Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras do grupo dos basidiomicetos que causam criptococcose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Ambas as espécies são caracterizadas por diferenças moleculares, imunológicas, fisiológicas e epidemiológicas. Visando identificar diferenças morfológicas, foi desenvolvido um procedimento de preparação alternativo para análise de C. neoformans e C. gattii por MEV (Microscopia eletrônica de varredura) fixando as células diretamente na cultura em ágar. Este método é mais simples do que os outros já publicados e a morfologia das células foi bem preservada. Neste trabalho também foi realizado o método de RDA (Análise de diferença representacional) com o objetivo de isolar seqüências que representam diferenças no DNA genômico de C. neoformans var. grubii e C. gattii. Aproximadamente 200 clones foram seqüenciados permitindo a identificação de 19 seqüências diferentes com significante similaridade (Evalue < 10-5) com o genoma completamente seqüenciado de C. neoformans var. neoformans linhagem JEC21. A maioria das seqüências identificadas representa proteínas hipotéticas ou proteínas de função desconhecida. Experimentos de Southern blot com cinco clones selecionados confirmaram a presença de polimorfismos ou especificidade para C. gattii. Os dados de seqüenciamento de uma das regiões identificadas como polimórficas, IDE (do inglês, insulin degrading enzime), foram usados juntamente com os dados de seqüenciamento de outros 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) para estudar as relações filogenéticas entre as espécies. O locus IDE mostrou-se mais conservado entre diferentes tipos moleculares do que os outros loci estudados, e as variações intra-variedades em C. gattii são maiores do que em C. neoformans. Estes resultados sugerem que o RDA é um método eficiente para isolar regiões polimórficas de leveduras e suportam o conceito de duas espécies reconhecido atualmente para o complexo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are basidiomycetous yeasts that cause cryptococcosis in immunecompromised and immunecompetent individuals. Both species are characterized by biochemical, immunological, molecular and epidemiological differences. Aiming to identify morphological differences, we propose an alternative to conventional preparation procedures for scanning electron microscopy (SEM) analysis of C.neoformans and C. gattii was done fixing the cells directly in the agar culture. This method is simpler than others already reported and the morphology of the cells was well preserved. We also applied representational difference analysis (RDA) to isolate sequences representing genomic differences between C. neoformans var. grubii and C. gattii. Approximately 200 clones were sequenced leading to the identification of 19 different sequences with significant similarities (Evalue< 10-5) to the completely sequenced genome of the C. neoformans var. neoformans JEC21 strain. Most of the identified sequences represent hypothetical proteins or proteins of unknown function. Southern blot experiments using five selected clones confirmed the presence of polymorphisms or specificity to C. gattii. The polymorphic IDE (insulin degrading enzyme, putative) sequence data were used together with the DNA sequence data of other 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) for studying phylogenetic relationship between species. The IDE locus was exceptionally conserved among individual molecular types compared with other loci, and intra-varieties variations in C. gattii is higher than in C. neoformans. Our results suggest that RDA provides an efficient way to isolate polymorphic regions from yeasts and highly supports the two species concept recognized currently.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bernardina_morales_ipec_dout_2013.pdf: 4097768 bytes, checksum: a3e4244f0c2be9b0d8d257c5f8921c52 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A criptococose é uma micose sistêmica adquirida pela inalação de basidiosporos ou leveduras desidratadas de Cryptococus neoformans e Cryptococus gattii, estas duas espécies podem causar criptococose oportunista e primária respectivamente. C. neoformans está constituído de tipos moleculares VNI-VNIV e C. gattii de VGI-VGIV que apresentam distribuição geográfica diferenciada, como por exemplo, o tipo VNI é cosmopolita e está associado a AIDS e VGI predominando na Austrália e EUA, o tipo VGII predominando no Brasil e America Latina. Este trabalho tem por objetivo realizar estudo comparado dos tipos moleculares VNI de C. neoformans, VGI e VGII de C. gattii analisando diferentes aspectos tais como: 1- Determinar o perfil da suscetibilidade in vitro da concentração inibitória mínima (CIM) de fluconazol (FLZ), itraconazol (ITZ), 5-fluorocitosina (5FC) e anfotericina B (AMB), isoladamente e de forma combinada de AMB com 5FC e AMB com Voriconazol (VRZ); 2- Determinar CIM pela citometria de fluxo (CMF) frente a FLZ, ITZ e AMB; 3- Definir a concentração mínima letal (CML) de AMB e 5FC, isoladamente e em combinação; 4- Avaliar a ação da melanina frente a 5FC e AMB na forma combinada e isolada de 5FC; 5- Induzir a resistência in vitro para FLZ e padronizar os fluorocromos: acetoximetil - calceína (calceina-AM), acetoximetil - 2\2019, 7\2019 -bis-(2-carboxietil)-5-(e -6)- carboxifluoresceína (BCECF-AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3\2019 \2013dipentiloxacarbocianina (DiOC5) na CMF para verificar a expressão de bombas de efluxo; 6- Comparar a expressão de bombas de efluxo Os resultados permitiram identificar diferentes fenótipos de suscetibilidade que foram analisados e comparados entre as duas espécies e os tipos moleculares, permitindo a produção de quatro artigos; sendo assim, concluímos que: 1- Na análise das CIMs o tipo molecular VGII apresentou-se menos suscetível em relação a VGI e VNI; já na combinação in vitro de AMB e VRZ foi observado 100% de indiferença, e na combinação de AMB e 5FC observou-se necessidade de padronização da concentração da glicose para obter testes que possam ser futuramente relacionados a casos clínicos; 2- O método de CMF demonstrou ser alternativa de leitura automatizada, reprodutível, para os testes de suscetibilidade antifúngica com uso de Laranja de Acridina e FUN-1; 3- Foi verificada a importância da realização do teste da CML para verificar a ação protetora da melanina frente a combinação de AMB e 5FC. 4- A expressão da melanina, na combinação de AMB e 5FC reduz a detecção do sinergismo e o efeito aditivo in vitro. 5. Os isolados induzidos à resistência ao FLZ permitiram obter resultados estatisticamente significativos na verificação de Bombas de efluxo in vitro na CMF com uso de fluorocromo Dioc5 e bloqueador de protonóforos CCCP; 6- Foi verificado que 65% de isolados não induzidos a resistência e 90% de isolados induzidos a resistência do tipo molecular VGII expulsam o FLZ com certa vantagem em relação aos tipos moleculares VGI e VNI. Os resultados deste trabalho contribuem para compreensão do comportamento in vitro de C. neoformans e C. gattii frente a drogas antifúngicas cujos resultados poderão ser aplicados em estudos clínicos de correlação in vitro e in vivo para melhor compreensão da terapêutica antifúngica da criptococose e validação dos testes de suscetibilidade para estas duas espécies / Cryptococcosis is a system ic mycosis acquired by inhalation of dried yeasts or basidiospores of Cryptococus neoformans and Cryptococus gattii , these species can cause cryptococcosis opportunistic and primary respectively. C. neoformans is composed of molecular types VNI - VNIV and C. gattii VGI - VGIV they have different geographical distribution, the VNI type is cosmopolitan and is associated with AIDS, VGI type is predominant in Australia and the USA; while VGII type occurs in Brazil and Latin America. This paper aims to conduct a comparative study of the molecular types VNI C. neoformans and VGI, VGII C. gattii analyzing different aspects such as : 1 – The susceptibility profile in vitro of fluconazole ( FLZ ), itraconazole ( ITZ ), 5 - fluorocytosine ( 5FC ) and amphotericin B ( A MB ) alone and in combination with 5FC and AMB with voriconazole ( VRZ ) 2 – The minimum inhibitory concentration ( MIC ) by flow cytometry ( FCM ) comparing MIC of FLZ , ITZ and AMB with CLSI; 3 - The minimum lethal concentration ( MLC ) of AMB and 5FC, a lone and in combination; 4 - The action of melanin against 5FC and AMB alone and combined 5FC, 5 – The induced resistance in vitro to FLZ and standardize the fluorochromes: acetoximetil - calceína (calceina - AM), acetoximetil - 2’, 7’ - bis - (2 - carboxietil) - 5 - (e - 6) - carboxifluoresceína (BCECF - AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3’ – dipentiloxacarbocianina (DiOC5) in FCM to verify expression of efflux pumps; 6 - The compare the expression of efflux pumps. These results permitted the identification of dif ferent susceptibility phenotypes which were analyzed and compared between the two species and molecular types, allowing the production of four articles . T hus, we concluded that: 1 - The analysis of the molecular type VGII MICs presented less susceptibility against VGI and VNI, whereas in the combination of AMB and VRZ in vitro 100% indifference was observed, in the combination of AMB and 5FC we observed the need for standardization of the concentration of glucose for future tests which can be related to cli nical cases; 2 - the FCM method proved to be an alternative automated reproducible reading for antifungal susceptibility testing with use of Acridine Orange and FUN - 1, 3 - The importance of carrying out the MLC test to verify the protective action of mela nin when exposed to the combination of AMB and 5FC. 4 - Was also verified that expression of melanin, in combination AMB and 5FC reduces the detection of synergism and additive effect in vitro . 5 - The strains induced to resistance to fluconazole made it p ossible to obtain statistically significant results in the verification of acriviry of efflux pumps in vitro using FCM with fluorochrome Dioc5 and protonophores blocker CCCP, 6 - It was found that 65% isolates no inducted to resistance and 90% isolates ind ucted to resistance of the molecular ty pe VGII expels the FLZ with a certain advantage in relation to the molecular types VNI and VGI. The results of these studies contribute to the understanding of the behavior in vitro of C. neoformans and C. gattii agai nst antifungal drugs and can be applied in clinical correlation studies in vitro and in vivo to better understand the antifungal therapy of cryptococcosis and validation of susceptibility testing for these two species.

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras do grupo dos basidiomicetos que causam criptococcose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Ambas as espécies são caracterizadas por diferenças moleculares, imunológicas, fisiológicas e epidemiológicas. Visando identificar diferenças morfológicas, foi desenvolvido um procedimento de preparação alternativo para análise de C. neoformans e C. gattii por MEV (Microscopia eletrônica de varredura) fixando as células diretamente na cultura em ágar. Este método é mais simples do que os outros já publicados e a morfologia das células foi bem preservada. Neste trabalho também foi realizado o método de RDA (Análise de diferença representacional) com o objetivo de isolar seqüências que representam diferenças no DNA genômico de C. neoformans var. grubii e C. gattii. Aproximadamente 200 clones foram seqüenciados permitindo a identificação de 19 seqüências diferentes com significante similaridade (Evalue < 10-5) com o genoma completamente seqüenciado de C. neoformans var. neoformans linhagem JEC21. A maioria das seqüências identificadas representa proteínas hipotéticas ou proteínas de função desconhecida. Experimentos de Southern blot com cinco clones selecionados confirmaram a presença de polimorfismos ou especificidade para C. gattii. Os dados de seqüenciamento de uma das regiões identificadas como polimórficas, IDE (do inglês, insulin degrading enzime), foram usados juntamente com os dados de seqüenciamento de outros 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) para estudar as relações filogenéticas entre as espécies. O locus IDE mostrou-se mais conservado entre diferentes tipos moleculares do que os outros loci estudados, e as variações intra-variedades em C. gattii são maiores do que em C. neoformans. Estes resultados sugerem que o RDA é um método eficiente para isolar regiões polimórficas de leveduras e suportam o conceito de duas espécies reconhecido atualmente para o complexo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are basidiomycetous yeasts that cause cryptococcosis in immunecompromised and immunecompetent individuals. Both species are characterized by biochemical, immunological, molecular and epidemiological differences. Aiming to identify morphological differences, we propose an alternative to conventional preparation procedures for scanning electron microscopy (SEM) analysis of C.neoformans and C. gattii was done fixing the cells directly in the agar culture. This method is simpler than others already reported and the morphology of the cells was well preserved. We also applied representational difference analysis (RDA) to isolate sequences representing genomic differences between C. neoformans var. grubii and C. gattii. Approximately 200 clones were sequenced leading to the identification of 19 different sequences with significant similarities (Evalue< 10-5) to the completely sequenced genome of the C. neoformans var. neoformans JEC21 strain. Most of the identified sequences represent hypothetical proteins or proteins of unknown function. Southern blot experiments using five selected clones confirmed the presence of polymorphisms or specificity to C. gattii. The polymorphic IDE (insulin degrading enzyme, putative) sequence data were used together with the DNA sequence data of other 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) for studying phylogenetic relationship between species. The IDE locus was exceptionally conserved among individual molecular types compared with other loci, and intra-varieties variations in C. gattii is higher than in C. neoformans. Our results suggest that RDA provides an efficient way to isolate polymorphic regions from yeasts and highly supports the two species concept recognized currently.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-11Bitstream added on 2014-06-13T18:31:22Z : No. of bitstreams: 1 barboza_ls_me_sjrp_parcial.pdf: 54066 bytes, checksum: 3901016bbfd3977caa34c67746541ca7 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-28T16:08:50Z: barboza_ls_me_sjrp_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-28T16:09:56Z : No. of bitstreams: 1 000642588.pdf: 349486 bytes, checksum: eea3a5247c5cd27a996061bb9441acaa (MD5) / A criptococose é uma micose sistêmica que afeta principalmente o sistema nervoso central, causando meningite. Causada pela inalação de propágulos de fungos do gênero Cryptococcus sp, C neoformans acomete hospedeiros com imunodepressão celular, cujo maior contingente é representado por indivíduos com AIDS. A fonte principal de aquisição desta levedura são fezes de aves, principalmente pombos (Columba livia). C. gattii infecta indivíduos aparentemente imunocompetentes, sendo isolado principalmente em espécies de eucaliptos. C. albidus e C. laurentii aparece em casos de meningites, fungemias, pneumonias, abscessos pulmonares e infecções cutâneas. C.uniguttulatus é encontrado no trato gastrointestinal, fezes de pássaros e contaminante de leitos de animais e habitats de roedores. Termo-tolerância, parede celular, cápsula, adesão, e produção de enzimas são fatores importantes de virulência do gênero. São José do Rio Preto é a 5ª cidade entre os 100 municípios do estado de São Paulo em de casos de AIDS. Analisou-se morfologicamente e bioquimicamente 48 amostras clínicas e 155 ambientais. Amostras de líquor resultaram em 30 isolados da espécie C. neoformans, 17 de C. gattii e um de C. luteolus. Foram identificados 26 isolados de C.albidus, 22 de C. laurentii, 9 de C. neoformans, 5 de C. gattii e um de C.uniguttulatus nas amostras ambientais. A concentração inibitória mínima para antifúngicos foi determinada para todos os isolados por meio do teste de microdiluição em caldo padronizado pelo NCCLS. Os resultados obtidos mostraram resistência à anfotericina B e itraconazol nas cepas clínicas de C. neoformans e C. gattii, e as cepas de C.albidus e C. laurentii apresentaram resistência a 5-fluorcitosina, itraconazol e anfotericina B / Cryptococcosis is a systemic mycosis that mainly affects the central nervous system, causing meningitis. Caused by inhalation of seedlings of fungi of the genus Cryptococcus sp, C. neoformans affects hosts with immunosuppression cellular, whose largest contingent is represented by individuals with AIDS. The main source of acquiring this yeast is feces of birds, especially pigeons (Columba livia). C. gattii infects individuals apparently immunocompetent, being isolated mainly in species of eucalyptus. C. albidus and C. laurentii appear in cases of meningitis, nosocomial fungemia, pneumonia, lung abscesses and skin infections. C. uniguttulatus is found in the gastrointestinal tract and feces of birds and contaminant of beds of animals and habitats of rodents. Thermo-tolerance, cell wall, capsule, accession, and production of enzymes are important factors in the virulence of the genus. São José do Rio Preto is the 5th city among the 100 cities in the state of São Paulo in cases of AIDS. We analyzed morphologically and biochemically 48 clinical samples and 155 environmental. Liquor samples resulted in 30 isolates of the species C. neoformans, 17 of C. gattii and one of C. luteolus. We identified 26 isolates of C. albidus, 22 of C. laurentii, 9 of C. neoformans, 5 of C. gattii and one of C. uniguttulatus in environmental samples. The minimal inhibitory concentration for antifungal agents was determined for all isolates by means of the test of broth microdilution standardized by the NCCLS. The results obtained showed resistance to amphotericin B and itraconazole in clinical strains of C. neoformans and C. gattii, C. albidus and C. laurentii exhibited resistance to 5-fluorocytosine, itraconazole and amphotericin B

Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são leveduras do grupo dos basidiomicetos que causam criptococcose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Ambas as espécies são caracterizadas por diferenças moleculares, imunológicas, fisiológicas e epidemiológicas. Visando identificar diferenças morfológicas, foi desenvolvido um procedimento de preparação alternativo para análise de C. neoformans e C. gattii por MEV (Microscopia eletrônica de varredura) fixando as células diretamente na cultura em ágar. Este método é mais simples do que os outros já publicados e a morfologia das células foi bem preservada. Neste trabalho também foi realizado o método de RDA (Análise de diferença representacional) com o objetivo de isolar seqüências que representam diferenças no DNA genômico de C. neoformans var. grubii e C. gattii. Aproximadamente 200 clones foram seqüenciados permitindo a identificação de 19 seqüências diferentes com significante similaridade (Evalue < 10-5) com o genoma completamente seqüenciado de C. neoformans var. neoformans linhagem JEC21. A maioria das seqüências identificadas representa proteínas hipotéticas ou proteínas de função desconhecida. Experimentos de Southern blot com cinco clones selecionados confirmaram a presença de polimorfismos ou especificidade para C. gattii. Os dados de seqüenciamento de uma das regiões identificadas como polimórficas, IDE (do inglês, insulin degrading enzime), foram usados juntamente com os dados de seqüenciamento de outros 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) para estudar as relações filogenéticas entre as espécies. O locus IDE mostrou-se mais conservado entre diferentes tipos moleculares do que os outros loci estudados, e as variações intra-variedades em C. gattii são maiores do que em C. neoformans. Estes resultados sugerem que o RDA é um método eficiente para isolar regiões polimórficas de leveduras e suportam o conceito de duas espécies reconhecido atualmente para o complexo C. neoformans. / Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are basidiomycetous yeasts that cause cryptococcosis in immunecompromised and immunecompetent individuals. Both species are characterized by biochemical, immunological, molecular and epidemiological differences. Aiming to identify morphological differences, we propose an alternative to conventional preparation procedures for scanning electron microscopy (SEM) analysis of C.neoformans and C. gattii was done fixing the cells directly in the agar culture. This method is simpler than others already reported and the morphology of the cells was well preserved. We also applied representational difference analysis (RDA) to isolate sequences representing genomic differences between C. neoformans var. grubii and C. gattii. Approximately 200 clones were sequenced leading to the identification of 19 different sequences with significant similarities (Evalue< 10-5) to the completely sequenced genome of the C. neoformans var. neoformans JEC21 strain. Most of the identified sequences represent hypothetical proteins or proteins of unknown function. Southern blot experiments using five selected clones confirmed the presence of polymorphisms or specificity to C. gattii. The polymorphic IDE (insulin degrading enzyme, putative) sequence data were used together with the DNA sequence data of other 3 loci (ACT1, URA5, PLB1) for studying phylogenetic relationship between species. The IDE locus was exceptionally conserved among individual molecular types compared with other loci, and intra-varieties variations in C. gattii is higher than in C. neoformans. Our results suggest that RDA provides an efficient way to isolate polymorphic regions from yeasts and highly supports the two species concept recognized currently.

Cryptococcus neoformans species complex são fungos oportunistas que desencadeiam meningite, tanto em pacientes imunocompetentes como em indivíduos hígidos. Este trabalho teve como objetivo estudar as espécies circulantes de Cryptococcus neoformans species complex isolados no Estado de Sergipe tanto a partir do LCR (líquido céfalo raqueanao) de pacientes com meningite infecciosa como de diversos substratos ambientais. Foram utilizadas amostras do LCR que deram entrada no IPH/HEMOLACEN/SE no período de 2001 a 2007. Foram realizadas 104 coletas ambientais dentro do Estado de Sergipe, das quais 55 foram obtidas a partir de excretas de aves e quatro de amostras de fezes de morcegos coletadas em cavernas. As demais foram obtidas de materiais de origem vegetal, perfazendo 45 amostras: 21 de Eucalyptus spp., oito de material de troncos vegetais em decomposição, 10 de restos vegetais coletados em duas praças e seis de Anacardium occidentale L. (cajueiro). O líquor foi examinado por microscopia direta e cultivado a 25ºC e a 37ºC. No período de 2005 a 2007 foram obtidos 141 isolados ambientais e 35 isolados clínicos de Cryptococcus neoformans species complex. Foram determinadas inferências ecológicas e epidemiológicas dos isolados obtidos além de realização de provas para identificação presuntiva fenotípica em meioNíger e, das espécies em meio CGB, teste de sensibilidade frente aosantifúngicos, caracterização enzimática de interesse biotipar e/ou marcador de linhagens, determinação de mating type sexual utilizando PCR e PCR Fingerprintig com iniciador M13. Nas linhagens de Cryptococcus spp. isoladas de líquor de pacientes com meningite infecciosa no Estado de Sergipe prevaleceu a espécie C. neoformans. Em relação às linhagens ambientais, somente uma amostra, dentre 140, foi identifcada como C. gattii. Todas as amostras oriundas de excretas de aves foram positivas no isolamento da levedura. Os isolados clínicos de C. neoformans e C. gattii oriundos de pacientes com meningite criptocócica no Estado de Sergipe apresentaram valores altos de concentração inibitória mínima (CIM) para os agentes antifúngicos testados, o que simboliza alta taxa de resistência, principalmente à Anfotericina B e ao Fluconazol. Em relação ao mating type sexual foi evidenciando que a maioria das linhagens clínicas foi identificada como MAT, confirmando o caráter de virulência que esta levedura desenvolve. Entretanto, no isolados ambientais o MATa foi mais prevalente, evidenciando o caráter menos virulento destas linhagens frente às de origem clínica. Cryptococcus neoformans foi a única espécie amplificada por PCR fingerprinting. Houve presença, dentre as amostras locais, de três perfis genéticos distintos epertencentes a uma mesma espécie. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT: Cryptococcus neoformans species complex are opportunistic fungi that cause meningitis in both immunocompetent patients and in healthy individuals. This work aimed to study the species of circulating Cryptococcus neoformans species complex isolated from northeastern Brazil from both the CSF (cerebrospinal fluid) of patients with infectious meningitis as various environmental substrates. Samples of CSF were received at IPH/HEMOLACEN/SE in the period 2001 to 2007. Were carried out 104 environmental samples within the state of Sergipe, of which 55 were obtained from the feces of birds and four stool samples collected from bat caves. The other samples were obtained from plant materials, totaling 45 samples: 21 from Eucalyptus spp., eight from material of decomposing trunks of plants, 10 from plant collected in two squares, six from Anacardium occidentale L. - (Cashew). CSF was examined by direct microscopy by staining with Indian ink and cultured in Sabouraud agar with chloramphenicol at 25 °C and 37 ºC. In the period from 2005 to 2007 were obtained from 141 environmental isolates and35 clinical isolates of Cryptococcus neoformans species complex. Ecological and epidemiological inferences were determined. In addition characteristics of isolates were carried out by tests for presumptive phenotypic identification, through Niger medium and species into the CGB test, sensitivity to the antifungal, enzymatic characterization of biotypes of interest and/or marker lines, determining sexual mating type using PCR and PCR Fingerprintig with primer M13. Among the strains of Cryptococcus spp. isolated from CSF of patients with infectious meningitis in the state of Sergipe, in the period from 2001 to 2009, prevaled the species C. neoformans. Among the environmental strains, only one sample of 140, was identified as C. gattii. All samples from thefeces of birds were positive in the isolation of yeast. Clinical isolates ofCryptococcus neoformans and C. gattii originating from patients withcryptococcal meningitis in the state of Sergipe exhibited higher values ofminimum inhibitory concentration (MIC) to the antifungal agents tested, which symbolizes high rate of resistance, especially to amphotericin B and fluconazole. In relation to sexual mating type was evident that most of the clinics were MAT strains, confirming the character of virulence of this yeast. However, among the environmental isolates the MATa was more prevalent, showing the character of these less virulent strains. Cryptococcus neoformans was the only species amplified by PCR fingerprinting. There was a presence among the local samples of three different genetic profiles belonging to the same species.

Orientador: João Claudio Thomeo / Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins / Banca: Tatiane Iembo / Resumo: A criptococose é uma micose sistêmica que afeta principalmente o sistema nervoso central, causando meningite. Causada pela inalação de propágulos de fungos do gênero Cryptococcus sp, C neoformans acomete hospedeiros com imunodepressão celular, cujo maior contingente é representado por indivíduos com AIDS. A fonte principal de aquisição desta levedura são fezes de aves, principalmente pombos (Columba livia). C. gattii infecta indivíduos aparentemente imunocompetentes, sendo isolado principalmente em espécies de eucaliptos. C. albidus e C. laurentii aparece em casos de meningites, fungemias, pneumonias, abscessos pulmonares e infecções cutâneas. C.uniguttulatus é encontrado no trato gastrointestinal, fezes de pássaros e contaminante de leitos de animais e habitats de roedores. Termo-tolerância, parede celular, cápsula, adesão, e produção de enzimas são fatores importantes de virulência do gênero. São José do Rio Preto é a 5ª cidade entre os 100 municípios do estado de São Paulo em de casos de AIDS. Analisou-se morfologicamente e bioquimicamente 48 amostras clínicas e 155 ambientais. Amostras de líquor resultaram em 30 isolados da espécie C. neoformans, 17 de C. gattii e um de C. luteolus. Foram identificados 26 isolados de C.albidus, 22 de C. laurentii, 9 de C. neoformans, 5 de C. gattii e um de C.uniguttulatus nas amostras ambientais. A concentração inibitória mínima para antifúngicos foi determinada para todos os isolados por meio do teste de microdiluição em caldo padronizado pelo NCCLS. Os resultados obtidos mostraram resistência à anfotericina B e itraconazol nas cepas clínicas de C. neoformans e C. gattii, e as cepas de C.albidus e C. laurentii apresentaram resistência a 5-fluorcitosina, itraconazol e anfotericina B / Abstract: Cryptococcosis is a systemic mycosis that mainly affects the central nervous system, causing meningitis. Caused by inhalation of seedlings of fungi of the genus Cryptococcus sp, C. neoformans affects hosts with immunosuppression cellular, whose largest contingent is represented by individuals with AIDS. The main source of acquiring this yeast is feces of birds, especially pigeons (Columba livia). C. gattii infects individuals apparently immunocompetent, being isolated mainly in species of eucalyptus. C. albidus and C. laurentii appear in cases of meningitis, nosocomial fungemia, pneumonia, lung abscesses and skin infections. C. uniguttulatus is found in the gastrointestinal tract and feces of birds and contaminant of beds of animals and habitats of rodents. Thermo-tolerance, cell wall, capsule, accession, and production of enzymes are important factors in the virulence of the genus. São José do Rio Preto is the 5th city among the 100 cities in the state of São Paulo in cases of AIDS. We analyzed morphologically and biochemically 48 clinical samples and 155 environmental. Liquor samples resulted in 30 isolates of the species C. neoformans, 17 of C. gattii and one of C. luteolus. We identified 26 isolates of C. albidus, 22 of C. laurentii, 9 of C. neoformans, 5 of C. gattii and one of C. uniguttulatus in environmental samples. The minimal inhibitory concentration for antifungal agents was determined for all isolates by means of the test of broth microdilution standardized by the NCCLS. The results obtained showed resistance to amphotericin B and itraconazole in clinical strains of C. neoformans and C. gattii, C. albidus and C. laurentii exhibited resistance to 5-fluorocytosine, itraconazole and amphotericin B / Mestre

Infecções fúngicas em humanos vem aumentando nos últimos anos e acometem principalmente pacientes imunocomprometidos, portadores do vírus HIV, transplantados ou com câncer. Os antifúngicos empregados no tratamento pertencem a poucos grupos de fármacos e o aparecimento de resistência antifúngica em muitos patógenos leva à necessidade de desenvolvimento de novos agentes antifúngicos. As cepas Trichosporon japonicum QU139 e Candida catenulata LV102 apresentam atividade killer sobre diversas leveduras patogênicas, apresentando bom potencial para desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. O objetivo do trabalho foi a otimização das condições para produção e detecção dos compostos antimicrobianos, para seu futuro uso terapêutico, e sua purificação. O efeito killer da cepa T. japonicum QU139 foi avaliado pelo método dos poços contra células sensíveis de Cryptococcus gattii C20 nos meios GYP, YM e Queijo em diferentes pH e temperaturas. A máxima atividade killer foi encontrada no meio GYP, pH 4,5 à 25°C após 24 horas de incubação para T.japonicum QU139 e C. catenulata LV102. Não foi possível isolar o composto antimicrobiano produzido pela levedura T.japonicum QU139 pelos métodos de isolamento de proteína/glicoproteína, corroborando a hipótese de que a toxina seja um glicolipídeo. / Human fungal infections have increased in the last years and affect mainly immunocompromised patients, carriers of HIV vírus, transplanted or with cancer. The antifungal agents used in treatment belong to a few groups of drugs and the increase of antifungal resistance in many pathogens leads to the necessity of developing new antifungal agents. Strains Trichosporon japonicum QU139 and Candida catenulata LV102 showed killer activity against several pathogenic yeasts, having a good potential for the development of new antimicrobial agents. The objective of the work was the optimization of conditions for production and detection of the antimicrobial compounds, aiming their future terapeutic use, and their purification. The killer effect of T. japonicum QU139 strain was evaluated by the well method against sensitive cells of Cryptococcus gattii C20 in media GYP, YM and Cheese in different pH and temperatures. The maximum killer activity was found in media GYP, pH 4.5, 25°C after 24 hours of incubation for T.japonicum QU139 and C. catenulata LV102. The isolation of the antimicrobial compound produced by the yeast T.japonicum QU139 was not possible by the methods for isolation of proteins/glicoproteins, corroborating the hypothesis that the toxin is a glycolipid.

Infecções fúngicas em humanos vem aumentando nos últimos anos e acometem principalmente pacientes imunocomprometidos, portadores do vírus HIV, transplantados ou com câncer. Os antifúngicos empregados no tratamento pertencem a poucos grupos de fármacos e o aparecimento de resistência antifúngica em muitos patógenos leva à necessidade de desenvolvimento de novos agentes antifúngicos. As cepas Trichosporon japonicum QU139 e Candida catenulata LV102 apresentam atividade killer sobre diversas leveduras patogênicas, apresentando bom potencial para desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. O objetivo do trabalho foi a otimização das condições para produção e detecção dos compostos antimicrobianos, para seu futuro uso terapêutico, e sua purificação. O efeito killer da cepa T. japonicum QU139 foi avaliado pelo método dos poços contra células sensíveis de Cryptococcus gattii C20 nos meios GYP, YM e Queijo em diferentes pH e temperaturas. A máxima atividade killer foi encontrada no meio GYP, pH 4,5 à 25°C após 24 horas de incubação para T.japonicum QU139 e C. catenulata LV102. Não foi possível isolar o composto antimicrobiano produzido pela levedura T.japonicum QU139 pelos métodos de isolamento de proteína/glicoproteína, corroborando a hipótese de que a toxina seja um glicolipídeo. / Human fungal infections have increased in the last years and affect mainly immunocompromised patients, carriers of HIV vírus, transplanted or with cancer. The antifungal agents used in treatment belong to a few groups of drugs and the increase of antifungal resistance in many pathogens leads to the necessity of developing new antifungal agents. Strains Trichosporon japonicum QU139 and Candida catenulata LV102 showed killer activity against several pathogenic yeasts, having a good potential for the development of new antimicrobial agents. The objective of the work was the optimization of conditions for production and detection of the antimicrobial compounds, aiming their future terapeutic use, and their purification. The killer effect of T. japonicum QU139 strain was evaluated by the well method against sensitive cells of Cryptococcus gattii C20 in media GYP, YM and Cheese in different pH and temperatures. The maximum killer activity was found in media GYP, pH 4.5, 25°C after 24 hours of incubation for T.japonicum QU139 and C. catenulata LV102. The isolation of the antimicrobial compound produced by the yeast T.japonicum QU139 was not possible by the methods for isolation of proteins/glicoproteins, corroborating the hypothesis that the toxin is a glycolipid.

Infecções fúngicas em humanos vem aumentando nos últimos anos e acometem principalmente pacientes imunocomprometidos, portadores do vírus HIV, transplantados ou com câncer. Os antifúngicos empregados no tratamento pertencem a poucos grupos de fármacos e o aparecimento de resistência antifúngica em muitos patógenos leva à necessidade de desenvolvimento de novos agentes antifúngicos. As cepas Trichosporon japonicum QU139 e Candida catenulata LV102 apresentam atividade killer sobre diversas leveduras patogênicas, apresentando bom potencial para desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. O objetivo do trabalho foi a otimização das condições para produção e detecção dos compostos antimicrobianos, para seu futuro uso terapêutico, e sua purificação. O efeito killer da cepa T. japonicum QU139 foi avaliado pelo método dos poços contra células sensíveis de Cryptococcus gattii C20 nos meios GYP, YM e Queijo em diferentes pH e temperaturas. A máxima atividade killer foi encontrada no meio GYP, pH 4,5 à 25°C após 24 horas de incubação para T.japonicum QU139 e C. catenulata LV102. Não foi possível isolar o composto antimicrobiano produzido pela levedura T.japonicum QU139 pelos métodos de isolamento de proteína/glicoproteína, corroborando a hipótese de que a toxina seja um glicolipídeo. / Human fungal infections have increased in the last years and affect mainly immunocompromised patients, carriers of HIV vírus, transplanted or with cancer. The antifungal agents used in treatment belong to a few groups of drugs and the increase of antifungal resistance in many pathogens leads to the necessity of developing new antifungal agents. Strains Trichosporon japonicum QU139 and Candida catenulata LV102 showed killer activity against several pathogenic yeasts, having a good potential for the development of new antimicrobial agents. The objective of the work was the optimization of conditions for production and detection of the antimicrobial compounds, aiming their future terapeutic use, and their purification. The killer effect of T. japonicum QU139 strain was evaluated by the well method against sensitive cells of Cryptococcus gattii C20 in media GYP, YM and Cheese in different pH and temperatures. The maximum killer activity was found in media GYP, pH 4.5, 25°C after 24 hours of incubation for T.japonicum QU139 and C. catenulata LV102. The isolation of the antimicrobial compound produced by the yeast T.japonicum QU139 was not possible by the methods for isolation of proteins/glicoproteins, corroborating the hypothesis that the toxin is a glycolipid.