2%), sangue nas fezes (8,5%), erupção cutânea (4,9%) e broncoespasmo (7,3%). Houve significância estatística com relação à frequência maior de febre, coriza, tosse e broncoespasmo nas crianças com GENV de aqCo do que naquelas de aqNo (p<0,05). De 69 crianças, 73,9% apresentaram desidratação e, dessas, 76,5% necessitaram de hidratação venosa. Esses dados tiveram significância estatística, representada por maiores percentuais nas crianças com GENV de aqCo do que naquelas de aqNo (p<0,05). Esse estudo demonstra que os NV foram um importante agente etiológico nos casos de gastroenterites em crianças hospitalizadas e responsável por altas taxas de infecções nosocomiais. Estatisticamente, não foi comprovada uma tendência de aumento dos casos de GENV no período do estudo, como também do aumento da frequência de GENV nos anos posteriores em relação aos anos anteriores à introdução da vacina Rotarix no Brasil em 2006. No entanto, houve significância estatística quando foi avaliado o percentual de GENV em crianças hospitalizadas vacinadas e não vacinadas contra RV. Um aumento dos casos de GENV em crianças poderá vir a acontecer nos próximos anos, quando é esperado que um número maior de crianças será vacinado contra RV. Tosse, coriza e broncoespasmo são sintomas que devem ser mais detalhadamente investigados. Estratégias de prevenção contra a disseminação dos NV são condutas importantes em unidades de internação. Uma vacina eficaz contra norovírus pode ser um benefício significativo para reduzir o percentual de crianças hospitalizadas por diarreia. / Noroviruses (NV) are a major cause of infant hospitalization. Children hospitalized for gastroenteritis NV (NVGE) are considered to have severe diarrhea. The purpose of this study, conducted in the city of Rio de Janeiro, Brazil, is to describe the clinical characteristics and frequency of norovirus diarrhea in hospitalized children, comparing the rates of detection of NV in vaccinated and unvaccinated children against rotavirus (RV). We collected 659 fecal samples from equal numbers of children and sent for analysis by polymerase chain reaction, reverse transcription from January 2004 to December 2009. The percentage of samples positive for NV was 27.3% in this period. Of the 180 samples positive for NV, 55% meant source community (Coaq) and 45% of nosocomial acquisition (Noaq). The percentage of NVGE the previous two years (2004 and 2005) the introduction of the vaccine against RV was 28.3% and 11.3% represented the percentage of samples Coaq. In the two subsequent years (2008 and 2009), NVGE meant to 24.4%, and the samples were Coaq 14.9% (p <0.05). In 647 children, 494 received no vaccine against RV while 151 children received at least one dose. The percentage of NVGE was 23.8% and 39.7%, respectively (p <0.05). Despite the seasonal behavior of NVGE aqCo cases, this did not reach statistical significance. Of the 180 children, 61.6% had weight &#8804; p10 NCHS, 82.2% were aged &#8804; 5 years old. Children aged &#8804; 2 years were most affected in cases of Coaq than those of Noaq (p <0.05). Were observed in 82 children: vomiting (73.2%), fever (54.9%), cough (20.7%), coryza (2.2%), blood in stools (8.5%), rash (4.9%) and bronchospasm (7.3%). There was statistical significance with respect to the higher frequency of fever, coryza, coughing and wheezing in children with NVGE of Coaq than those of Noaq (p <0.05). Of 69 children, 73.9% had dehydration and of these, 76.5% required intravenous hydration. These data were statistically significant, represented by the highest percentage of children with NVGE of Coaq than those of Noaq (p <0.05). This study demonstrates that the NV were an important etiologic agent in cases of gastroenteritis in hospitalized children and responsible for high rates of nosocomial infections. Statistically, , it was not shown a tendency to increase in cases of NVGE during the study period, as well as the increased frequency NVGE in later years relative to years prior to the introduction of RV vaccine in Brazil. However, statistical significance was assessed as the percentage of NVGE in hospitalized children vaccinated and unvaccinated against RV. An increase in cases of children in NVGE could happen in the next few years, when it is expected that a greater number of children will be vaccinated against RV. Cough, coryza and wheezing are symptoms that should be further investigated. Strategies for preventing the spread of NV are important conduits in inpatient units. An effective vaccine against norovirus can be a significant benefit to reduce the percentage of children hospitalized for diarrhea.

Os norovírus (NV) são uma importante causa de hospitalização infantil. Crianças internadas por gastroenterite por NV (GENV) são consideradas portadoras de diarreia grave. O objetivo desse estudo, realizado na cidade do Rio de Janeiro, Brasil, é descrever as características clínicas e a frequência da diarreia por NV em crianças hospitalizadas, comparando as taxas de detecção de NV em crianças vacinadas e não vacinadas contra rotavírus (Rotarix). Foram coletadas 659 amostras de fezes de igual número de crianças e encaminhadas para análise pela reação em cadeia pela polimerase, precedida de transcrição reversa no período de janeiro de 2004 a dezembro de 2009. O percentual de amostras positivas para os NV foi de 27,3% nesse período. Das 180 amostras positivas para NV, 55% tiveram origem na comunidade (aqCo) e 45% foram de aquisição nosocomial (aqNo). O percentual de GENV nos dois anos anteriores (2004 e 2005) à introdução da vacina Rotarix foi de 28,3%, sendo 11,3% o percentual de amostras aqCo. Nos dois anos posteriores (2008 e 2009), a GENV significou 24,4%, e as amostras aqCo foram 14,9% (p<0,05). Em 647 crianças, 494 não receberam a vacina Rotarix, enquanto 151 crianças receberam, pelo menos, uma dose. O percentual de GENV foi de 23,8% e 39,7%, respectivamente (p<0,05). Apesar do comportamento sazonal dos casos de GENV aqCo, esse fato não teve significância estatística. Das 180 crianças, 61,6% tinham peso &#8804; p10 do NCHS, 82,2% tinham idade &#8804; 5anos. As crianças com idade &#8804; 2 anos foram mais acometidas nos casos de aqCo do que àquelas de aqNo (p<0,05). Foram observados em 82 crianças: vômitos (73,2%), febre (54,9%), tosse (20,7%), coriza (2,2%), sangue nas fezes (8,5%), erupção cutânea (4,9%) e broncoespasmo (7,3%). Houve significância estatística com relação à frequência maior de febre, coriza, tosse e broncoespasmo nas crianças com GENV de aqCo do que naquelas de aqNo (p<0,05). De 69 crianças, 73,9% apresentaram desidratação e, dessas, 76,5% necessitaram de hidratação venosa. Esses dados tiveram significância estatística, representada por maiores percentuais nas crianças com GENV de aqCo do que naquelas de aqNo (p<0,05). Esse estudo demonstra que os NV foram um importante agente etiológico nos casos de gastroenterites em crianças hospitalizadas e responsável por altas taxas de infecções nosocomiais. Estatisticamente, não foi comprovada uma tendência de aumento dos casos de GENV no período do estudo, como também do aumento da frequência de GENV nos anos posteriores em relação aos anos anteriores à introdução da vacina Rotarix no Brasil em 2006. No entanto, houve significância estatística quando foi avaliado o percentual de GENV em crianças hospitalizadas vacinadas e não vacinadas contra RV. Um aumento dos casos de GENV em crianças poderá vir a acontecer nos próximos anos, quando é esperado que um número maior de crianças será vacinado contra RV. Tosse, coriza e broncoespasmo são sintomas que devem ser mais detalhadamente investigados. Estratégias de prevenção contra a disseminação dos NV são condutas importantes em unidades de internação. Uma vacina eficaz contra norovírus pode ser um benefício significativo para reduzir o percentual de crianças hospitalizadas por diarreia. / Noroviruses (NV) are a major cause of infant hospitalization. Children hospitalized for gastroenteritis NV (NVGE) are considered to have severe diarrhea. The purpose of this study, conducted in the city of Rio de Janeiro, Brazil, is to describe the clinical characteristics and frequency of norovirus diarrhea in hospitalized children, comparing the rates of detection of NV in vaccinated and unvaccinated children against rotavirus (RV). We collected 659 fecal samples from equal numbers of children and sent for analysis by polymerase chain reaction, reverse transcription from January 2004 to December 2009. The percentage of samples positive for NV was 27.3% in this period. Of the 180 samples positive for NV, 55% meant source community (Coaq) and 45% of nosocomial acquisition (Noaq). The percentage of NVGE the previous two years (2004 and 2005) the introduction of the vaccine against RV was 28.3% and 11.3% represented the percentage of samples Coaq. In the two subsequent years (2008 and 2009), NVGE meant to 24.4%, and the samples were Coaq 14.9% (p <0.05). In 647 children, 494 received no vaccine against RV while 151 children received at least one dose. The percentage of NVGE was 23.8% and 39.7%, respectively (p <0.05). Despite the seasonal behavior of NVGE aqCo cases, this did not reach statistical significance. Of the 180 children, 61.6% had weight &#8804; p10 NCHS, 82.2% were aged &#8804; 5 years old. Children aged &#8804; 2 years were most affected in cases of Coaq than those of Noaq (p <0.05). Were observed in 82 children: vomiting (73.2%), fever (54.9%), cough (20.7%), coryza (2.2%), blood in stools (8.5%), rash (4.9%) and bronchospasm (7.3%). There was statistical significance with respect to the higher frequency of fever, coryza, coughing and wheezing in children with NVGE of Coaq than those of Noaq (p <0.05). Of 69 children, 73.9% had dehydration and of these, 76.5% required intravenous hydration. These data were statistically significant, represented by the highest percentage of children with NVGE of Coaq than those of Noaq (p <0.05). This study demonstrates that the NV were an important etiologic agent in cases of gastroenteritis in hospitalized children and responsible for high rates of nosocomial infections. Statistically, , it was not shown a tendency to increase in cases of NVGE during the study period, as well as the increased frequency NVGE in later years relative to years prior to the introduction of RV vaccine in Brazil. However, statistical significance was assessed as the percentage of NVGE in hospitalized children vaccinated and unvaccinated against RV. An increase in cases of children in NVGE could happen in the next few years, when it is expected that a greater number of children will be vaccinated against RV. Cough, coryza and wheezing are symptoms that should be further investigated. Strategies for preventing the spread of NV are important conduits in inpatient units. An effective vaccine against norovirus can be a significant benefit to reduce the percentage of children hospitalized for diarrhea.