Le syndrome fébrile, une des principales causes de consultation dans les services de pédiatrie en Afrique Subsaharienne, reste dans la majorité des cas liée à une maladie infectieuse (parasitaire, virale, bactérienne). Dans cette thèse, nous avons identifié les agents infectieux non bactériens responsables de la survenue des fièvres chez l'enfant afin de développer des outils moléculaires permettant l'amélioration de la surveillance épidémiologique. Pour ce faire, ce travail est divisé en 2 parties essentielles. Dans la première partie une étude transversale a été réalisée pour analyser l'infection plasmodiale dans une population d'adultes et d'enfants fébriles par microscopie et PCR.Dans la deuxième partie une autre enquête transversale a été conduite pour déterminer les principales causes étiologiques des fièvres non bactériennes chez l'enfant. Sur 203 enfants recrutés, 111 ont été diagnostiqués positifs à P. falciparum, par microscopie et par PCR (ISM). Concomitamment, des cas cliniques d'oreillons et de rougeole ont été observés respectivement sur les 203 enfants fébriles. Le génome complet de la souche responsable d'oreillons a été séquencé et compte 15263 nucléotides. Enfin, le virus responsable de la rougeole a été détecté par PCR et le génotypage a révélé que cette souche était celle qui était responsable de l'épidémie de Libreville.En conclusion, le syndrome fébrile chez l'enfant à Franceville est essentiellement dû aux infections à P. falciparum et Paramyxovirus. Ces résultats montrent que les infections submicroscopiques (ISM)à P. falciparum peuvent non seulement servir de réservoir mais aussi initier une symptomatologie sévère chez l'enfant. / Febrile syndrome, the main cause of consultation in pediatric wards from Sub-Saharan Africa remains in great majority associated with infectious diseases (parasites, viruses, bacteria). In this thesis, we identified the infectious agents associated with childhood fever in order to develop suitable molecular tools allowing the epidemiological surveillance. This work is divided into two main parts. Firstly, we analyzed the prevalence of Plasmodium infection in febrile patients (children and adults) by combined microscopy and PCR to determine the rate of P. falciparum submicroscopic infection (SMI).Secondly, another cross-sectional survey was conducted at pediatric ward of HASG in which the main etiological causes of febrile illness in children were investigated. Of 203 children recruited, 111 were diagnosed positive for P. falciparum by microscopy and PCR (SMI). Concomitantly, clinical cases of Mumps and Measles viruses were diagnosed respectively. The whole genome of mump virus strain isolated has been sequenced and composed of 15,263 nucléotides. Finally, Measles virus has been diagnosed by PCR and genetic analysis revealed that this strain associated with the outbreak of Libreville. In conclusion, febrile syndrome in childhood at Franceville is essentially caused by P. falciparum and Paramyxovirus infections. These results show that submicroscopic infection of P. falciparum can serve as a reservoir and also able to initiate a severe symptomatology in children.

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INTRODUÇÃO: A frequência de Candida parapsilosistem apresentado considerável aumento em UTIs neonatais. Embora a taxa de resistência dessa espécie aos azólicos seja baixa, recentemente têm sido relatados surtos de candidemia por isolados resistentes. A capacidade de adesão e formação de biofilme por essa espécie confere maior potencial patogênico e resistência aos antifúngicos. Portanto, a vigilância epidemiológica, tanto da resistência aos antifúngicos como da virulência dos isolados, é fundamental para o controle e prevenção das infecções e surtoshospitalares. A técnica de MALDI-TOF MS pode ser uma ferramenta útil para realizar análises proteômicas das células planctônicas e sésseis de Candida parapsilosis,e identificar possíveis alvos terapêuticos ou biomarcadores, específicos do biofilme. MÉTODOS: Isolados clínicos do complexo Candida parapsilosis de dois hospitais universitários públicos brasileiros, foram submetidos à identificação por RAPD, RFLP e MALDI-TOF MS e aos testes de suscetibilidade aos antifúngicos. Ensaios de formação de biofilme foram realizados para quantificar a biomassa, a atividade metabólica e ainda, avaliar atividade in vitrodos antifúngicos contra as células sésseis dos isolados com alta formação de biofilme. A análise proteômica por MALDI-TOF MS das células planctônicas e sésseis dos isolados com alta formação de biofilme, foi realizada nas plataformas VITEK-MS(TM) e Microflex(TM). Isolados de Candida parapsilosis (sensu stricto) foram genotipados por PFGE e análise de microssatélites. Os genótipos foram correlacionados com dadosclínicos, para investigar a ocorrência de um surto em CTI adulto, e as sequências do gene ERG11dos isolados não suscetíveis aos azólicos (NSA) foram analisadas. RESULTADOS: Foram obtidos 38 isolados do complexo Candida parapsilosis, sendo Candida parapsilosis(sensu stricto) a espécie de maior frequência, superando 80% em ambos os hospitais, seguida de C. orthopsilosis e C. metapsilosis. Embora todos os isolados tenham sido suscetíveis à anfotericina B ( < 2 mg/L) e apresentado suscetibilidade intermediária à anidulafungina, caspofungina e micafungina ( > 0,002 mg/L), elevada frequência de não suscetibilidade (resistência ou suscetibilidade intermediária) ao fluconazol e voriconazol foi observada entre isolados de um dos hospitais. Alta formação de biofilme foi observada apenas entre os isolados da espécie Candida parapsilosis(sensu stricto). Por outro lado, a maioria dos isolados NSA, apresentou baixa formação de biofilme e baixa atividade metabólica. Apenas anfotericina B apresentou atividade contra os biofilmes de Candida parapsilosis. As duas plataformas de MALDI-TOF MS conseguiram diferenciar os perfis proteômicos das células planctônicas e sésseis dos isolados. A genotipagem de Candida parapsilosis(sensu stricto) revelou a persistência de isolados clonais NSA e a mutação A395T no gene ERG11foi identificada exclusivamente entre os isolados resistentes ao azólicos. O uso de corticosteroide foi associado, estatisticamente, com a ocorrência de isolados clonais NSA. CONCLUSÕES: Candida parapsilosis (sensu stricto) se mantém como a principal espécie do complexo em infecções sanguíneas. Isolados resistentes aos azólicos, com mutações no gene ERG11, ocorreram nos dois hospitais avaliados. A correlação dos genótipos com os dados clínicos evidenciou a ocorrência de um surto envolvendo isolados clonais NSA, com associação estatisticamente significativa, ao uso prévio de corticosteroides. Candida parapsilosis (sensu stricto) foi a única espécie que apresentou alta formação de biofilme, o qual demonstrou elevada resistência às equinocandinas. As duas plataformas de MALDI-TOF MS, diferenciaram os perfis proteômicos, das células planctônicas e sésseis de Candida parapsilosis, demonstrando o potencial emprego dessa tecnologia na identificação de possíveis alvos terapêuticos ou biomarcadores, específicos de biofilmes / INTRODUCTION: The frequency of Candida parapsilosis isolates has increased considerably in neonatal ICUs. Although resistance to azoles is usually low in this species, candidemia outbreaks by resistant isolates have been recently reported. Theability of adhesion and biofilm formation by this species confers higher pathogenic potential and resistance to antifungal agents. Therefore, establishment of profiles of antifungal susceptibility and virulence, besides the epidemiological surveillance ofC. parapsilosisisolates are essential for the control and prevention of nosocomial infections and outbreaks. The MALDI-TOF MS technique can be a useful tool to perform proteomic analyzes of the planktonic and sessile cells of Candida parapsilosis, identifying possible biofilm-specific therapeutic targets or biomarkers. METHODS: Candida parapsilosisclinical isolates from two Brazilian public university hospitals were identified by RAPD, RFLP and MALDI-TOF MS and submitted to antifungal susceptibility tests. Biofilm formation assays were carried out to quantify the biomass and metabolic activity, and to evaluate the in vitroactivity of antifungal drugs against the sessile cells of the isolates with high biofilm formation. Proteomic analysis of the planktonic and sessile cells of the isolates with high biofilm formation was performed in two MALDI-TOF MS platforms, VITEK-MS(TM) and Microflex(TM). Candida parapsilosis(sensu stricto) isolates were genotyped by PFGE and microsatellite analysis. The genotypes were correlated with clinical data to investigate the occurrence of an outbreak in the adult ICU andERG11gene sequences from non-susceptible to azoles (NSA) isolates were also analyzed. RESULTS: 38 clinical isolates of the Candida parapsilosiscomplex were obtained, with Candida parapsilosis(sensu stricto) being the most frequent species (exceeding 80% in both hospitals), followed by C. orthopsilosisand C. metapsilosis. Although all isolates were susceptible to amphotericin B ( < 2 mg/L) and showed intermediate susceptibility to anidulafungin, caspofungin e micafungin ( > 0,002 mg/L), high frequency of non-susceptibility (resistance or intermediate susceptibility) to fluconazole and voriconazole was observed among isolates from one of the hospitals. High biofilm formation was only observed among isolates of the Candida parapsilosis. (sensu stricto) species. On the other hand, most of the NSA isolates presented low biofilm formation and low metabolic activity. Only amphotericin B showed activity against Candida parapsilosisbiofilms. The two MALDI-TOF MS platforms were able to differentiate the proteomic profiles of planktonic and sessile cells of isolates. Candida parapsilosis(sensu stricto) genotyping revealed the persistence of clonal NSA isolates. The A395T mutation in the ERG11gene was identified exclusively among azole resistant isolates. The use of corticosteroid was statistically associated with the occurrence of clonal NSA isolates. CONCLUSIONS: Candida parapsilosis(sensu stricto) remains the main species of the complex in bloodstream infections. Azole-resistant isolates with mutations in the ERG11gene are emerging in the two hospitals evaluated. Additionally, the correlation between the genotypes and the clinical data showed the occurrence of an outbreak involving isolates resistant to azoles, with a statistically significant association with previous use of corticosteroids. Candida parapsilosis(sensu stricto) was the only species that presented high biofilm formation and resistance against echinocandins. The two MALDI-TOF MS platforms differentiated the proteomic profiles of the planktonic and sessile cells of Candida parapsilosis, demonstrating the potential use of this technology to identify possible biofilm-specific therapeutic targets or biomarkers

Reproductive containment in farmed fish is highly desired for sustainable aquaculture to prevent genetic introgression with wild conspecifics and enhance productivity by suppressing sexual maturation. A number of strategies have already been implemented or have been tested in commercially important fish (e.g. triploidy, monosexing, hormonal therapies); however, they either do not result in 100% containment, or they cannot be applied to all species. One promising new approach consists in disrupting primordial germ cells (PGCs), at the origin of germline cells, to induce sterility. The work carried out in this doctoral thesis aimed to investigate the genes involved in the survival of germ cells and subsequently conduct a functional analysis of candidate genes using CRISPR/Cas9 gene editing system to ultimately provide the basis for the development of a novel sterilisation technique. Nile tilapia was chosen as the experimental animal as it is a major aquaculture species worldwide and the control of reproduction plays a critical role in the farming productivity in this species. In addition, the species has clear advantages as its whole genome sequence is accessible, the generation time is relatively short and zygotes can be available all year round. Initially, a panel of 11 candidate genes with reported roles in survival of PGCs was investigated during the ontogenic development which led to the selection of piwi-like (piwil) gene as a target for genome editing. Then, high temperature was tested as a means to induce germ cell loss to better understand the mechanism underlying germ cell survival and apoptosis, and this study confirmed the functional importance of piwil genes in relation to germ cell loss and proliferation. In addition, the study suggested potential subfunctionalisation within the Bcl-2 gene family which requires further investigation. The next step aimed to optimise the CRISPR/Cas9 gene editing method by improving the microinjection system and testing different concentrations of sgRNAs. Over 95% of injected embryos showed on-target mutation in piwil2 via zygote injection of CRISPR/Cas9 reagents and complete KO larvae were shown in half of the mutants, producing putative sterile fish. However, there was no clear association between the phenotypes in PGCs and the mutation rate. Further comparative studies of mutant screening methods including T7E1, RGEN, HRMA, fragment analysis and NGS revealed that the genotypes of F0 are highly mosaic, suggesting that deep sequencing is recommended for accurate and high throughput F0 screening and further improvement for predictable genome editing is required for a reliable gene functional analysis in F0. In summary, the current thesis provided new scientific knowledge and supporting evidence for the use of the CRISPR/Cas9 gene editing platform to study gene function associated with sterility, with the ultimate goal to develop an alternative sterilisation method in fish.

INTRODUÇÃO: A determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno é um teste de diagnóstico pré-natal não invasivo oferecido a gestantes RhD negativo que apresentam potencial de sensibilização e/ou Doença Hemolítica Perinatal. Atualmente, este exame é realizado de rotina em diversos países, mas não no Brasil. A Clínica Obstétrica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) oferece atendimento terciário a gestantes RhD negativo, com monitorização dos títulos de anticorpos irregulares, administração da imunoglobulina anti-D e/ou terapêutica fetal, quando necessários. OBJETIVO: Avaliar a acurácia do teste semiautomatizado para determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno. METODOLOGIA: Foram coletadas prospectivamente amostras de sangue de 220 gestantes RhD negativo, com idade gestacional entre 8-28 semanas. O plasma foi obtido em no máximo 2 horas após a coleta, e uma alíquota de 1 mL foi submetida à extração de ácidos nucléicos no equipamento automatizado MagNA Pure Compact (Roche), empregando o kit Large Volume. O DNA extraído foi submetido a PCR em tempo real (Step One Plus - Applied Biosystems), usando o protocolo do grupo SAFE, que tem como alvos os éxons 5 e 7 do gene RHD. RESULTADOS: Ocorreu exclusão de 35 amostras devido a problemas pré-analíticos, aborto ou desconhecimento do fenótipo do recém-nascido. Entre as 185 amostras analisadas, 130 (70,2%) foram genotipadas como RHD+ e 55 (29,8%) RHD-. Os resultados obtidos foram comparados com a fenotipagem do cordão umbilical, e houve concordância completa (100%). Sete amostras exibiram amplificação exclusiva para o éxon 7. Essas amostras foram submetidas aos protocolos em PCR convencional, e PCR em tempo real específico para o pseudogene RHD. Ambos os ensaios apresentaram os mesmos resultados: cinco positivos e dois negativos. Nesses mesmos 7 casos, após extração da camada de leucócitos materna, os protocolos foram repetidos, e o resultado confirmou que cinco mães eram RHD. As duas amostras com resultado negativo foram submetidas ao protocolo Multiplex, envolvendo os éxons 3-9 do gene RHD, com resultados negativos, confirmando que as mães são verdadeiramente RHD- portanto o sinal do éxon 7 é provindo dos fetos que são D variantes. CONCLUSÃO: O método para a determinação do RHD fetal no plasma materno descrito demonstrou ser rápido, de fácil execução, alta precisão e reprodutível, além de indicar possíveis variantes RHD em nossa população / BACKGROUND: Fetal RHD genotype determination in maternal plasma is a noninvasive prenatal diagnostic test performed in RhD negative pregnant women at risk of alloimmunization and/or Hemolytic Disease of Fetus and Newborn. Currently, this test is routinely performed in many countries but not in Brazil. The Department of Obstetrics at Hospital das Clínicas, São Paulo University Medical School provides tertiary antenatal care for RhD negative pregnant women including anti-D immunoglobulin administration, antibody levels monitoring and intrauterine treatment if necessary. AIMS: To validate the accuracy of a semi-automated test for fetal RHD genotype determination in maternal plasma. METHODS: Two-hundred and twenty blood samples were prospectively collected between 8 and 28 weeks of gestational age. Plasma processing was performed within 2 hours after blood collection, and nucleic acids were extracted from 1mL aliquots with an automated extraction platform (MagNA Pure Compact Roche) and the Large Volume kit. RHD gene exons 5 and 7 were amplified with real-time PCR (Step One Plus - Applied Biosystems) using the SAFE group protocol. RESULTS: Thirty-five samples were excluded due to pre-analytical problems, miscarriage and missing follow-up. In the remaining 185 samples, 130 (70.2%) were genotyped as RhD+ and 55 (29.8%) RhD-. Comparison with umbilical cord blood group phenotype showed 100% concordance. Seven samples showed amplification for exon 7 only. These were further investigated with conventional and real-time PCR with an specific protocol for RHD? pseudogene: 5 were positive and 2, negative. In these 7 cases, maternal buffy-coat DNA analysis also confirmed that 5 women were RHD?. In the remaining 2 cases, a multiplex protocol directed at RHD gene exons 3-9 confirmed that both mothers were truly RhD negative so exon 7 signal comes from the fetuses, further found to harbor D variants. CONCLUSION: The present study demonstrates that fetal RHD determination in maternal plasma is a fast, easy-to-perform and reproducible technique with high accuracy in our population. Moreover, it helps in the identification of possible RHD variants in our population

O genótipo e a carga parasitária constituem dois dos principais fatores associados à patogênese na toxoplasmose congênita. Na Europa e nos EUA, o genótipo II é o mais prevalente em infecções congênitas, enquanto que na América do Sul existem evidências apontando uma maior frequência de genótipos atípicos ou recombinantes, associados a casos mais graves. A carga parasitária também parece atuar como fator de risco independente associado ao prognóstico fetal. Os objetivos do estudo foram padronizar uma amplificação quantitativa (qPCR) com iniciadores do gene B1 para avaliar a carga parasitária; determinar o genótipo parasitário por multiplex-nested-PCR-RFLP dos marcadores 5\'-SAG2, 3\'-SAG2, SAG3 e GRA6, seguido de sequenciamento para confirmação da RFLP e análise de mutações; e verificar se existiria associação entre a carga parasitária e os genótipos parasitários nas mesmas gestações. Foram analisadas 76 amostras de líquido amniótico de gestações com toxoplasmose e 31 amostras controle. A qPCR apresentou LOD de 10 parasitos/mL, detectou as 76 amostras de estudo e nenhum controle. As cargas parasitárias variaram de 222 a 808.328 parasitos/mL. Houve duas amostras com valores acima de 104 parasitos/mL, apesar de todas as gestantes serem tratadas. Na genotipagem, SAG3 amplificou 55 amostras (54 tipo III e uma tipo II); 5\' e 3\'-SAG2 amplificaram 54 amostras (todas tipo I), e GRA6, amplificou 20 amostras (todas tipo III). A única amostra com genótipo parasitário SAG3-tipo II foi a que apresentou mais mutações (n=4), carga parasitária de 958 parasitos/mL, porém o recém-nascido foi assintomático. Houve diferença do número de amostras amplificadas por SAG3, e 5\' e 3\'-SAG2 em relação a GRA6 (McNemar, p<0,001). Os sequenciamentos confirmaram 100% dos resultados de RFLP, e foram encontradas 24 amostras com e 52 sem mutações, não existindo diferenças entre as cargas parasitárias dos dois grupos (Mann-Whitney, p= 0,085). Mais de uma mutação foi observada em cinco amostras. Foram detectadas 37 mutações no estudo: 26 heterozigotas/sinônimas e 11 homozigotas/sinônimas, não havendo regiões hot spot. Quanto à correlação clínico-laboratorial, dos 76 recém-nascidos, todos apresentaram IgM positiva ao nascimento, e 75 eram assintomáticos. O único recém-nascido sintomático apresentava tríade de Sabin e uma das duas cargas parasitárias mais elevadas do estudo (309.574 parasitos/mL), porém o genótipo não foi discriminante e não havia mutações. A outra amostra com carga parasitária acima de 104 parasitos/mL pertencia a recém-nascido assintomático, com genótipo não discriminante, e sem mutações. O estudo concluiu que a técnica de Real Time PCR (qPCR) foi padronizada com sucesso, usando os iniciadores B22 e B23 do gene B1 do parasito, podendo ser empregada na rotina diagnóstica. Além disso, foi possível realizar a genotipagem das amostras incluídas no estudo, com melhor desempenho de SAG3 e 5\' e 3\'-SAG2. O sequenciamento confirmou a confiabilidade da técnica de RFLP, e encontrou frequência elevada de mutações, todas sinônimas, sem regiões hot spot, e aparentemente sem associação com a carga parasitária. Houve elevada variabilidade das cargas parasitárias, porém grande homogeneidade dos genótipos parasitários, não tendo sido observada associação entre a carga parasitária e os genótipos de T. gondii no estudo. / The genotype and the parasite load are two of the main factors associated with pathogenesis in congenital toxoplasmosis. In Europe and the USA, genotype II is the most prevalent in congenital infections, while in South America there is evidence pointing to a higher frequency of atypical or recombinant genotypes associated with more severe cases. The parasite load also appears to act as an independent risk factor associated with fetal prognosis. The study objectives were to standardize a quantitative amplification (qPCR) with B1 gene primers to assess the parasite load; determine the genotype by multiplex-nested-PCR-RFLP of 5\' and 3\'-SAG2, SAG3 and GRA6 markers, followed by sequencing to confirm RFLP and analyze mutations, verifying whether there is association between parasite load and parasite genotypes in the same pregnancies. We analyzed 76 amniotic fluid samples from pregnancies with toxoplasmosis and 31 controls. The qPCR presented LOD of 10 parasites/mL, detected the 76 study samples and no control. Parasite loads ranged from 222 to 808,328 parasites/mL. There were two samples with values above 104 parasites/mL, despite all pregnant women be treated. In genotyping, SAG3 amplified 55 samples (54 type III and 1 type II); 5 \'and 3\'-SAG2 amplified 54 samples (all type I); and GRA6, amplified 20 samples (all type III). The only sample with genotype SAG3-type II showed the highest number of mutations (n=4), parasite load of 958 parasites/mL, but the newborn was asymptomatic. There were differences in the number of samples amplified by SAG3, and 5 \'and 3\'-SAG2 over GRA6 (McNemar test, p <0.001). Sequencing confirmed 100% of the RFLP results; and found 24 samples with and 52 without mutations, with no difference between the parasite load of these two groups (Mann-Whitney, p= 0.085). More than one mutation was observed in five samples. A total of 37 mutations were detected in this study: 26 heterozygotes/synonymous and 11 homozygous/synonyms, with no hot spot regions. Regarding the clinical-laboratory correlation, among the 76 newborns, all showed positive IgM at birth, and 75 were asymptomatic. The only symptomatic newborn presented the Sabin\'s triad and one of the two higher parasite loads in the study (309,574 parasites/mL). However, the genotype was not discriminant and no mutations were detected. The other sample with parasite load above 104 parasites/mL belonged to an asymptomatic newborn with a non-discriminating genotype, and no mutations. The study concluded that the Real Time PCR (qPCR) was successfully developed with primers B22 and B23 of the parasite B1 gene, and can be used in routine practice. Moreover, it was possible to perform the samples genotyping, with better performance of SAG3 and 5 \'and 3\'-SAG2. Sequencing results confirmed the RFLP reliability, and found a high frequency of mutations, all synonymous, with no hot spot regions, and apparently not associated with the parasite load. There was a high variability in parasite load, however great homogeneity of parasite genotypes, with no association between the parasite load and T. gondii genotypes in the study.

Neste estudo, geramos ensaios de espectrometria de massa para detecção de 111 mutações nos genes RET, BRAF, NRAS, HRAS, KRAS, PIK3CA e AKT1 e avaliamos inúmeras linhagens celulares e tumores tiroidianos. Mostramos que as mutações dos genes BRAF e RAS refletem prognósticos distintos e que as mutações BRAF são altamente prevalentes em câncer metastático. Mutações dos genes PIK3CA e AKT1, esta última sendo reportada pela primeira vez no câncer de tiróide, são relativamente frequentes neste câncer. Avaliamos ainda a função do microRNA let-7 neste câncer. Mostramos que a ativação do rearranjo RET/PTC3 em células de tiróide PCCl3 reduz a expressão de let-7. Além disso, a transfecção deste microRNA em células TPC-1, que apresentam o rearranjo RET/PTC1, inibe a fosforilação de ERK, o crescimento celular e modula a expressão de genes do ciclo celular e diferenciação. Estes dados contribuem na aplicação de terapias dirigidas a efetores das vias PI3K e MAPK no câncer de tiróide, além de salientar o envolvimento do miRNA let-7 como um gene supressor tumoral nesta doença. / In this study, we designed an assay panel for genotyping 111 mutations by mass spectrometry in RET, BRAF, NRAS, HRAS, KRAS, PIK3CA, AKT1 and other related genes in many thyroid cancer cell lines and tumors. We show that patients with BRAF and RAS mutations have distinct prognosis and that BRAF mutations are highly prevalent in metastatic thyroid cancers. Mutations of PIK3CA and AKT1, the latter not previously described in this disease, are comparatively frequent in thyroid cancers. In addition, we evaluated the role of let-7 microRNA in this cancer. We show that RET/PTC3 activation in PCCl3 thyroid cells reduces let-7 expression. Moreover, transfection of let-7 in TPC-1 cells, which harbor RET/PTC1 rearrangement, inhibits MAPK activation, reduces cell growth and modulates the expression of cell cycle and differentiation genes. These findings may contribute to the design of therapies directed at MAPK and PI3K effectors and to highlight the function of let-7 as tumor suppressor gene in thyroid cancer.

INTRODUÇÃO: A frequência de Candida parapsilosistem apresentado considerável aumento em UTIs neonatais. Embora a taxa de resistência dessa espécie aos azólicos seja baixa, recentemente têm sido relatados surtos de candidemia por isolados resistentes. A capacidade de adesão e formação de biofilme por essa espécie confere maior potencial patogênico e resistência aos antifúngicos. Portanto, a vigilância epidemiológica, tanto da resistência aos antifúngicos como da virulência dos isolados, é fundamental para o controle e prevenção das infecções e surtoshospitalares. A técnica de MALDI-TOF MS pode ser uma ferramenta útil para realizar análises proteômicas das células planctônicas e sésseis de Candida parapsilosis,e identificar possíveis alvos terapêuticos ou biomarcadores, específicos do biofilme. MÉTODOS: Isolados clínicos do complexo Candida parapsilosis de dois hospitais universitários públicos brasileiros, foram submetidos à identificação por RAPD, RFLP e MALDI-TOF MS e aos testes de suscetibilidade aos antifúngicos. Ensaios de formação de biofilme foram realizados para quantificar a biomassa, a atividade metabólica e ainda, avaliar atividade in vitrodos antifúngicos contra as células sésseis dos isolados com alta formação de biofilme. A análise proteômica por MALDI-TOF MS das células planctônicas e sésseis dos isolados com alta formação de biofilme, foi realizada nas plataformas VITEK-MS(TM) e Microflex(TM). Isolados de Candida parapsilosis (sensu stricto) foram genotipados por PFGE e análise de microssatélites. Os genótipos foram correlacionados com dadosclínicos, para investigar a ocorrência de um surto em CTI adulto, e as sequências do gene ERG11dos isolados não suscetíveis aos azólicos (NSA) foram analisadas. RESULTADOS: Foram obtidos 38 isolados do complexo Candida parapsilosis, sendo Candida parapsilosis(sensu stricto) a espécie de maior frequência, superando 80% em ambos os hospitais, seguida de C. orthopsilosis e C. metapsilosis. Embora todos os isolados tenham sido suscetíveis à anfotericina B ( < 2 mg/L) e apresentado suscetibilidade intermediária à anidulafungina, caspofungina e micafungina ( > 0,002 mg/L), elevada frequência de não suscetibilidade (resistência ou suscetibilidade intermediária) ao fluconazol e voriconazol foi observada entre isolados de um dos hospitais. Alta formação de biofilme foi observada apenas entre os isolados da espécie Candida parapsilosis(sensu stricto). Por outro lado, a maioria dos isolados NSA, apresentou baixa formação de biofilme e baixa atividade metabólica. Apenas anfotericina B apresentou atividade contra os biofilmes de Candida parapsilosis. As duas plataformas de MALDI-TOF MS conseguiram diferenciar os perfis proteômicos das células planctônicas e sésseis dos isolados. A genotipagem de Candida parapsilosis(sensu stricto) revelou a persistência de isolados clonais NSA e a mutação A395T no gene ERG11foi identificada exclusivamente entre os isolados resistentes ao azólicos. O uso de corticosteroide foi associado, estatisticamente, com a ocorrência de isolados clonais NSA. CONCLUSÕES: Candida parapsilosis (sensu stricto) se mantém como a principal espécie do complexo em infecções sanguíneas. Isolados resistentes aos azólicos, com mutações no gene ERG11, ocorreram nos dois hospitais avaliados. A correlação dos genótipos com os dados clínicos evidenciou a ocorrência de um surto envolvendo isolados clonais NSA, com associação estatisticamente significativa, ao uso prévio de corticosteroides. Candida parapsilosis (sensu stricto) foi a única espécie que apresentou alta formação de biofilme, o qual demonstrou elevada resistência às equinocandinas. As duas plataformas de MALDI-TOF MS, diferenciaram os perfis proteômicos, das células planctônicas e sésseis de Candida parapsilosis, demonstrando o potencial emprego dessa tecnologia na identificação de possíveis alvos terapêuticos ou biomarcadores, específicos de biofilmes / INTRODUCTION: The frequency of Candida parapsilosis isolates has increased considerably in neonatal ICUs. Although resistance to azoles is usually low in this species, candidemia outbreaks by resistant isolates have been recently reported. Theability of adhesion and biofilm formation by this species confers higher pathogenic potential and resistance to antifungal agents. Therefore, establishment of profiles of antifungal susceptibility and virulence, besides the epidemiological surveillance ofC. parapsilosisisolates are essential for the control and prevention of nosocomial infections and outbreaks. The MALDI-TOF MS technique can be a useful tool to perform proteomic analyzes of the planktonic and sessile cells of Candida parapsilosis, identifying possible biofilm-specific therapeutic targets or biomarkers. METHODS: Candida parapsilosisclinical isolates from two Brazilian public university hospitals were identified by RAPD, RFLP and MALDI-TOF MS and submitted to antifungal susceptibility tests. Biofilm formation assays were carried out to quantify the biomass and metabolic activity, and to evaluate the in vitroactivity of antifungal drugs against the sessile cells of the isolates with high biofilm formation. Proteomic analysis of the planktonic and sessile cells of the isolates with high biofilm formation was performed in two MALDI-TOF MS platforms, VITEK-MS(TM) and Microflex(TM). Candida parapsilosis(sensu stricto) isolates were genotyped by PFGE and microsatellite analysis. The genotypes were correlated with clinical data to investigate the occurrence of an outbreak in the adult ICU andERG11gene sequences from non-susceptible to azoles (NSA) isolates were also analyzed. RESULTS: 38 clinical isolates of the Candida parapsilosiscomplex were obtained, with Candida parapsilosis(sensu stricto) being the most frequent species (exceeding 80% in both hospitals), followed by C. orthopsilosisand C. metapsilosis. Although all isolates were susceptible to amphotericin B ( < 2 mg/L) and showed intermediate susceptibility to anidulafungin, caspofungin e micafungin ( > 0,002 mg/L), high frequency of non-susceptibility (resistance or intermediate susceptibility) to fluconazole and voriconazole was observed among isolates from one of the hospitals. High biofilm formation was only observed among isolates of the Candida parapsilosis. (sensu stricto) species. On the other hand, most of the NSA isolates presented low biofilm formation and low metabolic activity. Only amphotericin B showed activity against Candida parapsilosisbiofilms. The two MALDI-TOF MS platforms were able to differentiate the proteomic profiles of planktonic and sessile cells of isolates. Candida parapsilosis(sensu stricto) genotyping revealed the persistence of clonal NSA isolates. The A395T mutation in the ERG11gene was identified exclusively among azole resistant isolates. The use of corticosteroid was statistically associated with the occurrence of clonal NSA isolates. CONCLUSIONS: Candida parapsilosis(sensu stricto) remains the main species of the complex in bloodstream infections. Azole-resistant isolates with mutations in the ERG11gene are emerging in the two hospitals evaluated. Additionally, the correlation between the genotypes and the clinical data showed the occurrence of an outbreak involving isolates resistant to azoles, with a statistically significant association with previous use of corticosteroids. Candida parapsilosis(sensu stricto) was the only species that presented high biofilm formation and resistance against echinocandins. The two MALDI-TOF MS platforms differentiated the proteomic profiles of the planktonic and sessile cells of Candida parapsilosis, demonstrating the potential use of this technology to identify possible biofilm-specific therapeutic targets or biomarkers

INTRODUÇÃO: A determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno é um teste de diagnóstico pré-natal não invasivo oferecido a gestantes RhD negativo que apresentam potencial de sensibilização e/ou Doença Hemolítica Perinatal. Atualmente, este exame é realizado de rotina em diversos países, mas não no Brasil. A Clínica Obstétrica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) oferece atendimento terciário a gestantes RhD negativo, com monitorização dos títulos de anticorpos irregulares, administração da imunoglobulina anti-D e/ou terapêutica fetal, quando necessários. OBJETIVO: Avaliar a acurácia do teste semiautomatizado para determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno. METODOLOGIA: Foram coletadas prospectivamente amostras de sangue de 220 gestantes RhD negativo, com idade gestacional entre 8-28 semanas. O plasma foi obtido em no máximo 2 horas após a coleta, e uma alíquota de 1 mL foi submetida à extração de ácidos nucléicos no equipamento automatizado MagNA Pure Compact (Roche), empregando o kit Large Volume. O DNA extraído foi submetido a PCR em tempo real (Step One Plus - Applied Biosystems), usando o protocolo do grupo SAFE, que tem como alvos os éxons 5 e 7 do gene RHD. RESULTADOS: Ocorreu exclusão de 35 amostras devido a problemas pré-analíticos, aborto ou desconhecimento do fenótipo do recém-nascido. Entre as 185 amostras analisadas, 130 (70,2%) foram genotipadas como RHD+ e 55 (29,8%) RHD-. Os resultados obtidos foram comparados com a fenotipagem do cordão umbilical, e houve concordância completa (100%). Sete amostras exibiram amplificação exclusiva para o éxon 7. Essas amostras foram submetidas aos protocolos em PCR convencional, e PCR em tempo real específico para o pseudogene RHD. Ambos os ensaios apresentaram os mesmos resultados: cinco positivos e dois negativos. Nesses mesmos 7 casos, após extração da camada de leucócitos materna, os protocolos foram repetidos, e o resultado confirmou que cinco mães eram RHD. As duas amostras com resultado negativo foram submetidas ao protocolo Multiplex, envolvendo os éxons 3-9 do gene RHD, com resultados negativos, confirmando que as mães são verdadeiramente RHD- portanto o sinal do éxon 7 é provindo dos fetos que são D variantes. CONCLUSÃO: O método para a determinação do RHD fetal no plasma materno descrito demonstrou ser rápido, de fácil execução, alta precisão e reprodutível, além de indicar possíveis variantes RHD em nossa população / BACKGROUND: Fetal RHD genotype determination in maternal plasma is a noninvasive prenatal diagnostic test performed in RhD negative pregnant women at risk of alloimmunization and/or Hemolytic Disease of Fetus and Newborn. Currently, this test is routinely performed in many countries but not in Brazil. The Department of Obstetrics at Hospital das Clínicas, São Paulo University Medical School provides tertiary antenatal care for RhD negative pregnant women including anti-D immunoglobulin administration, antibody levels monitoring and intrauterine treatment if necessary. AIMS: To validate the accuracy of a semi-automated test for fetal RHD genotype determination in maternal plasma. METHODS: Two-hundred and twenty blood samples were prospectively collected between 8 and 28 weeks of gestational age. Plasma processing was performed within 2 hours after blood collection, and nucleic acids were extracted from 1mL aliquots with an automated extraction platform (MagNA Pure Compact Roche) and the Large Volume kit. RHD gene exons 5 and 7 were amplified with real-time PCR (Step One Plus - Applied Biosystems) using the SAFE group protocol. RESULTS: Thirty-five samples were excluded due to pre-analytical problems, miscarriage and missing follow-up. In the remaining 185 samples, 130 (70.2%) were genotyped as RhD+ and 55 (29.8%) RhD-. Comparison with umbilical cord blood group phenotype showed 100% concordance. Seven samples showed amplification for exon 7 only. These were further investigated with conventional and real-time PCR with an specific protocol for RHD? pseudogene: 5 were positive and 2, negative. In these 7 cases, maternal buffy-coat DNA analysis also confirmed that 5 women were RHD?. In the remaining 2 cases, a multiplex protocol directed at RHD gene exons 3-9 confirmed that both mothers were truly RhD negative so exon 7 signal comes from the fetuses, further found to harbor D variants. CONCLUSION: The present study demonstrates that fetal RHD determination in maternal plasma is a fast, easy-to-perform and reproducible technique with high accuracy in our population. Moreover, it helps in the identification of possible RHD variants in our population

O feijão comum é uma das principais culturas agrícolas produzidas e consumidas no Brasil e no mundo. Por isso, várias iniciativas de pesquisa buscam dar subsídios ao melhoramento da cultura, que visa a desenvolver cultivares mais produtivos e tolerantes a estresses biótico e ábiótico, além de agregar valor nutricional e tecnológico aos grãos. Nesse cenário, no presente estudo, buscou-se identificar, a partir da abordagem de mapeamento associativo, regiões genômicas envolvidas no controle de caracteres agronômicos e no teor de macro e micronutrientes em grãos de feijão comum. Para tanto, um painel de acessos e linhagens foi (i) genotipado por sequenciamento, cujos dados perdidos foram imputados; (ii) e fenotipados para 5 caracteres agronômicos e para o teor de 13 nutrientes, em duas condições experimentais - campo e casa de vegetação. A partir da informação genotípica, foram investigados (i) a estrutura populacional, (ii) o grau de parentesco e (iii) a extensão do desequilíbrio de ligação (DL). Para as análises fenotípicas, foi utilizada a abordagem de modelos mistos. Finalmente, o mapeamento associativo foi realizado utilizando o modelo FarmCPU. Um total de 35.527 e 9.388 SNPs, com MAF &ge; 0,05, distribuídos ao longo dos 11 cromossomos de P. vulgaris, foi obtido considerando os limites de 80 e 10% de dados perdidos, respectivamente. A análise da estrutura populacional e as estimativas de parentesco permitiram evidenciar a clara distinção entre os acessos oriundos de pools gênicos diferentes. Tais fatores influenciaram fortemente a extensão do DL; portanto, medidas que corrigem para estes vieses foram adotadas e possibilitaram a constatação de que os maiores blocos genômicos em DL estão contidos nas regiões centroméricas e pericentroméricas dos cromossomos. Igualmente, foi detectado DL entre locos de cromossomos diferentes, sugerindo que o processo de melhoramento e o sistema de cruzamento da espécie contribuem para a magnitude do DL em feijão, uma vez que os vieses decorrentes da estrutura populacional e do parentesco foram corrigidos. Considerando os fenótipos avaliados, o painel aqui utilizado apresentou maior variabilidade fenotípica para os caracteres agronômicos \'dias para o florescimento\' (DPF), \'dias para formação do legume\' (DPFL), \'número de legumes por planta\' (NLPP), \'número de sementes por legume\' (NSPL) e \'massa de 100 grãos\' (M100), e para o teor dos nutrientes cobre (Cu), ferro (Fe) e zinco (Zn) presentes nos grãos. A partir do mapeamento associativo, foram identificados 176 SNPs associados aos caracteres agronômicos e teores de macro e micronutrientes. Destes, 112 estão localizados em regiões gênicas - exons (71), introns (29), 5\'-UTR (5) e 3\'-UTR (7). Logo, tais polimorfismos, principalmente aqueles localizados em exons ou próximos a locos, como o Ppd, tradicionalmente apontado como envolvido no controle de DPF, são fortes candidatos para explicar as alterações fenotípicas observadas. Os demais 64 SNPs estão localizados em regiões inter-gênicas, em porções do cromossomo nas quais a extensão do DL pode chegar a mais de 1 Mb. Portanto, é válido recomendar a investigação da região em DL que flanqueia o SNP na busca de genes associados ao controle da variação fenotípica. / Common bean is an important crop produced and consumed in Brazil and worldwide. Several research initiatives have been set up to implement breeding programs for developing more productive cultivars tolerant to biotic and abiotic stresses, and improving nutritional and technological grain quality. Therefore, the aim of this study was to use association mapping in order to identify the genomic regions controlling agronomic traits and the content of macroand micronutrients in common bean. A panel of accessions and lines was (i) genotyped by sequencing, with imputed missing data; (ii) and phenotyped for five agronomic traits and 13 grain nutrients content under two sets of experimental conditions (field and greenhouse). The genotypic information provided a basis for investigating (i) population structure, (ii) kinship and (iii) the extent of linkage disequilibrium (LD). Mixed models were used for predicting phenotypic means. Finally, association mapping was performed using the FarmCPU model. A total of 35,527 and 9,388 SNPs (MAF &ge; 0.05) distributed over the 11 chromosomes of P. vulgaris was obtained based on two missing data thresholds (80 and 10%). Population structure and kinship analysis highlighted the distinction between accessions from different gene pools. These factors strongly influenced the extent of LD. Measures to correct these biases indicated that the major LD genomic blocks were located within centromeric and pericentomeric regions. In addition, high LD was detected between loci from different chromosomes, suggesting that the breeding process and autogamy also influence LD in common bean, given that the bias resulting from population structure and kinship were corrected. The panel used exhibited high phenotypic variability for the following agronomic traits: \'days to flowering\' (DTF), \'days to pod formation\' (DTPF), \'number of pods per plant\' (NPPP), \'number of seeds per pod\' (NSPP) and \'mass of 100 grains\' (M100); and the following grain nutrient contents: copper (Cu), iron (Fe) and zinc (Zn). A total of 176 SNPs were identified by association mapping, 112 located in gene regions - exons (71), introns (29), 5\'-UTR (5) and 3\'-UTR (7). Such polymorphisms, especially those within exons or near loci as Ppd, traditionally considered to be involved in DTF control, are strong candidates for providing an elucidation of phenotypic variability. The remaining 64 SNPs were located in intergenic regions, in which the DL decays over 1 Mb. It would therefore be worth investigating LD in the region flanking the SNPs for genes associated with phenotypic variation.