Bakgrund: Den pågående pandemin COVID-19 orsakas av viruset SARS-CoV-2. Sedan december 2020 har nya varianter av viruset med betydande genetiska förändringar upptäckts, gemensamt benämnt varianter av särskild betydelse eller variants of concern (VOC). Just nu är det tre VOC som bevakas särskilt; B.1.1.7 (först upptäckt i Storbritannien), B.1.351 (först upptäckt i Sydafrika) respektive P.1 (först upptäckt i Brasilien). Den tidigaste statistiken från Folkhälsomyndigheten om förekomsten av VOC i Region Dalarna är från februari 2021. Förekomsten av VOC innan dess är fortfarande okänd. I regionen delas analysering av prover vid misstanke om COVID-19 in i de olika kategorierna patienter, vårdpersonal, smittspårning och allmänhet. Befintlig statistik om förekomsten av VOC grundar sig nästan enbart på förekomsten bland allmänhetens prover. Syfte: Syftet med denna studie var att undersöka förekomsten av SARS-CoV-2 varianter av särskild betydelse i prover tagna från patienter, vårdpersonal och smittspårningar under december 2020-januari 2021 i Region Dalarna. Studien syftade också till att undersöka när spridningen av respektive VOC kan ha startat i regionen. Metod: Provmaterialet bestod av SARS-CoV-2 positiva prov tagna inom analyskategorierna under tidsperioden. Prover analyserades med RT-PCR och smältkurvsanalys för detektion av VOC-karaktäristiska mutationer. Resultat: Ett fåtal fall av B.1.1.7 detekterades redan i december och en stigande andel av B.1.1.7 påvisades inom analyskategorierna under januari, som tecken på att en regional spridning kan ha startat vid tidpunkten. Endast ett fåtal fall av B.1.351 och/eller P.1 detekterades inom analyskategorierna under tidsperioden, vilket tyder på att en regional spridning av dessa ännu inte hade startat i januari. / Background: The ongoing pandemic COVID-19 is caused by the virus SARS-CoV-2. Since December 2020 new variants of the virus with significant mutations have been discovered, referred to as variants of concern (VOC). At the point, the occurrence of three VOC is especially monitored; B.1.1.7 (discovered in UK), B.1.351 (discovered in South Africa) and P.1 (discovered in Brazil). The earliest statistics about the occurrence of VOC in Region Dalarna, Sweden, is from February 2021 and the occurrence before that is still unknown. In the region analysis of specimen in case of suspected COVID-19 is divided into the different categories patients, healthcare-staff, infection tracing and public. Existing statistics is based almost exclusively on the occurrence of VOC in specimen from the public. Aim: The aim of this study was to examine the occurrence of SARS-CoV-2 VOC among specimens collected from patients, healthcare staff and infection tracing in Region Dalarna during December 2020-January 2021. The study also aimed to examine when the spread of each VOC started in the region. Method: SARS-CoV-2 positive specimen collected within the categories during the time was analyzed with RT-PCR and melting curve analysis for detection of VOC-characteristic mutations. Results: A few cases of B.1.1.7 was detected already in December and an increased percentage of B.1.1.7 was detected within the categories during January, suggesting that a regional spread started at the time. Only a few cases of B.1.351 and/or P.1 was detected within the categories, suggesting that a regional spread of these had not yet started in January.

Dans la mucoviscidose, le tableau clinique est dominé par les infections respiratoires qui constituent la cause majeure de morbidité. Diverses espèces fongiques sont décrites dans ces infections, notamment les Scedosporium et le complexe Rasamsonia argillacea pour lesquels les connaissances restent limitées. Dans ce travail, nous avons évalué l’intérêt de l’amplification des séquences répétitives de l’ADN pour la différenciation spécifique et infraspécifique de ces champignons. La rep-PCR a d’abord été appliquée à l’analyse d'isolats du genre Scedosporium. La rep-PCR a produit des résultats concordants avec ceux obtenus par séquençage du gène de la bêta-tubuline, amplification aléatoire de fragments d’ADN polymorphes et séquençage multi-loci. Elle permet également l’identification précise des espèces au sein du complexe R. argillacea. L’analyse des résultats obtenus sur 116 isolats a montré la capacité de ces champignons à coloniser de manière chronique les voies respiratoires, un même profil électrophorétique étant observé généralement chez un même patient. Enfin, nous avons produit de nouvelles données sur l’écologie des Scedosporium en étudiant différents biotopes au Maroc. Comme précédemment rapporté,ces champignons préfèrent les environnements impactés parles activités humaines. On les rencontre dans des sols de pH neutre, riches en matières organiques et pauvres en sels. Enfin, si S. apiospermum était l’espèce la plus abondante, S. boydii, S. aurantiacum et S. dehoogii ont été rencontrés avec des fréquences comparables. En conclusion, les données générées renforcent nos connaissances sur l’épidémiologie des infections causées par ces pathogènes émergents. / In cystic fibrosis (CF), respiratory infections are the leading cause of morbidity and mortality. Bacteria are the most common causative agents of these infections, but an increasing number of fungal species may also be found, including Scedosporium species and species of the Rasamsonia argillacea complex. In order to improve our knowledge on the epidemiology of these infections, here we evaluated the interest of PCR amplification of repetitive DNA sequences (rep-PCR) for species identification and strain delineation. rep-PCR was applied to the retrospective analysis of a panel of 63 isolates belonging to the Scedosporiumgenus. Results were consistent with those obtained by beta-tubulingene sequencing, random amplification of polymorphic DNA and Multilocus Sequence Typing. rep-PCR also permitted precise species identification in the R. argillacea complex. Analysis of the data obtained on 116 isolates revealed the capacity of these fungi to chronically colonize the airways of patients with CF, a unique electrophoretic profile being observed usually for each patient. Finally, we produced in this thesis new data about the ecology of Scedosporium species by studying different biotopes in Morocco. As previously reported, these fungi are mainly found in human-impacted areas. Also they prefer soils with a neutral pH, a high organic matter content and a very low mineral salts content. In addition, if S. apiospermum was by far the predominant species, S. boydii, S. aurantiacum and S. dehoogii were encountered with similar frequencies. In conclusion, data provided here reinforce our knowledge on the epidemiology of the infections caused by these emerging pathogens.

Streptococcus (S.) agalactiae sind grampositive, in Ketten gelagerte Kokken, die auf Blutagar eine Hämolyse zeigen. Aufgrund ihrer Zugehörigkeit zur Lancefield-Gruppe B werden sie auch als Gruppe B Streptokokken (GBS) bezeichnet (Hof, 2005). GBS sind die Hauptursache von Sepsis, Meningitis und Pneumonie bei Neugeborenen (Schrag, et al., 2000). Die Arbeit beschäftigte sich mit der Genotypisierung von GBS. Darüber hinaus konnten auch Einblicke in die Phylogenese sowie die Populationsstruktur von GBS gewonnen werden. Ziel war es, einen DNA-Microarray zu entwickeln und zur Genotypisierung von GBS einzusetzen. Während der Evaluierung des DNA Microarray konnten stammspezifische Muster beobachtet werden, diese wurden durch bereits etablierte Typisierungmethoden (MLST) bekannten Genotypen zugeordnet. Die Ergebnisse wurden in einer Datenbank zusammengefasst. Mithilfe der Datenbank konnte die Software zur Auswertung entwickelt werden. (siehe http://alere-technologies.com/en/products/lab-solutions.html). Der DNA-Microarray trägt Sonden für GBS-spezifische Virulenzfaktoren und Oberflächenmarker. Für die auf dem Microarray basierende Typisierung wurden 11 über das ganze Genom verteilte Gene bzw. Gencluster (bac, alp, pil1 locus, pepS8, fBsB, capsule locus, hylB, abiG-I/-II plus Q8DZ34, pil2 locus, nss plus srr plus rogB2 und rgfC/A/D/B) ausgewählt. Ubiquitär vorkommende, konservierte Gene (z. B. cylD/cylE) eignen sich nicht als Marker für eine Typisierung, wurden aber als Kontrollen und zur Normierung eingeschlossen. Zur vollständigen Charakterisierung wurden außerdem Sonden für hochmobile plasmidgebundene Resistenzgene wie z. B. erm(A), erm(B), erm(C), tet(M), emrB/qacA aufgetragen (Aracil, et al., 2002; Betriu, et al., 2003; Uh, et al., 2001). Diese Gene sind nicht für GBS spezifisch. Sie eignen sich z. B. für eine Unterscheidung einzelner Isolate, nicht jedoch für die Unterteilung der GBS Population in verschiedene Stämme. Für die vorliegende Arbeit wurden insgesamt 448 klinische Isolate von GBS ausgewählt und untersucht. Darunter waren Isolate, die schwerwiegende Erkrankungen wie Sepsis und Meningitis verursacht haben, Isolate aus lokalen Infektionen sowie Isolate von asymptomatischen/gesunden Trägern. Zu Vergleichszwecken wurden außerdem Isolate aus der Veterinärmedizin (von bovinen Mastitisfällen) und humane Isolate aus einer geographisch weit entfernten Region (Trinidad und Tobago) genotypisiert. Für 36 ausgewählte Isolate mit repräsentativen Hybridisierungsmustern wurde zusätzlich eine Typisierung mittels Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) (Jones, et al., 2003) durchgeführt. Die Hybridisierungsmuster vom Microarray wurden mit Daten aus diesem bereits etablierten Typisierungssystem verbunden. Durch die Verknüpfung beider Methoden konnte eine Einteilung der GBS Isolate in verschiedene Stämme vorgenommen werden. Mit Hilfe des eBURST-Algorithmus wurde gezeigt, dass einige Hybridisierungsmuster sich zu Gruppen zusammenfügen. Dieses Verfahren veranschaulicht die Populationsstruktur und beschreibt die genetische Vielfalt. Mit den 11 definierten Markern konnten die untersuchten Isolate 76 verschiedenen Stämmen bzw. „hybridization profiles“ (HP) zugeordnet werden. Die Einteilung beruht auf dem Fehlen bzw. Vorhandensein einzelner Gene/Gencluster bzw. deren allelischen Varianten. Diese Stämme korrelieren mit den durch MLST definierten klonalen Komplexen (CC). Isolate mit identischen oder ähnlichen Hybridisierungsprofilen gehören zum selben CC. Dagegen können Isolate mit einem ähnlichen MLST-Profil verschiedene Hybridisierungsmuster zeigen. Es konnte außerdem häufig beobachtet werden, dass ansonsten ähnliche Stämme sich in einzelnen Merkmalen, z. B. Kapsel-Genen, alp- oder pili-Genen, voneinander unterscheiden, und dass diese Gene unabhängig voneinander variieren. Zusätzlich zeigten einige ubiquitäre Gene/Gencluster, die sich in den publizierten Genomsequenzen immer an derselben Position befinden, zahlreiche verschiedene Allele. Welches Allel in einem gegebenen Stamm gerade vorliegt, scheint dabei eher zufällig zu sein. Eine Erklärung dieses Phänomens könnte in vergangenen Rekombinationsereignissen liegen. Auch eine konvergente Evolution könnte diskutiert werden. Ähnliche Stämme/ „hybridization profiles“ wurden in Analogie zu den MLST-definierten klonalen Komplexen zu Gruppen zusammengefügt. Das bedeutet jedoch nicht notwendigerweise eine direkte Verwandtschaft der Isolate im Sinne des Vorhandenseins eines unmittelbaren gemeinsamen Vorfahren. Die Typisierung sowohl über den DNA-Microarray als auch über die MLST kann nicht die „wahre“ Phylogenese im Rahmen der Evolutionsgeschichte und Herkunft widerspiegeln. Sie stellt lediglich ein zufälliges Modell dar, ein Ordnungssystem im Sinne eines genetischen Fingerabdrucks, das einen Vergleich von Isolaten, aber keine Rückschlüsse über deren Abstammung und Herkunft erlaubt.Die untersuchten GBS Isolate konnten in fünf klonale Komplexe (CC19, CC23, CC26, CC103, CC130) eingeteilt werden, deren Häufigkeit unterschiedlich war. Deutsche humanmedizinische Isolate konnten vorwiegend CC19 zugeordnet werden. Karibische humanmedizinische Isolate sind zumeist CC19 und CC23 zugehörig. Bovine Isolate gehören meist zu CC19 und CC103. Unter humanen Isolaten ist CC103 rar. Vermutlich basierend auf der geografischen und wirtsspezifischen Herkunft der untersuchten GBS Isolate gibt es Unterschiede in der Populationsstruktur. In der vorliegenden Arbeit war CC19 der am häufigsten gefundene und außerdem ein genetisch besonders inhomogener CC. Er besteht aus mehreren unterschiedlichen, bisher als eigenständig angesehenen CCs (darunter CC1, CC17, CC19 und CC22). Diese werden von dem zur MLST-Verwandtschaftsanalysen verwendeten eBURST-Algorithmus zu CC19 zusammengefasst, seit die MLST-Profile von 'missing links' zwischen den CCs identifiziert wurden, da eBURST „gemeinsame Vorfahren“ nicht von durch horizontalem Gentransfer bzw. durch Hybridisierungen entstandenen „Chimären“ unterscheiden kann. Da diese Komplexe klar unterscheidbare Hybridisierungsmuster aufweisen, wurden sie hier als CC19/01, CC19/17, CC19/19 und CC19/22 bezeichnet. Einzelne Gene traten in Gruppen von Isolaten aus verschiedener Herkunft unterschiedlich häufig auf. So fand sich der Virulenzfaktor scpB in 412 von 418 humanen Isolaten (98,6 %), aber nur in 10 von 21 Rinderisolaten (48 %). Ferner ließ sich beobachten, dass invasive Isolate weniger wahrscheinlich abiGI-/II und Q8DZ34 tragen, jedoch häufiger pil1 locus, fbsB (515) und Kapseltyp III sowie pil2b, nss/srr und rgf (COH1 like) aufweisen. Einige dieser Marker erscheinen zusammen in CC19/17-Stämmen, welche häufig bei invasiven Krankheitsverläufen beobachtet werden. CC19 (incl. ST01, ST17, ST19) konnte bei neonatalen Sepsis-Fällen in verschiedenen geografischen Regionen isoliert werden (Brzychczy-Wloch, et al., 2012; Ryu, et al., 2014; Sorensen, et al., 2010; Strakova, et al., 2010; Tien, et al., 2011). Zusätzlich wurden andere Virulenzfaktoren wie speM (Exotoxin M) und das cyl-Operon (beta-Hämolysin) untersucht. In lediglich sieben Isolaten wurde speM nachgewiesen. Das cyl-Operon konnte in allen Isolaten gefunden werden, sein Nachweis ist daher für eine Vorhersage der Virulenz eines gegebenen Isolates nicht hilfreich. Es konnte kein einzelner Faktor zur definitiven Unterscheidung zwischen invasiven Isolaten und Trägerisolaten bestimmt werden. Für die Virulenz eines Isolates ist wahrscheinlich nicht das bloße Vorhandensein oder Fehlen eines bestimmten Genes ausschlaggebend, sondern dessen Expression in vivo. Wichtig wäre in diesem Zusammenhang auch die genaue Betrachtung der Sequenz eines als Virulenzfaktor angesehenen Genes sowie die Untersuchung der zugehörigen regulatorischen Gene. Über den Nachweis der Gene erm(A), erm(B) und erm(C) konnte eine Aussage über die Macrolid-/Clindamycinresistenz eines GBS Isolates getroffen werden. Bei keinem der karibischen Isolate wurden erm Gene nachgewiesen. Innerhalb der deutschen GBS Population wurde erm(B) am häufigsten beobachtet. Die Gene erm(A) und erm(C) waren in humanen Isolaten selten und wurden in bovinen Isolaten überhaupt nicht gefunden. Das Tetracyclinresistenzgen tet(M) wurde häufig in humanen Isolaten und sehr selten in veterinärmedizinischen Isolaten gefunden. Für weiterführende Untersuchungen könnte die beschriebene Typisierungsmethode verfeinert werden. So lassen sich z. B. die oben beschriebenen 11 ausgewählten Typisierungsmarker des Microarrays mit denen der MLST zu einem 18 Marker-System verknüpfen. Daneben können auch erm-, cad-, mer- oder tet-Gene zur Feststellung oder zum Ausschluss der Identität verwandter Isolate in vitro oder in silico verwendet werden. Mit der nun einsatzbereiten Genotypisierungsmethode können in Zukunft weitere Studien zur Untersuchung regionaler und wirtsspezifischer Unterschiede der GBS Population durchgeführt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der DNA-Microarray stabile und reproduzierbare Resultate erbringt. Es kann ein detaillierter Befund erstellt werden, die Ergebnisse sind mit denen anderer Typisierungsmethoden und der Genomsequenzierung vergleichbar. Jedoch steht mit dem DNA-Microarray ein wesentlich unkomplizierteres und schnelleres Procedere zur Verfügung, welches zudem geringere Kosten verursacht.:1. Einleitung 5 1.1 Gegenstand der Untersuchung 5 1.2 Entdeckungsgeschichte 6 1.3 Klinische Bedeutung 7 1.4 Veterinärmedizinische Bedeutung 9 1.5 Stand der Forschung mit Hinblick auf Typisierung von GBS 9 1.6 Ziele der vorliegenden Untersuchung 10 1.7 Vorgehensweise 11 1.7.1 Untersuchungsmaterial 11 1.7.2 Untersuchungsmethode 11 1.8 Zur Typisierung ausgewählte Marker 12 2. DNA Microarray-Based Typing of Streptococcus agalactiae Isolates 15 2.1 Abstract 16 2.2 Introduction 17 2.3 Materials and methods 18 2.3.1 Bacterial isolates 18 2.3.2 Ethics statement 18 2.3.3 Preparation of genomic DNA 19 2.3.4 MLST 19 2.3.5 Microarray design and protocol optimization 19 2.3.6 Microarray procedures 20 2.3.7 eBURST 21 2.4 Results 22 2.4.1 Typing GBS by MLST 22 2.4.2 Genotyping GBS by microarray hybridization 22 2.4.3 Population structure 25 2.4.4 Detection of antibiotic resistance markers 25 2.4.5 Detection of heavy metal resistance markers 26 2.5 Discussion 27 2.6 Acknowledgments 30 2.7 References 31 2.8 Tables and figures 33 3. Zusammenfassung 45 3.1 Zusammenfassung 45 3.2 Summary 49 4. Korrespondenz mit dem Editor 53 4.1 Hinweise des Editors und der Gutachter 53 4.2 Antworten an den Editor 56 4.3 Endgültige Annahme 58 Anhang 61 / Streptococcus (S.) agalactiae are Gram-positive, chain-forming cocci, which show hemolysis on blood agar. They are also referred to group B streptococci (GBS) because of their affiliation to Lancefield-group B (Hof, 2005). GBS are the main cause of sepsis, meningitis and pneumonia in newborns (Schrag, et al., 2000). The work focused on genotyping of GBS. The aim was to develop a DNA microarray and to use it for epidemiological typing of GBS. During the evaluation of the microarray, strain-specific patterns could be observed and these patterns assigned to genotypes as defined by other typing methods (MLST). The results were summarized in a database that subsequently was developed into software for automated analysis of experiments (http://alere-technologies.com/en/products/lab-solutions.html). The DNA microarray carries probes for GBS specific virulence factors and surface markers. For the microarray-based typing, 11 genes or gene clusters were selected that are distributed across the entire genome (bac, alp, pil1 locus, pepS8, fBsB, capsule locus, hylB, abiG-I/-II plus Q8DZ34, pil2 locus, nss plus srr plus rogB2 and rgfC/A/D/B). Ubiquitous, conserved genes (e.g. cylD/cylE) were included to be used as species markers and controls. Furthermore, probes for highly mobile plasmid-borne resistance genes such as erm(A), erm(B), erm(C), tet(M), emrB/qacA were also included (Aracil, et al., 2002; Betriu, et al., 2003; Uh, et al., 2001). These genes are not specific to GBS, but they are found in some isolates. They can be used to distinguish individual, related isolates, rather than for a definition of distinct strains. A total of 448 isolates of GBS was selected and examined for the present work. Among them were isolates from severe diseases, such as sepsis and meningitis, isolates from local infections as well as isolates from asymptomatic/healthy carriers. For comparison, isolates from veterinary medicine (from cases of bovine mastitis) and human isolates from a geographically distant region (Trinidad and Tobago) were genotyped. For 36 selected isolates with representative hybridization patterns, parallel typing was performed using a second method, multilocus sequence typing (MLST) (Jones, et al., 2003). Hybridization patterns on the Microarray could thus be linked to this already established typing system. With the array based GBS typing isolates could be divided into 76 different strains or 'hybridization profiles', HP. The classification with both methods is based on the absence or presence of individual genes or gene clusters or their allelic variants. Similar isolates were lumped together. The eBURST algorithm was used to group strain-specific patterns into groups of related strains illustrating the population structure and describing the genetic diversity. Groups of similar hybridization patterns largely correlate with the clonal complexes (CC) defined by MLST. While isolates with identical or similar hybridization profiles belong to the same CC, isolates with a similar MLST profile can show different hybridization patterns. It has also often been observed that otherwise similar strains differ from each other in individual traits, e.g. capsule genes, alp or pili genes, and that these genes vary independently of one another. In addition, some ubiquitous genes/gene clusters, which are always localized at the same position in the published genomic sequences, show numerous different alleles and related strains (that belong to one clonal complex) might differ in the presence of one allele. Alleles are thus not linked to clonal complexes, but rather randomly distributed. An explanation of this phenomenon could be a frequent occurrence of recombination events or horizontal gene transfers. A convergent evolution could also be discussed as an alternative explanation. A similarity of hybridization profiles does not necessarily mean a direct phylogenetic relationship between the isolates in the sense of being derived from a direct common ancestor. Typing both the DNA microarray and the MLST cannot reflect the 'true' phylogenesis, evolutionary history and origin. Assuming frequent recombination i.e., random events, the MLST profiles as well as the hybridization patterns can be used as genetic fingerprints, allowing a comparison of isolates, but no conclusions about their phylogeny and origin. The investigated GBS isolates were classified into five clonal complexes (CC19, CC23, CC26, CC103, CC130) with very different relative abundances indicating differences in the population structure with regard to geographic origin and host organisms. German medical isolates were mainly assigned CC19. Caribbean medical isolates mostly were assigned to CC19 and CC23. Bovine isolates usually belonged to CC19 and CC103. Among human isolates, CC103 was rare. In the present work, CC19 was the most abundant and the genetically most inhomogeneous CC. Several different clusters that previously been regarded as CCs (CC1, CC17, CC19 and CC22) have recently been merged to CC19 by the eBURST algorithm since MLST profiles of missing links between the CCs have been identified. Unfortunately, eBURST cannot distinguish whether two MLST types are linked by true common ancestors or by hybrid or chimera strains originating from horizontal gene transfers or hybridization events. Since these complexes within CC19 have clearly distinguishable hybridization patterns, they have been referred to herein as CC19/01, CC19/17, CC19/19 and CC19/22, and we assume that they are linked by hybridizations or gene transfers rather than by shared ancestry. Few differences were found between isolates from different origins. The virulence factor scpB was found in 412 of 418 human isolates (98.6%), but only in 10 of 21 bovine isolates (48%). Furthermore, it was observed that invasive isolates are less likely to carry abiGI-/II and Q8DZ34, but are more likely to have pil1 locus, fbsB (515) and capsule type III as well as pil2b, nss/srr and rgf (COH1 like). Some of these markers appear together in CC19/17 strains, which are often observed in invasive disease. speM (exotoxin M) was also investigated. It was detected only in seven isolates. Contrarily, the cyl (beta-hemolysin) operon was found in all isolates. Thus, it detection is not helpful for a prediction of the virulence of a given isolate. No single factor could be identified that allowed a definitive distinction between invasive isolates and carrier isolates. Probably, the virulence of an isolate does not depend on the presence or absence of one particular gene. In this context, it would be important to investigate the expression in vivo of the various putative virulence factors as well as the allelic variants of the factors and of their associated regulatory genes. Macrolide-/clindamycin resistance genes erm(A), erm(B) and erm(C) can also be detected by the microarray. None of these genes was identified in any of the Caribbean isolates. Within the German GBS population, erm(B) was most frequently observed. The genes erm(A) and erm(C) were rare in human isolates, and they were not found in bovine isolates. The tetracycline resistance gene tet(M) was observed frequently in human isolates but only very rarely in veterinary isolates. With the genotyping method that was developed during the present work, further studies can be carried out to study regional and host-specific differences in the GBS population. For future investigations, the described typing method could further be refined. For example, the 11 selected typing markers on the microarray can be combined with those from MLST to one comprehensive marker system. In addition, it is also possible to use genes on mobile genetic elements such as resistance genes (erm, cad, mer or tet) to prove or to rule out the identity of related isolates in vitro or in silico. In our study, it was shown that the DNA microarray provides stable and reproducible results that are comparable to those of other typing methods and genome sequencing. However, since the DNA microarray offers a much more uncomplicated and faster procedure, which also results in lower costs, it is more suitable to a routine setting.:1. Einleitung 5 1.1 Gegenstand der Untersuchung 5 1.2 Entdeckungsgeschichte 6 1.3 Klinische Bedeutung 7 1.4 Veterinärmedizinische Bedeutung 9 1.5 Stand der Forschung mit Hinblick auf Typisierung von GBS 9 1.6 Ziele der vorliegenden Untersuchung 10 1.7 Vorgehensweise 11 1.7.1 Untersuchungsmaterial 11 1.7.2 Untersuchungsmethode 11 1.8 Zur Typisierung ausgewählte Marker 12 2. DNA Microarray-Based Typing of Streptococcus agalactiae Isolates 15 2.1 Abstract 16 2.2 Introduction 17 2.3 Materials and methods 18 2.3.1 Bacterial isolates 18 2.3.2 Ethics statement 18 2.3.3 Preparation of genomic DNA 19 2.3.4 MLST 19 2.3.5 Microarray design and protocol optimization 19 2.3.6 Microarray procedures 20 2.3.7 eBURST 21 2.4 Results 22 2.4.1 Typing GBS by MLST 22 2.4.2 Genotyping GBS by microarray hybridization 22 2.4.3 Population structure 25 2.4.4 Detection of antibiotic resistance markers 25 2.4.5 Detection of heavy metal resistance markers 26 2.5 Discussion 27 2.6 Acknowledgments 30 2.7 References 31 2.8 Tables and figures 33 3. Zusammenfassung 45 3.1 Zusammenfassung 45 3.2 Summary 49 4. Korrespondenz mit dem Editor 53 4.1 Hinweise des Editors und der Gutachter 53 4.2 Antworten an den Editor 56 4.3 Endgültige Annahme 58 Anhang 61

Cranberry common bean (Phaseolus vulgaris L.) is planted worldwide and consumed as a critical food source of human protein, fibre, carbohydrates, and minerals. Marsh spot (MS) is a physiogenic disorder which severely impacts seed quality in common beans. Previous studies indicate that MS involves a nutritional disorder caused by Mn deficiency. However, the inheritance and genetic mechanism of MS resistance are still not fully understood. To investigate the genetics of MS resistance, a population of 138 recombinant inbred lines (RILs) was developed from a bi-parental cross between a susceptible cultivar Messina and a resistant cultivar Cran09. The population and its two parents were evaluated for MS resistance during five consecutive years from 2015 to 2019 in both sandy and heavy clay soils in Morden, Manitoba, Canada. The severities of MS were rated and subsequently converted to MS resistance index (MSRI) and MS incidence (MSI). Statistical analyses indicated that MSI and MSRI were highly correlated (r = 0.96-0.99) and had high broad-sense heritability (H²) of 86.5% and 83.2%, respectively. Joint segregation analysis (JSA) of 18 phenotypic datasets from five years and two soil types showed that MS resistance was controlled by four major genes with genetic interactions - one of which may suppress the additive effect of the other three genes. To identify the quantitative trait loci (QTL) and the candidate genes associated with the MS resistance, the 138 RILs and the two parents were sequenced using genotyping by sequencing approach. A total of 52,676 SNPs were detected. After further filtering with a threshold of minor allele frequency > 0.01 and call rate > 20%, 2,061 SNPs were retained and then imputed for genetic map construction and QTL mapping. A genetic map consisting of 2,058 SNP markers on 11 linkage groups or chromosomes was constructed, which covered 1,004 recombination blocks with a total length of 6,449 cM and an average block of 6.42 cM. Three linkage map-based QTL-mapping models ICIM-ADD, ICIM-EPI, and GCIM and one genome-wide association study (GWAS) model RTM-GWAS for 18 phenotypic datasets from different years and soil types were used for identification of QTL. A total of 36 QTL, including 21 of additive and 15 of epistatic effects, were identified. Functional gene annotation analysis revealed 151 Mn-related candidate genes across the common bean reference genome and 17 of them harbored the six QTL discovered in this study. In conclusion, MS resistance in common bean is a highly heritable trait and controlled by several major and minor genes. The results of JSA and QTL mapping advance the current understanding of the genetic mechanisms of MS resistance in cranberry common bean, and provide additional resources for application in genomics-assisted breeding and potential isolation and functional characterization of the candidate genes.

Many countries in the global south - which harbour the majority of the world’s biodiversity - face serious resource limitations and a lack of access to affordable sequencing services. Furthermore, biodiversity research and monitoring of non-model, threatened and/or cryptic species often relies on low-quality non-invasive genetic samples. In situ conservation genomics approaches optimised for field conditions and low-quality DNA can help empower local researchers and meet their needs. To do so, however, accessible and reproducible sequencing and genotyping alternatives are needed. I designed a SNP panel as a field-friendly genotyping approach for two species of Amazonian primates using both high- and low-quality DNA samples, and two different sequencing platforms, Illumina and Nanopore. I used 14 high-quality genomes to identify a set of 210 SNPs that allow for identification of species (twelve SNPs), sex (twelve SNPs) and individual identity (186 SNPs) in two species of tamarins, Leontocebus weddelli and Saguinus imperator. Primers, adapters and indexes were designed in a Genotyping-in-Thousands by sequencing approach that is compatible with both sequencing platforms. This approach is based on sequencing multiplexed PCR products of a few hundred target SNPs to genotype thousands of individuals in a single sequencing run. In an effort to make conservation genomics more accessible, the reproducible pipeline to obtain the informative SNPs is being modulated with Snakemake, a workflow management system. / Muchos países en el sur global - los cuales poseen la mayoría de la biodiversidad mundial - enfrentan serias limitaciones de recursos y una falta de acceso a servicios económicos de secuenciación. Con frecuencia, la investigación y el monitoreo de biodiversidad y especies no-modelo, amenazadas y/o crípticas, dependen de muestras genéticas no-invasivas de baja calidad. La genómica de la conservación in situ optimizada para condiciones de campo y ADN de baja calidad puede empoderar a investigadorxs locales y ayudarles a responder a sus necesidades. Para ello, sin embargo, se requieren alternativas accesibles y reproducibles de secuenciación y genotipado. Diseñé un panel de SNPs como una aproximación de genotipado apta para el campo y dirigida a dos especies de primates amazónicos con el uso de ADN de baja y alta calidad, y dos plataformas de secuenciación (Illumina y Nanopore). Usé 14 genomas de alta calidad para encontrar 210 SNPs que permiten la identificación de la especie (doce SNPs), del sexo (doce SNPs) y de la identidad individual (186 SNPs) en dos especies de pichicos, Leontocebus weddelli y Saguinus imperator. Los cebadores, adaptadores e índices fueron diseñados con un enfoque de Genotyping-in-Thousands by sequencing (Genotipado en los miles por secuenciación) que es compatible con ambas plataformas de secuenciación. Este método está basado en la secuenciación de productos de PCR multiplexados de unos cientos de SNPs para genotipar miles de individuos en una sola corrida de secuenciación. En un intento de mejorar la accesibilidad de la genómica de la conservación, el proceso reproducible para obtener a los SNPs informativos está siendo modulado con Snakemake, un sistema de manejo de flujos de trabajo.

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Tesis por compendio / [ES] La medicina actual se dirige hacia un enfoque más personalizado basándose en el diagnóstico molecular del paciente a través del estudio de biomarcadores específicos. Aplicando este principio molecular, el diagnóstico, pronóstico y selección de la terapia se apoyan en la identificación de variaciones específicas del genoma humano, como variaciones de un único nucleótido (SNV). Para detectar estos biomarcadores se dispone de una amplia oferta de tecnologías. Sin embargo, muchos de los métodos en uso presentan limitaciones como un elevado coste, complejidad, tiempos de análisis largos o requieren de personal y equipamiento especializado, lo que imposibilita su incorporación masiva en la mayoría de los sistemas sanitarios. Por tanto, existe la necesidad de investigar y desarrollar soluciones analíticas que aporten información sobre las variantes genéticas y que se puedan implementar en diferentes escenarios del ámbito de la salud con prestaciones competitivas y económicamente viables. El objetivo principal de esta tesis ha sido desarrollar estrategias innovadoras para resolver el reto de la detección múltiple de variantes genéticas que se encuentran en forma minoritaria en muestras biológicas de pacientes, cubriendo las demandas asociadas al entorno clínico. Las tareas de investigación se centraron en la combinación de reacciones de discriminación alélica con amplificación selectiva de DNA y el desarrollo de sistemas ópticos de detección versátiles. Con el fin de atender el amplio abanico de necesidades, en el primer capítulo, se presentan resultados que mejoran las prestaciones analíticas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante la incorporación de una etapa al termociclado y de un agente bloqueante amplificando selectivamente las variantes minoritarias que fueron monitorizadas mediante fluorescencia a tiempo real. En el segundo capítulo, se logró la discriminación alélica combinando la ligación de oligonucleótidos con la amplificación de la recombinasa polimerasa (RPA), que al operar a temperatura constante permitió una detección tipo point-of-care (POC). La identificación de SNV se llevó a cabo mediante hibridación en formato micromatriz, utilizando la tecnología Blu-Ray como plataforma de ensayo y detección. En el tercer capítulo, se integró la RPA con la reacción de hibridación alelo especifica en cadena (AS-HCR), en formato array para genotipar SNV a partir de DNA genómico en un chip. La lectura de los resultados se realizó mediante un smartphone. En el último capítulo, se presenta la síntesis de un nuevo reactivo bioluminiscente que se aplicó a la monitorización de biomarcadores de DNA a tiempo real y final de la RPA basada en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), eliminando la necesidad de una fuente de excitación. Todas las estrategias permitieron un reconocimiento especifico de la variante de interés, incluso en muestras que contenían tan solo 20 copias de DNA genómico diana. Se consiguieron resultados sensibles (límite de detección 0.5% variante/total), reproducibles (desviación estándar relativa < 19%), de manera sencilla (3 etapas o menos), rápida (tiempos cortos de 30-200 min) y permitiendo el análisis simultaneo de varios genes. Como prueba de concepto, estas estrategias se aplicaron a la detección e identificación en muestras clínicas de biomarcadores asociados a cáncer colorrectal y enfermedades cardiológicas. Los resultados se validaron por comparación con los métodos de referencia NGS y PCR, comprobándose que se mejoraban los requerimientos técnicos y la relación coste-eficacia. En conclusión, las investigaciones llevadas a cabo posibilitaron desarrollar herramientas de genotipado con propiedades analíticas competitivas y versátiles, aplicables a diferentes escenarios sanitarios, desde hospitales a entornos con pocos recursos. Estos resultados son prometedores al dar respuesta a la demanda de tecnologías alternativas para el diagnóstico molecular personalizado. / [CA] La medicina actual es dirigeix cap a un enfocament més personalitzat basant-se en el diagnòstic molecular del pacient a través de l'estudi de biomarcadors específics. Aplicant aquest principi molecular, el diagnòstic, pronòstic i selecció de la teràpia es recolzen en la identificació de variacions específiques del genoma humà, com variacions d'un únic nucleòtid (SNV). Per a detectar aquests biomarcadors, es disposa d'una àmplia oferta de tecnologies. No obstant això, molts dels mètodes en ús presenten limitacions com un elevat cost, complexitat, temps d'anàlisis llargues o requereixen de personal i equipament especialitzat, la qual cosa impossibilita la seua incorporació massiva en la majoria dels sistemes sanitaris. Per tant, existeix la necessitat d'investigar i desenvolupar solucions analítiques que aporten informació sobre les variants genètiques i que es puguen implementar en diferents escenaris de l'àmbit de la salut amb prestacions competitives i econòmicament viables. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha sigut desenvolupar estratègies innovadores per a resoldre el repte de la detecció múltiple de variants genètiques que es troben en forma minoritària en mostres biològiques de pacients, cobrint les demandes associades a l'entorn clínic. Les tasques d'investigació es van centrar en la combinació de reaccions de discriminació al·lèlica amb amplificació selectiva de DNA i al desenvolupament de sistemes òptics de detecció versàtils. Amb la finalitat d'atendre l'ampli ventall de necessitats, en el primer capítol, es presenten resultats que milloren les prestacions analítiques de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) mitjançant la incorporació d'una etapa al termociclat i d'un agent bloquejant amplificant selectivament les variants minoritàries que van ser monitoritzades mitjançant fluorescència a temps real. En el segon capítol, es va aconseguir la discriminació al·lèlica combinant el lligament d'oligonucleòtids amb l'amplificació de la recombinasa polimerasa (RPA), que en operar a temperatura constant va permetre una detecció tipus point-of-care (POC). La identificació de SNV es va dur a terme mitjançant hibridació en format micromatriu, utilitzant la tecnologia Blu-Ray com a plataforma d'assaig i detecció. En el tercer capítol, es va integrar la RPA amb la reacció d'hibridació al·lel específica en cadena (AS-HCR), en format matriu per a genotipar SNV a partir de DNA genòmic en un xip. La lectura dels resultats es va realitzar mitjançant un telèfon intel·ligent. En l'últim capítol, es presenta la síntesi d'un nou reactiu bioluminescent que es va aplicar al monitoratge de biomarcadors de DNA a temps real i final de la RPA basada en la transferència d'energia de ressonància de bioluminescència (BRET), eliminant la necessitat d'una font d'excitació. Totes les estratègies van permetre un reconeixement específic de la variant d'interès, fins i tot en mostres que només contenien 20 còpies de DNA genòmic diana. Es van aconseguir resultats sensibles (límit de detecció 0.5% variant/total), reproduïbles (desviació estàndard relativa < 19%), de manera senzilla (3 etapes o menys), ràpida (temps curts de 30-200 min) i permetent l'anàlisi simultània de diversos gens. Com a prova de concepte, aquestes estratègies es van aplicar a la detecció i identificació en mostres clíniques de biomarcadors associats a càncer colorectal i a malalties cardiològiques. Els resultats es van validar per comparació amb els mètodes de referència NGS i PCR, comprovant-se que es milloraven els requeriments tècnics i la relació cost-eficàcia. En conclusió, les investigacions dutes a terme van possibilitar desenvolupar eines de genotipat amb propietats analítiques competitives i versàtils, aplicables a diferents escenaris sanitaris, des d'hospitals a entorns amb pocs recursos. Aquests resultats són prometedors en donar resposta a la demanda de tecnologies alternatives per al diagnòstic molecular personalitzat. / [EN] Current medicine is moving towards a more personalized approach based on the patients' molecular diagnosis through the study of specific biomarkers. Diagnosis, prognosis and therapy selection, applying this molecular principle, rely on identifying specific variations in the human genome, such as single nucleotide variations (SNV). A wide range of technologies is available to detect these biomarkers. However, many of the employed methods have limitations such as high cost, complexity, long analysis times, or requiring specialized personnel and equipment, making their massive incorporation in most healthcare systems impossible. Therefore, there is a need to research and develop analytical solutions that provide information on genetic variants that can be implemented in different health scenarios with competitive and economically feasible performances. The main objective of this thesis has been to develop innovative strategies to solve the challenge of multiple detection of genetic variants that are found in a minority amount in patient samples, covering the demands associated with the clinical setting. Research tasks focused on the combination of allelic discrimination reactions with selective DNA amplification and the development of versatile optical detection systems. In order to meet the wide range of needs, in the first chapter, the analytical performances of the polymerase chain reaction (PCR) were improved by incorporating a thermocycling step and a blocking agent to amplify selectively minority variants that were monitored by real-time fluorescence. In the second chapter, allelic discrimination was achieved by combining oligonucleotide ligation with recombinase polymerase amplification (RPA), which operates at a constant temperature, allowing point-of-care (POC) detection. SNV identification was carried out by hybridization in microarray format, using Blu-Ray technology as the assay platform and detector. RPA was integrated with allele-specific hybridization chain reaction (AS-HCR), in an array format to genotype SNV from genomic DNA on a chip in the third chapter. The reading of the results was performed using a smartphone. In the last chapter, a new bioluminescent reagent was synthesized. It was applied to real-time and endpoint DNA biomarker monitoring based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), eliminating the need for an excitation source. All the strategies allowed specific recognition of the target variant, even in samples containing as few as 20 copies of target genomic DNA. Sensitive (limit of detection 0.5% variant/total), reproducible (relative standard deviation < 19%), simple (3 steps or less), fast (short times of 30-200 min) results were achieved, allowing simultaneous analysis of several genes. As proof of concept, these strategies were applied to detect and identify biomarkers associated with colorectal cancer and cardiological diseases in clinical samples. The results were validated by comparison with reference methods such as NGS and PCR, proving that the technical requirements and cost-effectiveness were improved. In conclusion, the developed research made it possible to develop genotyping tools with competitive analytical properties and versatile, applicable to different healthcare scenarios, from hospitals to limited-resource environments. These results are promising since they respond to the demand for alternative technologies for personalized molecular diagnostics. / The authors acknowledge the financial support received from the Generalitat Valenciana PROMETEO/2020/094, GRISOLIA/2014/024 PhD Grant and GVA-FPI-2017 PhD grant, the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness MINECO projects CTQ2016-75749-R and PID2019-110713RB-I00 and European Regional Development Fund (ERDF). / Lázaro Zaragozá, A. (2022). Study of Strategies for Genetic Variant Discrimination and Detection by Optosensing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185216 / Compendio

In diese Dissertation, Ich konzentriere mich insbesondere darauf, wie die Artbestimmung in der Gattung Eimeria mit der Wirtsspezifität bei Nagetierarten zusammenhängt. Zunächst bietet diese Arbeit eine Reihe von Methoden zur Beurteilung der Prävalenz auf der Ebene der Parasitenarten in Mus musculus. Als Ergebnis war es möglich, drei verschiedene Eimeria-Spezies zu identifizieren, Mäuse mit Doppelinfektionen zu erkennen und die artenspezifische Prävalenz in Abhängigkeit von der Wirtsdichte vorherzusagen. Zur Identifizierung von Eimeria spp. über verschiedene Wirtsarten hinweg wurde eine neuartige Hochdurchsatz-Multi-Locus-Genotypisierungsmethode etabliert und mit der auf zuvor etablierten Markern basierenden Einzelmarker-Genotypisierung verglichen. Dies bestätigte, dass die Art E. falciformis in einer einzigen Wirtsart, der Hausmaus, vorkommt. E. vermiformis und E. apionodes konnten jedoch nicht unterschieden werden, was auf eine einzige Art mit breitem Wirtsspektrum hindeutet. E. vermiformis und E. apionodes konnten jedoch nicht unterschieden werden, was auf eine einzige Art mit breiter Wirtsverwendung in einem phylogenetischen Artkonzept schließen lässt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die hohe Wirtsspezifität, die traditionell für Eimeria-Parasiten angenommen wird, fragwürdig ist und dass die Identifizierung von Arten durch Wirtsassoziation vermieden werden sollte. Durch molekulare Amplifikation, Sequenzierung, Genotypisierung und phylogenetische Analyse war es möglich, Eimerien auf Artniveau zu identifizieren und die Wirtsspezifität in Isolaten aus natürlichen Systemen in Frage zu stellen. In einer breiteren Perspektive betonte diese Arbeit die Notwendigkeit, Strategien bei der Erkennung, Quantifizierung und Identifizierung von Parasiten zu standardisieren und zu kombinieren, um ein besseres Verständnis auf evolutionärer und ökologischer Ebene zu erlangen. / This PhD thesis combines different approaches for parasite identification to assess the diversity of parasites in natural systems. Particularly, I focus on how species identification in the genus Eimeria is linked to its host specificity in rodent species. First, this thesis provides a set of methods to assess prevalence at the species level in Mus musculus systems. The approach integrates morphological description with molecular methods for detection, niche approximation and phylogenetic reconstruction. As a result, three different Eimeria species were identified, mice with double infections were detected and species-specific prevalence were predicted to be host density-dependent. For identification of Eimeria spp. across different host species, a novel high-throughput multi-locus genotyping was established and compared with single-marker genotyping. The multi-locus genotyping approach provided a higher resolution to distinguish closely related Eimeria isolates. This confirmed the species E. falciformis to have a single host species, the house mice. However, E. vermiformis and E. apionodes could not be distinguished suggesting a single species with broader host usage in a phylogenetic species concept. These findings show that the high host specificity traditionally assumed for Eimeria parasites is questionable, and that identification of species by host association should be avoided. The approaches for identification of Eimeria spp. Developed here allowed differentiation of closely related isolates with indistinguishable morphology. Molecular amplification, sequencing, genotyping and phylogeny allowed the identification of Eimeria at species level and to question host specificity in isolates from natural systems. In a broader perspective, this work emphasised the necessity to standardise and combine strategies in parasite detection, quantification and identification to gain better understanding at an evolutionary and ecological level.

Bovine tuberculosis (TB) is a contagious neglected zoonosis of cattle that is prevalent but under-investigated in Cameroon, hence this study was designed to assess the epidemiology of bovine TB in cattle, risks for M. bovis infection in cattle and humans; and public health implications of zoonotic bovine TB in the highlands of Cameroon. A retrospective study of meat inspection records (1994 – 2010) was done to estimate the prevalence of TB lesions in slaughtered cattle in the North West region. The prevalence of bovine TB and anti-bovine TB antibodies in live cattle based on tuberculin skin tests (2 surveys) and immune-chromatographic assays respectively were carried out in the Western and Adamawa highlands of Cameroon. The performance of the tuberculin tests for bovine TB diagnosis in cattle using various tuberculin skin test cut-off points against the detection of anti-bovine TB antibodies (hypothesised risks of exposure) was compared. Suspected TB lesions from slaughtered cattle and infected human sputa were cultured on Lowentein – Jesen and Middlebrook 7H9 media to isolate mycobacteria agents for molecular genotyping using genomic deletion analysis and spoligotyping. Risk factors for exposure and transmission of zoonotic bovine TB infection of cattle and cattle professionals, and its public health significance were determined using structured questionnaires. Seventeen years of meat inspection record revealed that suspect TB lesions were identified in 599 of 129,165 slaughtered cattle at the Bamenda abattoir. The lungs and associated lymph nodes (over 60%) were the most affected tissues. Other results showed that the prevalence of anti-bovine TB antibodies in cattle in the study regions was 37.17%. Chi square statistics revealed that irrespective of the tuberculin test cut-off value (P<0.05; χ2>48), strong associations existed between the detection of anti-bovine TB antibodies and disease status. A 95% confidence interval analysis of the comparative cervical tuberculin tests revealed that the prevalence rates were 4.67% – 7.15%, 12.02% – 15.67% and 20.56% – 24.98% at the ≥ 4mm, ≥ 3mm and ≥ 2mm cut-off points, respectively. Overall, the best test performance was realised at ≥ 3-mm, though the ≥ 2-mm cut-off point predicted more positive reactors. Age, sex, breed and husbandry practices served as significant (P<0.05) risks to the prevalence and exposure of bovine TB in cattle. The feedbacks from cattle professionals suggested that there was high possibility of cattle to cattle and cattle to human transmission of bovine TB such as intimate and repeated animal / animal and animal / human interactions, consuming unpasteurised milk and eating raw meat. Genomic deletion analysis of cultured isolates showed evidence of M. tuberculosis from cattle and M. bovis from human while spoligotyping identified five cattle M. bovis strains; and four spoligotype patterns that had not been previously described anywhere. The study has important epidemiological and public health implications requiring prompt and decisive actions from the Cameroonian authority towards controlling zoonotic bovine TB in both humans and animals. A multidisciplinary approach is needed for further collaborative research and effective control strategies such as enhancing the awareness of people to this deadly disease through continuous education, proper food handling and personal hygiene, healthy husbandry practices and maintenance of the environment.

Les travaux présentés dans cette thèse s’intéressent à l’immobilisation de biomolécules pour le développement d’outils d’analyse multiparamétrique pour la caractérisation d’échantillons biologiques et le diagnostic, sur un support de type biopuce couplé à une détection colorimétrique.Un premier axe de recherche concerne le développement de tests d’hybridation d’acides nucléiques et d’immunotests à haut-débit automatisés sur plaque de filtration. Cette méthode a permis la mise au point d’un test de génotypage automatisé pour le dépistage transfusionnel haut-débit (génotypage érythrocytaire étendu) en collaboration avec l’Établissement Français du Sang Rhône-Alpes (EFS-RA). Il permet d’analyser 96 échantillons en quatre heures, et de caractériser six génotypes par échantillon. Cet outil a fait l’objet d’une validation sur un panel de 293 donneurs.La seconde partie des travaux présentés s’intéresse au développement d’un procédé d’immobilisation d’oligonucléotides sur un polymère particulier (PolyshrinkTM) pour l’élaboration d’un système d’analyse miniaturisé. Plusieurs stratégies d’activation ont été envisagées et ont abouti à la mise au point d’une technique d’immobilisation d’oligonucleotides in situ dans des plots d’hydrogel. La méthode de fabrication permet d’obtenir une matrice de plots d’hydrogel de 60 µm de diamètre et d’une hauteur de 6 µm en moyenne. En outre, il a été démontré que les oligonucléotides immobilisés dans les plots pouvaient détecter de façon quantitative et sélective les cibles complémentaires présentes dans l’échantillon analysé en utilisant une détection par colorimétrie ou par chimiluminescence. / The work reported in this thesis focuses on biomolecules immobilization for the development of multiparametric analysis tools on a biochip coupled with a colorimetric detection, applied to the characterization of biological samples and to diagnosis.The first concern was the development of high-throughput automated hybridization tests and immunotests on a filtration plate. This method led to the elaboration of an automated platform for extended blood group genotyping in collaboration with the Etablissement Français du Sang Rhône-Alpes (EFS-RA). It enables to analyze 96 samples in four hours and to characterize six genotypes per sample. Its analytical performances were validated on a panel of 293 blood donors.The second part of this work aimed to elaborate a new strategy for oligonucleotide immobilization on an innovative polymer (PolyshrinkTM) for the development of miniaturized analysis systems. Several approaches were evaluated and led to an in-situ immobilization of oligonucleotides in hydrogel dots technique. This method leads to 6 µm hydrogel dots with a diameter of 60 µm. Moreover it was demonstrated that such immobilized oligonucleotides were able to detect targets specifically and quantitatively using either a chemiluminescent or a colorimetric detection.