Orientador: Marcio Jose Tiera / Banca: Carla Cristina Schmitt Cavalheiro / Banca: Iêda Aparecida Pastre Fertonani / Resumo: O presente trabalho apresenta a síntese e caracterizaçao de derivados de quitosana obtidos pela reação com cloreto de 2-cloro dietilaminoetilamônio (DEAE Cl). Os derivados obtidos foram utilizados na síntese de nanopartículas para liberação controlada de genes. Inicialmente a quitosana comercial foi desacetilada e as sínteses foram realizadas em meio aquoso alcalino pela reação de substituição nucleofílica dos grupos amino da quitosana. A caracterização dos derivados foi realizada utilizando-se a espectroscopia de ressonância magnética nuclear de prótons (RMN-1 H), titulações potenciométricas e condutimétricas. Os derivados obtidos apresentaram proporções crescentes de DEAE (15%, 24%, 80% e 117%) e diferentes capacidades de tamponamento. A massa molecular viscosimétrica foi determinada por medidas de viscosidade e variou de 17 a 21 kDa. As titulações potenciométricas mostraram que a modificação de quitosana com o grupo DEAE permite aumentar a capacidade tamponante com respeito à quitosana e pode contribuir para aumentar a liberação de DNA e a eficiência do processo de transfecção gênica. O estudo dos derivados com DNA foi realizado utilizando-se as técnicas de fluorescência, eletroforese, espalhamento de luz dinâmico (tamanho das nanopartículas) e potencial zeta. O ensaio com brometo de etídio mostrou que a força de interação de DNA com os derivados depende tanto do grau de substituição por DEAE quanto da razão de cargas (N/P). Em altos valores de pH (7,4) todos os derivados interagem fortemente com DNA devido a presença dos grupos amino terciários e quaternários ligados a cadeia de quitosana. Os resultados de eletroforese mostram que a força de interação aumenta com o grau de substituição de DEAE e os resultados iniciais de espalhamento de luz mostram que nanopartículas estáveis podem ser obtidas em pH fisiólogico... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work presents the synthesis and characterization of chitosan derivatives obtained by reaction of chitosan with diethylaminoethyl chloride - Cl DEAE. The obtained derivatives were employed in the synthesis of nanoparticles for controlled delivery of genes. Commercial chitosan was deacetylated and the reactions were carried out in aqueous solution at pH 8.0 by the nucleophilic subsitituion of the chitosan amino groups. The characterization was performed using 1H NMR spectroscopy, potentiometric and conductimetric titrations. The obtained derivatives contain increasing proportions of DEAE (15%, 24%, 80% and 117%) and different buffering capacities. Viscosity measurements were performed to determine the viscoimetric molecular weight (Mv), which varied from 17 to 21 kDa. The potentiometric titrations showed that DEAE groups increase the buffering capacity of chitosan and this may contribute to increase the DNA delivery from nanoparticles and the efficiency of gene transfection. The study of interaction between the derivatives and DNA was performed using fluorescence, gel electrophoresis, dynamic light scattering and zeta potential. The ethidium bromide (EtBr) assay showed that the strenght of interaction between the derivatives and DNA depends on both, the degree of substitution (DS) and N/P charge ratio. At physiological pH all derivatives interacted with DNA due to the presence of tertiary quaternary amino groups attached to the chitosan main chain. The gel electrophoresis results showed that the strength of interaction increases with DS and the initial results employing light scattering techniques show that stable nanoparticles can be obtained in phyisological pH, which is clearly an important property in comparison to deacetylated chitosan. Transfection studies carried out with these derivatives confirmed that the presence of DEAE groups improves the transfection efficiency... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Marcio José Tiera / Banca: Marcelo Henrique Gehlen / Banca: Rose Mary Zumstein Georgetto Naal / Resumo: Na presente dissertação, foram preparadas quitosanas com diferentes massas molares, 16 kDa, 18 kDa e 29 kDa, e com diferentes graus de substituição de fosforilcolina (PC). As quitosanas de baixa massa molecular foram obtidas pela degradação de quitosana desacetilada. Essas quitosanas foram purificadas com membranas de diálise de tamanho de exclusão apropriadas e caracterizadas por meio de titulação potenciométrica, H-RMN e Cromatografia de permeação em gel (GPC). O estudo físico-químico da interação das quitosanas com DNA foi realizado utilizando-se as técnicas de fluorescência, eletroforese, microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e espalhamento de luz dinâmico. As propriedades avaliadas foram a eficiência de interação, a estabilidade dos complexos, potencial zeta e tamanho de poliplexos. Os experimentos foram conduzidos variando-se a força iônica, pH do meio, massa molar de policátion e razão de cargas para quitosanas com diferentes conteúdos de grupos PC. Além das quitosanas preparadas durante o projeto, também se utilizou quitosanas de diferentes massas molares, de 5 e 150 kDa, para estudo dos poliplexos em diferentes forças iônicas. Os resultados mostraram que a eficiência de interação entre quitosana e DNA é reduzida com a presença do grupo PC. Nos estudos de DLS, verificou-se que, em baixos valores de pH, o método de coacervação permite a obtenção de nanopartículas de 150 a 300 nm. A força de interação, o tamanho e a estabilidade das nanopartículas dependem do pH do meio, da força iônica da solução, da massa molar e do conteúdo de fosforilcolina. Em pHs mais elevados, os poliplexos são mais estáveis quanto maior a massa molar ou quando há a presença de grupo fosforilcolina. O trabalho permitiu ampliar os estudos sobre os efeitos da força iônica, do pH, da massa molar e conteúdos de PC e como, tais parâmetros... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work chitosans with different molecular weights and their derivatives containing different amounts of phosphorylcholine (PC) were prepared. The low molecular weights chitosans were obtained by degradation of deacetylated chitosan. These chitosans were purified by dialysis membranes of appropriate sizes of exclusion and characterized by potentiometric titration, H-NMR and gel permeation chromatography (GPC) techniques. The physico-chemical study of the interaction between chitosan and DNA was performed using the ethidium bromide fluorescence assay, gel electrophoresis, optical microscopy, transmission electron microscopy and dynamic light scattering techniques. The experiments were carried out at varying experimental conditions as ionic strength, pH, and charge ratio with chitosans of different molecular weights and phosphorylcholine contents. The results showed that the efficiency of the interaction between chitosan and DNA was reduced with the incorporation of PC on the chitosan chain. The results showed that at low pH values the sizes of the nanoparticles obtained by the coacervation method varied from 150 to 300 nm. The strength of the interaction and the size of the nanoparticles were shown to be dependent of pH, ionic strength, chitosan molecular weight and of the phosphorylcholine contents. The study at high pH values showed that more stable nanoparticles were formed with chitosans having the higher molecular weights. The attaching of phosphorylcholine groups to the chitosan main chain allows obtaining more stable particles at high pH values. In this work we provide new insights on the effects of molecular weight, pH, ionic strength and PC contents on both the chitosan-DNA interaction and the stability of formed nanoparticles / Mestre