Die Regulation der Genexpression steht am Anfang vieler zellbiologischer Prozesse wie beispielsweise dem Zellwachstum oder der Differenzierung. Gene werden an Promotoren transkribiert, wobei ein Promotor selbst aus vielen logischen Einheiten aufgebaut ist, den Transkriptionsfaktorbindestellen (TFBSs). Diese können sehr nah beieinander liegen, aber auch weit entfernt voneinander sein. Sie werden spezifisch von Transkriptionsfaktoren (TFs) gebunden, die die Transkritptionsrate z.B. verstärken (Enhancer) oder schwächen (Silencer) können. Zwei oder mehr dieser TFBSs mit bestimmtem Abstand werden als "Module" zusammengefasst, die über Spezies hinweg konserviert sein können. Typischerweise findet man Module in Zellen mit einem Zellkern. Spezies mit gemeinsamen Modulen können ein Hinweis auf die gemeinsame phylogenetische Abstammung darstellen, aber auch gemeinsame Funktionsmechanismen von TFs über Gene hinweg aufdecken. Heutzutage sind verschiedene Anwendungen verfügbar, mit denen nach TFBSs in DNA gesucht werden kann. Zum Zeitpunkt des Verfassens dieser Arbeit sind aber nur zwei kommerzielle Produkte bekannt, die nicht nur TFBSs, sondern auch Module erkennen. Deshalb stellen wir hier die freie und quelloffene Lösung "AIModules" vor, die diese Lücke füllt und einen Webservice zur Verfügung stellt, der es erlaubt nach TFBSs sowie nach Modulen auf DNA- und auf RNA-Abschnitten zu suchen. Für die Motivesuche werden entweder Matrizen aus der Jaspar Datenbank oder Matrizen vom Anwender verwendet. Darüberhinaus zeigen wir, dass unser Tool für die TF Suche nur Sekunden benötigt, wohingegen conTraV3 mindestens eine Stunde für dieselbe Analyse braucht. Zusätzlich kann der Anwender bei unserem Tool den Grad der Konserviertheit für TFs mit angeben und wir zeigen, dass wir mit unserer Lösung, die die Jaspar Datenbank heranzieht, mehr Module finden, als ein kommerziell verfügbares Produkt. Weiterhin kann mit unserer Lösung auch auf RNA-Sequenzen nach regulatorischen Motiven gesucht werden, wenn der Anwender die dafür nötigen Matrizen liefert. Wir zeigen dies am Beispiel von Polyadenylierungsstellen. Zusammenfassend stellen wir ein Werkzeug vor, das erstens frei und quelloffen ist und zweitens entweder auf Servern veröffentlicht werden kann oder On-Site auf einem Notebook läuft. Unser Tool erlaubt es Promotoren zu analysieren und nach konservierten Modulen sowie TFBSs in Genfamilien sowie nach regulatorischen Elementen in mRNA wie z.B. Polyadenylierungsstellen oder andere regulatorische Elemente wie beispielsweise Enhancern oder Silencern in genomischer DNA zu suchen. / Regulation of gene expression is at the root of many processes in cellular biology such as cell growth and differentiation. Promotors are the starting points for the transcription of a gene. The promotor itself consists of transcription factor binding sites (TFBSs) which can be closely located or vastly apart. They are recognized and bound by transcription factors (TFs) which themselves can e.g. enhance or silence the transcribing process by the RNA polymerases. Two or more of those transcription factor binding sites within a certain range are called a "module". Typically, those are found in cells with a nucleus and they may be conserved throughout species. The knowledge of modules may indicate a phylogenetic relationship among species but may also provide insight into the concerted actions of TFs on different genes. Currently there are a number of tools available that can enable a user to find TFBSs on DNA. But at the time of assembling this thesis, there are only two commercial software products available, that can not only detect TFs but also modules. Therefore, we present a free and open source solution that fills this gap by providing a web service that searches for TFBSs and modules on DNA as well as RNA stretches, called "AIModules". For that, matrices from the Jaspar database or user input matrices are used for motif discovery. Additionally, we show that our tool does TF analysis in seconds, whereas tools like conTraV3 took at least an hour. Furthermore, for the module search the user can specify the degree of conservation of the TFs. We show that with our solution using the JASPAR database we find more modules than a commercially available tool. Moreover, with our application RNA stretches can also be searched for regulatory motifs if suitable matrices are provided. We illustrate this for polyadenylation sites. Thus, our solution is free and open source, and can be deployed on servers as well as provided on-site on a notebook. We provide a tool to analyze promotors and search for conserved modules as well as common TFBSs in gene families, search for regulatory elements in mRNA such as polyadenylation sites or other regulatory elements such as enhancers or silencers in genomic DNA.

Cellular growth and proliferation are among the most important processes for cells and organisms. One of the major determinants of these processes is the amount of proteins and consequently also the amount of ribosomes. Their synthesis involves several hundred proteins and four different ribosomal RNA species, is highly coordinated and very energy-demanding. However, the molecular mechanims of transcriptional regulation of the protein-coding genes involved, is only poorly understood in mammals. In this thesis, unbiased genome-wide knockout reporter screens were performed, aiming to identify previously unknown transcriptional regulators of ribosome biogenesis factors (RiBis), which are important for the assembly and maturation of ribosomes, and ribosomal proteins (RPs), which are ribosomal components themself. With that approach and follow-up (validation) experiments, ALDOA and RBM8A among others, could be identified as regulators of ribosome biogenesis. Depletion of the glycolytic enzyme ALDOA led to a downregulation of RiBi- and RPpromoter driven reporters on protein and transcript level, as well as to a downregulation of ribosome biogenesis gene transcripts and of mRNAs of other genes important for proliferation. Reducing the amount of the exon junction complex protein RBM8A, led to a more prominent downregulation of one of the fluorescent reporters, but this regulation was independent of the promoter driving the expression of the reporter. However, acute protein depletion experiments in combination with nascent RNA sequencing (4sU-Seq) revealed, that mainly cytosolic ribosomal proteins (CRPs) were downregulated upon acute RBM8A withdrawal. ChIP experiments showed RBM8A binding to promoters of RP genes, but also to other chromatin regions. Total POL II or elongating and initiating POL II levels were not altered upon acute RBM8A depletion. These data provide a starting point for further research on the mechanisms of transcriptional regulation of RP and RiBi genes in mammals. / Zelluläres Wachstum und Proliferation zählen zu den wichtigsten Prozessen für Zellen und Organismen. Eine der größten Determinanten dieser Prozesse ist die Menge an Proteinen und in der Konsequenz auch die Menge an Ribosomen. Deren Synthese erfordert mehrere hundert Proteine und vier verschiedene ribosomale RNA-Spezies, ist stark koordiniert und sehr energiefordernd. Dennoch sind die molekularen Mechanismen der transkriptionellen Regulation der beteiligten protein-kodierenden Gene in Säugetieren nur schlecht verstanden. In dieser Arbeit wurden hypothesenfreie genomweite Knockout-Reporterscreens mit dem Ziel durchgeführt, bisher unbekannte transkriptionelle Regulatoren von ribosomalen Biogenesefaktoren (RiBis), welche wichtig für den Zusammenbau und die Reifung der Ribosomen sind, und ribosomalen Proteinen (RPs), welche selbst ribosomale Bestandteile sind, zu identifizieren. Durch diesen Ansatz und nachfolgende (Validierungs- )Experimente, konnten unter anderem ALDOA und RBM8A als Regulatoren ribosomaler Biogenese identifiziert werden. Eine Depletion des glykolytischen Enzyms ALDOA führte sowohl zu einer Herunterregulation von RiBi- und RP-Promotor-gesteuerten Reportern auf Protein- und Transkriptebene, als auch zu einer Herunterregulation von ribosomalen Biogenesegentranskripten und von mRNAs anderer für die Proliferation wichtiger Gene. Eine Reduktion der Menge des Exon-Junction-Komplexproteins RBM8A führte zu einer deutlicheren Herunterregulation eines der beiden fluoreszierenden Reporter, aber diese Regulation war unabhängig vom Promotor, der die Expression des Reporters steuert. Akute Proteinabbauexperimente in Verbindung mit einer Sequenzierung naszenter RNA (4sU-Seq) zeigten allerdings, dass hauptsächlich zytosolische ribosomale Proteine (CRPs) nach akuter RBM8A-Depletion herunterreguliert waren. ChIP-Experimente zeigten RBM8A-Bindung an Promotoren von RP-Genen, aber auch an andere Chromatinregionen. Gesamt-POL II- oder elongierende und initiierende POL II-Mengen waren nach akuter RBM8A-Depletion nicht verändert. Diese Daten stellen einen Ausgangspunkt für weitere Forschung zu den Mechanismen transkriptioneller Regulation von RP- und RiBi-Genen in Säugetieren dar.

Östrogen bewirkt in physiologischer Konzentration in Kardiomyozyten eine schnelle Induktion des Egr-1-Promotors. Dieser Effekt wird über die Östrogenrezeptoren ER alpha und ER beta vermittelt. Überraschenderweise erfolgt die östrogenabhängige Genregulation von Egr-1 aber nicht über den klassischen Signalweg mittels Bindung des Östrogenrezeptors an östrogenresponsive Elemente (ERE), sondern findet unter Bindung von Serumfaktor an serumresponsive Elemente (SRE) des Egr-1-Promotors unter Mitbeteiligung des ERK1/2-Signalweges statt. Am Beispiel der Egr-1-Induktion durch Östrogen ließ sich die Bedeutung serumresponsiver Elemente (SRE) für die Genregulation durch Östrogen aufzeigen. In der vorliegenden Arbeit konnte damit ein neuartiger Signalweg bei der östrogenabhängigen schnellen Genaktivierung in Kardiomyozyten gezeigt werden. / The myocardium is a target tissue for estrogen. Here, we have identified rapid non-nuclear estrogen effects on the expression of the early growth response gene-1 (Egr-1) in cardiomyocytes. Egr-1 mRNA and protein were rapidly and strongly induced by estrogen in an estrogen receptor-dependent manner via the extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2. A promoter analysis study of a 1.2-kilobase Egr-1 promoter fragment revealed that the serum response elements (SREs) but not the estrogen response elements or AP-1 sites are responsible for Egr-1 induction by estrogen, identifying a novel mechanism of estrogen receptor-dependent gene activation in the myocardium. Both estrogen receptor-alpha and -beta induced the Egr-1 promoter via the SREs. These results identify SREs as important promoter control elements for an estrogen receptor-dependent mechanism of gene activation in the myocardium.

Das Studium der Entwicklung von Tieren ist eine der ältesten Disziplinen in der Biologie. Die gesammelten Daten von unzähligen Untersuchungen an den verschiedensten Spezies wurden dazu benutzt, um ein generelles Verständnis des tierischen Lebenszykluses zu formulieren. Ein wichtiges Ergebnis der intensiven Untersuchungen war vor etwa einem Jahrhundert die Entdeckung spezifischer morphologischer Veränderungen, die sich während der Teilungsphase, der Zeitperiode die der Befruchtung und Aktivierung des Eies am Anfang der Embryogenese folgt, vollziehen. Diese Befunde führten schlussendlich zur Formulierung des Konzepts einer „Mid-Blastula Transition“ (MBT). Bisher gibt es nur eine Theorie die die Regulierung der MBT in befriedigender Weise erklärt. Dies ist das Model des Kern/Plasma-Verhältnis, welches sich aus dem Verhältnis DNA-Menge zu Zytoplasmavolumen ableitet. Es erklärt die MBT-Aktivierung durch bisher unbekannte, maternal deponierte Faktoren im Ei, welche die MBT Aktivierung kontrollieren, deren Konzentration allerdings mit jeder Zellteilung verdünnt wird, bis sie schließlich ihre blockierende Funktion verloren haben. Zwar wurde die Existenz dieses Mechanismuses schon in zahlreichen Spezies experimentell bewiesen, allerdings bleibt er nur eine ungenaue Beschreibung der ablaufenden Prozesse und lässt weiterhin viele Fragen unbeantwortet. Vor diesem Hintergrund hat diese Arbeit gezeigt, dass die Zellzyklen in Embryonen von Medaka (Oryzias latipes) ihre Synchronität schon nach dem vierten oder fünften Teilung verlieren, und diese durch ein Teilungsmuster ersetzt wird, das als „metasynchron“ bezeichnet wird. In diesem Teilungsmuster verlaufen die Zellteilungen in Wellen, die im Zentrum des Embryos beginnen und sich von dort nach außen hin radial ausbreiten. Noch ist der Sinn einer auf diese Art verlaufenden Zellteilung unbekannt, auch wenn es verschiedene Theorien gibt die versuchen den zugrunde liegenden Mechanismus zu erklären. Allen voran steht die Theorie eines unterschiedlichen Zugangs zu Faktoren innerhalb des Dotters. Allerdings wird diese Theorie durch die Beobachtungen in verformten Embryonen wiederlegt, in denen sich die Teilungswellen von einer Seite des Embryos zur gegenüberliegenden Seite ausgebreitet haben. Somit bleibt der Mechanismus für diese Art der Zellteilung weiterhin unklar. Nicht zu vergessen ist, dass diese deformierten Embryonen eine der möglichen Konsequenzen asymmetrischer Furchung während einer frühen Zellteilung sind. Asymmetrische Teilungen treten in Medaka in einer erheblichen Anzahl von Embryonen auf und haben einen direkten Einfluss auf die gleichmäßige Verteilung des Zytoplasma. Leider war es nicht möglich die Auswirkungen einer solchen ungleichmäßigen Verteilung aufzudecken, auch wenn man davon ausgehen kann, dass ein ausreichend großes Ungleichgewicht zu unterschiedlichen Zeitpunkten der MBT-Aktivierung in verschiedenen Zellgruppen führen müsste. Ähnliche Beobachtungen wurden bereits in anderen Spezies gemacht, und es wurde vermutet, dass diese in ungleichmäßigen Zellteilungen begründet lagen. Weiterhin wurde bewiesen, dass die zygotische Transkription schon wesentlich vor dem bisher angenommenen frühesten Zeitpunkt aktiv ist. Darüber hinaus wurden Hinweise gefunden, die darauf hindeuten, dass die Transkription in Embryonen von Medaka in zwei Schritten einsetzt. Der erste Zeitpunkt ist das 16-Zellen-Stadium, in dem die ersten Zellen identifiziert wurden, die Phosphorylierung für RNAPII zeigten, und der zweite das64-Zellen Stadium, in dem der Anteil an p-RNAPII positiven Zellen signifikant anstieg. Ein schrittweiser Anstieg der Transkription wurde bereits in anderen Spezies beobachtet, auch wenn in diesen Fällen nur eine Erhöhung der mRNA-Menge festgestellt wurde, und nicht die unterschiedliche Anzahl an transkriptionell aktiven Zellen untersucht wurde.Zusammenfassend bestätigen und erweitern die hier gezeigten Daten die grundliegenden Kenntnisse über die Prozesse vor und währen der MBT, liefern darüber hinaus aber auch Anzeichen für viele Prozesse vor und während der MBT, die nur wenig oder gar nicht verstanden sind. / The study of animal development is one of the oldest disciplines in the field of biology and the collected data from countless investigations on numerous species have formed a general understanding of the animal life-cycle. Almost one century ago, one consequence of these intense investigations was the discovery of specific morphological changes that occur during the cleavage phase, a period that follows fertilization and egg activation at the very beginning of animal embryogenesis. These observations resulted into the formulation of the concept of a midblastula transition (MBT). So far, the mechanism of the nucleo-cytoplasmic ratio model is the only one that explains MBT regulation in a satisfying way. It suggests that the MBT is controlled by several maternal repressive factors in the egg, which are titrated out by every cell division until they lose their repressing potential. Although this regulatory mechanism was proven for several species and in different approaches, it is still only a rudimentary model for MBT control and leaves numerous questions unanswered. On this conceptual background, this thesis has shown that embryos from the medaka fish (Oryzias latipes) lose their cell cycle synchrony already after the fourth or fifth round of cell divisions, and replace it by a metasynchronous divisions pattern, in which cell division occurs in clear waves beginning in the embryo's center. The reason for this change in division mode is still unknown, although several hypotheses were put forward, most notable a difference in yolk-access between cells. However, this theory was weakened by division waves that progressed from one embryonic pole to the opposing one, which were occasionally observed in deformed embryos, leaving the mechanism for this phenomenon furthermore unclear. Those deformed embryos were most likely the result of asymmetric cell divisions at very early stages, a phenomenon which occurred in a significant percentage of medaka embryos and which directly influenced the equal distribution of cytoplasmic material. It could not beuncovered what kind of effects this unequal distribution of cytoplasm exerted on the progression of embryonic development, but it can be argued that relevant differences in cell volumes could result in cell clusters that will enter MBT at different time points. Comparable observations were already made in other species and it was hypothesized that they were the direct results of early unequal cell cleavages. Finally, it was demonstrated that zygotic transcription in medaka embryos is activated prior to the hitherto assumed time of the first transcriptional initiation. Moreover, indications were found that strongly speak for a transcriptional activation that occurs in two steps; a first step at the 16-cell stage when first cells were identified positive for RNAPII phosphorylation, and a second step at the 64-cell stage, when the number of p-RNAPII positive cells significantly increased. A stepwise activation of zygotic transcription was already observed in other species, but only for the overall increasing amount of mRNAs and irrespective of the actual number of transcriptionally active cells within the embryos. .. Overall, these data confirm and expand the basic knowledge of pre-MBT embryos and about the MBT itself. Furthermore, they also suggest that many early processes in pre-MBT embryos are only rudimentarily understood or still totally unknown.

Haematopoietic development is a complex process that is strictly hierarchically organized. Here, the phagocyte lineages are a very heterogeneous cell compartment with specialized functions in innate immunity and induction of adaptive immune responses. Their generation from a common precursor must be tightly controlled. Interference within lineage formation programs for example by mutation or change in expression levels of transcription factors (TF) is causative to leukaemia. However, the molecular mechanisms driving specification into distinct phagocytes remain poorly understood. In the present study I identify the transcription factor Interferon Regulatory Factor 8 (IRF8) as the specification factor of dendritic cell (DC) commitment in early phagocyte precursors. Employing an IRF8 reporter mouse, I showed the distinct Irf8 expression in haematopoietic lineage diversification and isolated a novel bone marrow resident progenitor which selectively differentiates into CD8α+ conventional dendritic cells (cDCs) in vivo. This progenitor strictly depends on Irf8 expression to properly establish its transcriptional DC program while suppressing a lineage-inappropriate neutrophile program. Moreover, I demonstrated that Irf8 expression during this cDC commitment-step depends on a newly discovered myeloid-specific cis-enhancer which is controlled by the haematopoietic transcription factors PU.1 and RUNX1. Interference with their binding leads to abrogation of Irf8 expression, subsequently to disturbed cell fate decisions, demonstrating the importance of these factors for proper phagocyte cell development. Collectively, these data delineate a transcriptional program establishing cDC fate choice with IRF8 in its center. / Die Differenzierung von hämatopoietischen Zellen ist ein komplexer Prozess, der strikt hierarchisch organisiert ist. Dabei stellen die Phagozyten eine sehr heterogene Zellpopulation dar, mit hochspezialisierten Funktionen im angeborenen Immunsystem sowie während der Initialisierung der adaptiven Immunreaktion. Ihre Entwicklung, ausgehend von einer gemeinsamen Vorläuferzelle, unterliegt einer strikten Kontrolle. Die Beeinträchtigung dieser Linienentscheidungsprogramme, z.B. durch Mutationen oder Änderungen der Expressionslevel von Transkriptionsfaktoren kann Leukämie auslösen. Die molekularen Mechanismen, welche die linienspezifische Entwicklung steuern, sind allerdings noch nicht im Detail bekannt. In dieser Arbeit zeige ich den maßgeblichen Einfluss des Transkriptionsfaktors Interferon Regulierender Faktor 8 (IRF8) auf die Entwicklung von dendritischen Zellen (DC) innerhalb der Phagozyten. Mittels einer IRF8-Reporter Maus stellte ich die sehr differenziellen Expressionsmuster von Irf8 in der hämatopoietischen Entwicklung dar. Dabei konnte ich eine neue, im Knochenmark lokalisierte, Vorläuferpopulation isolieren, die in vivo spezifisch Differenzierung in CD8α+ konventionelle dendritische Zellen (cDC) steuert. Dieser Vorläufer ist dabei absolut von der Expression von Irf8 abhängig und etabliert auf transkriptioneller Ebene die dendritische Zellentwicklung, während gleichzeitig die Entwicklung neutrophiler Zellen unterdrückt wird. Darüber hinaus zeigte ich, dass Irf8 Expression während der cDC Entwicklung von einem neu charakterisierten cis-regulatorischen Enhancer abhängt, der spezifisch in myeloiden Zellen agiert. Ich konnte zeigen, dass die hämatopoietischen Transkriptionfaktoren PU.1 und RUNX1 mittels dieses Enhancers die Irf8 Expression steuern. Können diese beiden Faktoren nicht mit dem Enhancer interagieren, führt das zu stark verminderter Irf8 Expression, damit zu Veränderungen in den Differnzierungsprogrammen der Zellen, was die Bedeutung dieses regulatorischen Mechanismus unterstreicht. Zusammengefasst beschreiben diese Daten die Etablierung der frühen cDC Entwicklung, in der IRF8 die zentrale Rolle spielt.

A major challenge in life sciences is the understanding of mechanisms that regulate the expression of genes. An important step towards this goal is the ability to identify transcriptional regulatory elements like binding sites for transcription factors. In computational biology, a popular approach for this task is comparative sequence analysis using both distantly as well as closely related species. Although this method has successfully identified conserved regulatory regions, the majority of binding sites can change rapidly even between closely related species. This makes it difficult to detect them using DNA sequences alone. In this thesis, we introduce two new approaches for the detection and evolutionary analysis of transcriptional elements that consider the challenges of binding site turnover. In the first part, we develop a method for detecting homologous motifs in a given set of sequences in order to obtain evidence for evolutionary events and turnover. Based on a detailed theoretical scaffold, we develop a simple, but effective and efficient heuristic for assembling local pairwise sequence alignments into a local multiple sequence alignment. This kind of multiple alignment only contains conserved motifs represented in columns which satisfy the order implied by the underlying sequences. By favoring motifs that are contained in a great range of sequences, our method is additionally able to detect even small conserved motifs. Furthermore, the calculation of the initial local pairwise alignments is generic. This allows the use of fast heuristic methods in case of large data sets while exact alignment programs can be used for small data sets where detailed information is needed. Application to artificial as well as biological data sets demonstrate the capabilities of our algorithm. In the second part, we propose a conceptually simple, but mathematically non-trivial, phenomenological model for the binding site turnover at a genomic locus. The model is based on the assumption that binding sites have a constant rate of origination and a constant decay rate per binding site. The elementary derivation of the transient probability distribution is affirmed by simulations of sequence evolution as well as biological data. Based on the derived distribution, we develop a phenomenological model of binding site number dynamics in order to detect changes in selective constraints acting on transcription factor binding sites. Using a maximum likelihood implementation as well as exploratory data analysis, we show the functionality of the model by identifying functionally important changes in the evolutionary turnover rates on biological data. Each part of this thesis leads to the development of a new program. While Tracker allows the computation of conserved homologous motifs and their representation in a local multiple alignment, Creto determines the evolutionary turnover rates for arbitrary clades of a phylogenetic tree with given binding site numbers at the final taxa. Both software tools are freely available to the scientific community for further research in this important and exciting field.

Techn. Universiẗat, Diss., 2006--Darmstadt.

Regensburg, Univ., Diss., 2007

Hohenheim, Univ., Diss., 2006.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.