Zugl.: Hannover, Med. Hochsch., Diss., 2001

Univ., Diss.--Frankfurt (Main), 2003.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam.

Proefschr. Rijksuniversiteit Groningen. / Met bibliogr., lit.opg. - Met samenvatting in het Nederlands en Roemeens.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit.opg. en samenvatting in het Nederlands.

Erlangen-Nürnberg, Univ., Diss., 2010.

Die Integration der viralen DNA in die des Wirtsgenoms ist ein essentieller Schritt im Lebenszyklus der Retroviren. Das wissenschaftliche Interesse an der Analyse von retroviralen Integrationsmustern ist, vor allem in Hinblick auf die Anwendung von retroviral basierten Vektoren in der somatischen Gentherapie, neu angefacht worden. Entgegen der Annahme, dass die retrovirale Integration dem Zufallsprinzip folgend stattfindet, konnten in den letzten Jahren für verschiedene Genera der Retroviren virusspezifische Integrationsmuster enthüllt werden, die auf eine Bevorzugung von bestimmten chromosomalen Regionen hindeuten, deren Mechanismen noch nicht ausreichend geklärt sind. Für die Sicherheit von therapeutisch anwendbaren Vektoren ist die Analyse von retroviralen Intgerationsmuster daher unerlässlich geworden. Foamyvirus (FV)-basierte Vektoren besitzen ein großes Potential, in der somatischen Gentheraphie ihre Anwendung zu finden, so dass eine Analyse ihrer Integrationsmuster im humanen Genom erforderlich ist. Hierfür wurden humane 293-Zellen mit FV-basierten Vektoren transduziert und mittels inverser PCR 628 FV-Integrationsstellen kloniert, die zur Analyse von verschieden Aspekten des foamyviralen Integrationsmusters im humanen Genom lokalisiert wurden. Als Vergleich und als Kontrolle wurden 141 Murine Leukämie Virus-(MLV)- und 87 Humane Immundefiziens Virus-(HIV)-Integrationsstellen ebenfalls kloniert und analysiert. Im Vergleich zu HIV, welches die Integration in Gene bevorzugt, und MLV, welches eine starke Präferenz zur Integration in regulatorische Bereiche in der Nähe von Transkriptionsstartstellen (TSS) von Genen besitzt, konnten mit den hier ermittelten FV-Daten weder Präferenzen zur Integration in Gene, noch starke Präferenzen für regulatorische Bereiche beobachtet werden. Eine leichte Bevorzugung zur Integration in der Nähe der TSS war zu erkennen, die allerdings deutlich schwächer ausfiel als bei MLV. Weiterhin wurden bei der Betrachtung der Basenzusammensetzungen in der Umgebung der FV-Integrationsstellen statistisch signifikante Präferenzen für bestimmte Basen an bestimmten Positionen beobachtet, die ein schwaches Palindrom bildeten, dessen Symmetrieachse sich im Zentrum der nach der Integration duplizierten zellulären Sequenz sich befand. Eine aktive Teilnahme von mit der viralen Integrase (IN) interagierenden zellulären Proteinen an der retroviralen Integrationsreaktion in vivo und an der Wahl der retroviralen Integrationsstellen ist sehr wahrscheinlich. Solche mit der IN interagierende zelluläre Proteine sind für FV noch unbekannt, so dass hierfür ein experimentelles Testsystem etabliert wurde. Mit Hilfe von humanen Zellen, welche mittels retroviralem Gentransfer stabil C-terminal mit einem FLAG-Peptid fusionierte FV IN-Proteine expremierten, wurden in Pull-down-Experimenten und Maldi-Tof-Massenspektrometrie zwei zelluläre Proteine (NF90 und ADAR1) identifiziert, welche mit dem FV IN-Protein interagieren und aufgrund ihrer Spezifitäten potentzielle Kofaktoren der foamyviralen Integration darstellen könnten. Eine RNAi-basierte Runterregulierung der Expression beider Proteine konnte, aufgrund der essentiellen Rolle beider Proteine an der Regulation der Zellteilung, keine experimentellen Daten liefern, die eine Analyse über die Funktion beider Proteine an der Integrationsreaktion von FV zulassen. Die Funktion beider Proteine muss in biochemischen Versuchen noch evaluiert werden und könnte einen interessanten Einblick in die Wechselwirkungen von FV mit ihrem Wirt liefern. Neben der Identifikation der zwei mit der IN interagierenden zellulären Proteine zeigen die hier präsentierten Daten zusammenfassend, dass das Integrationsmuster der FV sich von MLV und HIV-1 unterscheidet und nahezu dem Zufallsprinzip folgt. Aufgrund der im Vergleich zu MLV deutlich schwächeren Präferenz zur Integration in der Nähe von regulatorischen Bereichen und der im Vergleich von HIV-1 überhaupt nicht vorhandene Bevorzugung zur Integration in Gene stellen FV-basierte Vektoren interessante alternative Vektorsysteme für die somatische Gentheraphie dar. / The Integration of the viral DNA into the host genome is an essential step in the lifecycle of retroviruses. With respect to the application of retroviral based vectors for somatic gene theraphy the analysis of retroviral integration patterns has gained scientific interest. Contrary to the assumption that the retroviral integration into the host genome occurs by chance virus specific integration patterns have been uncovered in the last few years virus, which suggest that certain chromosomal regions are preferred sites of integration. In regard to the safety assessment of potentially applicable retroviral vectors the analysis of integration patterns has become indispensable. Foamy virus-(FV)-based vectors have evolved to promising alternative vector systems, which have a good capability to be used in clinical gene therapy trials, thus the evaluation of their integration pattern in the human genome is required. To accomplish this, 293 cells were transduced with FV vectors and the integration sites into the cellular genome were determined by a high-throughput method based on inverse PCR. For comparison, a limited number of murine leukemia virus (MLV) and human immunodeficiency virus (HIV) integration sites were analysed in parallel. Altogether, 628 FV, 87 HIV and 141 MLV distinct integration sites were mapped to the human genome. Compared with the integration-site preferences of HIV, which strongly favours active genes, and MLV, which favours integration near transcription-start sites (TSS), our results indicate that FV integration has neither of these preferences. However, once integration has occurred into a transcribed region of the genome, FVs tend to target promoter-close regions, albeit with less preference than MLV. Furthermore, by analysing the base composition surrounding the FV integration sites our study revealed statistical significant preferences for certain bases at certain positions resulting in a palindromic consensus sequence, which was centred on the virus-specific, four-base-duplicated target site. The mechanism which regulate the virus specific integration site selection are up to now not well understood, however cellular Proteins, which interact with the viral integrase (IN) protein, are most likely mediators. Such proteins have so far not been identified and analyzed for FV, thus an experimental test system for the identification of cellular proteins interacting with the FV IN was established. For this purpose human cells stably expressing the FV IN, which was C-terminally fused to the FLAG-peptide where generated via retroviral transduction and used in pull-down-assays. Two cellular proteins where identified (NF90 and ADAR1) which showed interaction with FV IN in pull-down-assays and which because of their specificties constitute potential cofactors of the FV integration in vivo. Using the RNAi approach the down regulation of NF90 and ADAR1 could not provide any experimental data towards their function on FV integration, because both Proteins appeared to have an essential role in the regulation of the cell cycle and a dramatic decrease in cell division was observed after down regulation of both Proteins. The Function of both Proteins needs to be determined by biochemical assays and can potentially reveal interesting insights in the interplay of FV with cellular proteins. In summary, apart from the identification of two cellular proteins, which interact with the FV IN-protein, it is shown that the integration pattern of FVs appears to be unique compared with those of other retroviral genera. On the basis of the weak preferences for FV to integrate near to TSS and the absent preferences for genes, FV-based vectors comprise interesting alternative vector systems.

Düsseldorf, Universität, Habilitation, 2000.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Zugl.: Münster (Westfalen), Univ., Diss., 2001