A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2017-06-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Investing in the development of new preventive therapies against the progression of chronic diseases is essential, since these diseases share common aetiologies such as inflammation and oxidative stress. Flavonoids such as naringenin have been the subject of several studies in the prevention, control and treatment of chronic diseases. The objective of this work was to synthesize a new chemical entity and, from this, to explore its chemical and physicochemical characteristics and its biological activities. ACD41 was synthesized from the condensation reaction between naringenin and aminoguanidine. Its chemical structure was elucidated using ESI-MS, MS-MS, NMR and FTIR techniques, and physicochemical aspects studied using TG, DSC, DTA and XRD. The biological activities explored included the trials related to oxidative stress, glycation and inflammation. ACD41 was presented as a crystalline solid, with 81% yield, 328.33 g / mol molecular mass, retention time of 12.1 minutes in HPLC analysis and with lower thermal resistance compared to naringenin. ACD41 showed low cytotoxicity with IC50 greater than 1000 μg / mL in human macrophages (THP-1) and 767.4 ± 18.71 μg / mL in human fibroblasts (MRC-5). It presented sequestering activity against the radicals ABTS+ • (IC 50 = 5.26 ± 0.10 μg / mL) and DPPH• (IC 50 = 8.33 ± 0.49 μg / mL). It reversed ROS levels and preserved mitochondrial membrane integrity in THP1. In the in vitro glycation assays, ACD41 inhibited the formation of AGEs by oxidative (IC 50 = 2.58 ± 1.67 μg / mL) and non-oxidative (IC 50 = 72.23 ± 2.28 μg / mL). In LPS-activated macrophages, it inhibited the production of TNF-α at concentrations of 5 and 10 μg / mL. ACD41 inhibited the production of hydroperoxide by 87.95% by LOX and in the in silico studies it interacted with the COX-2 enzyme, presenting a binding energy equal to -10.3 kcal / mol. The present study describes for the first time the molecule (2E) -2- [5,7-dihydroxy-2- (4-hydroxyphenyl) -2,3-dihydro-4H-chromen-4-ylidene] hydrazine carboxymidinedide And demonstrates the antioxidant, anti-inflammatory and anti-inflammatory potential of this new chemical entity, which may be promising in the development of new therapies for chronic diseases. / Investir no desenvolvimento de novas terapias preventivas contra a progressão de doenças crônicas é essencial, visto que essas enfermidades compartilham etiologias comuns como a inflamação e estresse oxidativo. Flavonoides como a naringenina tem sido objeto de vários estudos na prevenção, controle e tratamento de doenças crônicas. O objetivo deste trabalho foi sintetizar uma nova entidade química e, a partir desta, explorar suas características químicas e físico-químicas e suas atividades biológicas. A ACD41 foi sintetizada a partir da reação de condensação entre a naringenina e aminoguanidina. Sua estrutura química foi elucidada por meio das técnicas de ESI-MS, MS-MS, RMN e FTIR e aspectos físico-químicos estudados utilizando TG, DSC, DTA e DRX. As atividades biológicas exploradas contemplaram os ensaios relacionados ao estresse oxidativo, glicação e inflamação. A ACD41 apresentou-se como um sólido cristalino, com rendimento de 81%, massa molecular de 328,33 g/mol, tempo de retenção de 12,1 minutos na analise por CLAE e com menor resistência térmica comparada à naringenina. A ACD41 apresentou baixa citotoxicidade com CI50 superior a 1000 μg/mL em macrófagos humanos (THP-1) e 767,4 ± 18,71 μg/mL em fibroblastos humanos (MRC-5). Apresentou atividade sequestrante contra os radicais ABTS+ (CI50 = 5,26 ± 0,10 μg/mL) e DPPH (CI50 = 8,33 ± 0,49 μg/mL). Reverteu os níveis de ROS e preservou a integridade da membrana mitocondrial em THP-1. Nos ensaios de glicação in vitro, a ACD41 inibiu a formação de AGEs pelas vias oxidativa (CI50 = 2,58 ± 1,67 μg/mL) e não oxidativa (CI50 = 72,23 ± 2,28 μg/mL). Em macrófagos ativados por LPS, inibiu a produção de TNF-α nas concentrações de 5 e 10 μg/mL. A ACD41 inibiu em 87,95% a produção de hidroperóxido pela LOX e nos estudos in silico interagiu com a enzima COX-2, apresentando uma energia de ligação igual a -10.3 kcal/mol. O presente estudo, pela primeira vez, descreve a molécula (2E)-2-[5,7-diidroxi-2-(4-hidroxifenil)-2,3-dihidro-4H-cromen-4-ilideno]hidrazina carboximi- damida e demonstra o potencial antioxidante, antiglicante e anti-inflamatório desta nova entidade química, a qual pode ser promissora no desenvolvimento de novas terapias para doenças crônicas.

O diabetes mellitus (DM) em longo prazo pode levar a diversos problemas entre eles a insuficiência renal, cegueira, alterações vasculares e neurológicas. Entre as teorias que explicam como a hiperglicemia crônica conduz aos danos celulares e teciduais responsáveis pelas complicações observadas no DM, a formação dos produtos finais de glicação avançada (AGEs) é considerada uma das mais importantes. Sabe-se também que nas doenças cardiovasculares, uma das principais complicações do diabetes, ocorre um aumento das quinureninas, produtos de oxidação do triptofano, numa reação catalisada pela enzima Indolamina 2,3 dioxigenase (IDO). Neste trabalho avaliamos a influência dos AGEs sobre a modulação da enzima IDO no estado diabético e seu impacto nos principais marcadores de risco cardíaco. Foi utilizado um modelo experimental de diabates induzido pela injeção i.p. de aloxano em ratos Wistar que foram divididos em 6 grupos (n=8 por grupo): Diabético Ativado (DA), Diabético Não Ativado (DNA), Diabético Ativado tratado com aminoguanidina (DAAG), Diabético Não Ativado tratado com AG (DNAAG), Controle Ativado (CA) e Controle Não Ativado (CNA). A aminoguanidina (AG) é um conhecido inibidor da formação de AGEs e foi administrada por gavagem por 50 dias após a instalação do DM. A formação de quinureninas reflete a atividade de IDO e foi medida em macrófagos peritoneais e homogenato de cérebro, por HPLC. A expressão de IDO foi avaliada por Dot blot, imunofluorescência e imunocitoquímica. Os principais marcadores de risco cardíaco (colesterol total e suas frações e PCR-US) foram determinados através de kits comerciais. Além disso, foi avaliado também o perfil glicêmico e renal destes animais, uma vez que os AGEs são nefrotóxicos. Como esperado, no estado diabético houve um aumento de 2,9 vezes na formação dos AGEs, em relação aos animais controle e a aminoguanidina inibiu cerca de 35% da formação destes produtos. Observamos um aumento na atividade e expressão de IDO em macrófagos e homogenato de cérebro de ratos diabéticos em relação ao controle. O aumento visto em macrófagos foi mais evidente quando estas células foram ativadas pelo LPS, mimetizando uma situação de infecção. Este aumento ocorreu de forma independente da concentração dos AGEs, uma vez que não houve diferença entre os grupos tratatos e não tratados pela AG. Da mesma forma observada para a modulação da IDO, o tratamento com a AG não alterou os perfis glicêmico, lipídico e renal no nosso modelo experimental. Nossos resultados demonstram que o estado hiperglicêmico eleva os níveis de IDO. Estes achados sugerem que IDO pode vir a se tornar um marcador da morbidade do diabetes e potencial alvo em novas estratégias terapêuticas para o DM. / The diabetes mellitus (DM) is a chronic disease that is known to cause several longterm complications such as renal insufficiency, blindness, vascular and neurological changes. There are some theories trying to explain how chronic hyperglycemia may lead to cellular and tissue impairments and the Advanced Glycation End-Products (AGE) theory is one of the most important. Cardiovascular disease is one of the diabetes mellitus long-term complications and in this case it was observed an increased serum concentration of kynurenine, an indoleamine 2, 3 dioxygenase (IDO) catalyzed tryptophan oxidation product. In this study we evaluated the IDO modulation by AGEs in diabetic rats and the impact of this modulation in cardiac risk markers. For diabetes model, Wistar rats were treated with intraperinoeal (i.p.) injection of aloxane. It was evaluated 6 different groups (n=8): Activated diabetic (DA), Non Activated diabetic (DNA), Activated diabetic treated with aminoguanidine (DAAG), Non activated diabetic treated with aminoguanidine (DNAAG), Activated control (CA) and Non activated control (CAN). Aminoguanidine (AG) is a known AGEs formation inhibitor and it was administrated by gavage during 50 days after the DM was installed. Kynurenine formation is a measure of IDO acitivity and it was evaluated, by HPLC, in peritoneal macrophages and brain homogenates. The IDO protein expression was analyzed by Dot Blot, Immunofluorescence and immunocytochemistry. The main cardiac risk markers (total cholesterol and fractions and PCR-US) were determined by commercial kits. The glycemic and renal profile were also evaluated since AGEs are known to be nephrotoxic. As expected, we observed an increase in AGEs by 2,9 times when compared with the control and the aminoguanidine compound inhibited 35% of tthese products. There was an increase in the IDO expression and activity in macrophages and brain homogenates in diabetic rats when compared with control. This rise was more evident when the animals were treated with LPS, mimicking an infection. The difference of IDO activity and expression was not due to the AGEs concentration since we did not observe difference between the AG treated and non-treated groups. The same way observed by IDO modulation, the AG treatment did not alter the glycemic, lipidic and renal profiles in this experimental model. These results showed that the hyperglycemic state increase IDO levels. These findings suggest that IDO might be a morbid diabetes marker and a potential target of new therapeutic strategies of DM. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Durante algumas das reações que levam à formação de AGEs, espécies reativas de oxigênio são geradas e concorrem paralelamente com o estresse oxidativo e com os danos estruturais e funcionais às macromoléculas. A formação de AGEs in vivo pode envolver os neutrófilos, que após estímulo inflamatório, induzem importantes enzimas geradoras de ERO, como o sistema NADPH oxidase. Entretanto ainda permanecem questionamentos sobre a relação entre o Sistema NADPH oxidase de neutrófilos e os AGEs. O presente trabalho visa contribuir para o entendimento do papel do sistema NADPH oxidase e da geração de ERO na formação de AGEs e o impacto da formação destes produtos na função renal destes animais. Foi utilizado um modelo experimental de diabetes induzido pela injeção i.p. de aloxano em ratos Wistar que foram divididos em 5 grupos: controle, diabético, diabético tratado com aminoguanidina (AG), diabético tratado com apocinina (AP) e diabético tratado com apocinina e aminoguanidina (AP+AG). A AG é um conhecido inibidor da formação de AGEs, e a AP é inibidor do sistema NADPH oxidase. Os inibidores, ou água foram administrados aos animais por gavagem por 50 dias após a instalação do DM. A formação de ERO reflete a atividade de NADPH oxidase e foi mensurada em neutrófilos peritoneais por quimiluminescência e pelo ensaio de redução do citocromo C. A expressão das subunidades p47phox e a p67phox do sistema NADPH oxidase foi avaliada por imunofluorescência. Os AGEs circulantes foram avaliados por fluorescência e a função renal foi avaliada pela dosagem da uréia e creatinina séricas e análises histológica dos rins. Pelos parâmetros avaliados neste estudo, verificamos que o tratamento com AP, diminuiu a geração de ERO tanto no grupo controle, quanto diabético, mas não afetou a via de formação de AGEs. O que indica que, provavelmente, não há interrelação entre as vias do sistema da NADPH oxidase de neutrófilos e a formação de AGEs, no nosso modelo experimental. O tratamento com a AP atenuou a glomerulonefrite do grupo diabético. A AG, na dose e no tempo administrado, 100mg/Kg por 50 dias, melhorou o perfil glicêmico dos animais diabéticos, preveniu a formação de AGEs e o dano glomerular. Além disso, o tratamento com a AG aumentou a atividade do sistema NADPH oxidase e a expressão das subunidades citosólicas p47phox e a p67phox do sistema. Não podemos afirmar que o aumento da atividade e expressão do sistema NADPH oxidase seja devido à diminuição dos AGEs no nosso sistema ou um efeito isolado da aminoguanidina, ainda não descrito na literatura. A compreensão do papel desta enzima em modelo experimental de diabetes pode ajudar na compreensão do processo inflamatório persistente que ocorre devido ao acúmulo desses produtos nas complicações da doença, permitindo uma melhor adequação da abordagem clínica e tratamento desses pacientes. / Chronic hyperglycemia observed in diabetes disease leads to the advanced glycation end products (AGEs) formation, which are able to damage the patient organs, especially the kidney. Some AGEs formation reactions may also generate reactive oxygen species (ROS) and they are able to compete with oxidative stress and structural and functional macromolecules damages. Neutrophils are immune cells capable of expressing great amount of important ROS generator enzymes such as NADPH oxidase just after inflammatory stimuli. There are still questions about the relationship between the neutrophil NADPH oxidase system and AGEs despite the information that in vivo AGEs formation may involve neutrophils. The present study aims to contribute to the understanding of NADPH oxidase role and its ROS generation in AGEs formation and what is the impact of these products formation in renal function of rat model. Our experimental diabetes model was reached by alloxan i.p. injection in rats. These animals were divided in five groups: control, diabetic, diabetic treated with aminoguanidine (AG), diabetic treated with apocynin (AP) and diabetic treated with apocynin and aminoguanidine (AG + AP). AG is an AGEs formation inhibitor, and AP is a NADPH oxidase inhibitor. The inhibitors compounds or the vehicle (water) were administered by gavage for 50 days after DM confirmation. ROS formation reflects the NADPH oxidase activity and it was measured by chemiluminescence assay and by cytochrome C reduction in peritoneal neutrophils. The expression of NADPH oxidase p47phox and p67phox subunits was assessed by immunofluorescence. Circulating AGEs were analyzed by fluorescence and the renal function was evaluated by serum urea and creatinin concentration and by kidney histological sections. Our results showed that AP treatment decreased ROS generation in both control and diabetic groups, but did not affect the process of AGEs formation. This may indicate that in our experimental model there is no interrelation between the neutrophil NADPH oxidase system and the AGEs formation. It was also observed that the AP attenuated glomerulonephritis in diabetic mice. AG, at the administered dose and time, 100mg/Kg for 50 dias, improved glycemic control, prevented the AGEs formation and prevented glomerular damage. Furthermore, AG treatment increased the NADPH oxidase activity and its p47phox and p67phox cytosolic subunits expression. We are not able to confirm if the increased activity and expression of NADPH oxidase were caused by the AGEs decrease in our system or by an isolated effect of aminoguanidine not yet described. Understanding the NADPH oxidase role in experimental diabetes could improve the knowledge about the persistent inflammatory process that occurs due to these products accumulation during the disease complication, allowing a better clinical approach and treatment of these patients. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A participação dos produtos de glicação avançada (AGEs) nas complicações crônicas relacionadas ao diabetes, têm sido muito investigadas. Entretanto, pouco se sabe sobre a participação direta dos AGEs em relação a homeostase glicêmica, na qual o transportador de glicose GLUT4 (proteína codificada pelo gene SLC2A4 ) desempenha um papel essencial. Portanto o objetivo do presente estudo é investigar o papel dos AGEs tanto in vivo quanto in vitro sobre a expressão do Slc2a4/GLUT4. Nos modelos in vivo e in vitro, os AGEs reduziram a expressão gênica/proteica do Slc2a4/GLUT4 e reduziram a sensibilidade insulínica no modelo in vivo, como também exarcebaram tanto a via inflamatória pelo NFKB quanto a via do estresse de retículo endoplasmático pelas chaperonas. Por fim, estes resultados sugerem os AGEs como um mecanismo repressor da expressão do Slc2a4/GLUT4 no músculo esquelético pelas vias de estresse de retículo e inflamatória. / The participation of advanced glycation end products (AGEs) in the diabetes-related chronic complications has been extensively investigated. However, little is known about AGEs participation in glycemic homeostasis, for which the glucose transporter GLUT4 (Slc2a4 gene) plays a key role. The aim of this study was indentify the effect of AGEs in an in vivo and in vitro models in Slc2a4/GLUT4 expression. In vivo and in vitro models showed decrease of Slc2a4/GLUT4 expression and insulin sensitivity (only on in vivo model). AGEs increase inflammatory and endoplasmic reticulum stress ways by NFKB and chaperones respectively. In sume, The results reveal that AGEs repress Slc2a4/GLUT4 expression in muscle, in a reticulum endoplasmic stress- and inflammatory-mediated way. This effect contributes to impair plasma glucose clearance, highlighting AGEs reduction/inhibition as a target to improve glycemic control in diabetes.

O RAGE é um receptor transmembrana, imunoglobulina-like que existe em múltiplas isoformas e interage com um amplo repertório de ligantes extracelulares. O RAGE é expresso em níveis baixos na maioria das células, porém o aumento da presença de seus ligantes no domínio extracelular faz com que o RAGE inicie uma cascata de sinalização intracelular complexa, resultando em estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição NF-B, aumento da expressão de citocinas, além da indução de sua própria expressão. O envolvimento do RAGE neste amplo espectro de sinalização vincula este receptor a diversas condições patológicas. Nesta tese utilizamos 3 modelos experimentais que induzem inflamação sistêmica (Leishmania amazonensis, Lipopolissacarídeo e sepse) e 1 modelo experimental que mimetiza a denervação neuronal (modelos experimentais in vivo). Além disso utilizamos diferentes abordagens de bloqueio do RAGE a fim de elucidar a função deste receptor. Com base em nossos resultados os modelos experimentais foram eficientes em induzir o aumento do RAGE e sua sinalização no sistema nervoso central, desencadeando a síntese e liberação de moléculas pró-inflamatórias e o aumento do estresse oxidativo, culminando em neuroinflamação e neurodegeneração. As intervenções de bloqueio do RAGE foram eficientes em inibir as vias de sinalização intracelular mediadas pelo receptor, comprovando a via de ação. Levando em conta nossos principais resultados concluímos que: a) RAGE atua como mediador da perda neuronal em resposta ao insulto inflamatório em diversas estruturas do SNC, b) está presente no corpo dos neurônios dopaminérgicos e envolvido na morte destes neurônios; c) o aumento do RAGE é tempo-dependente e a morte dos neurônios está vinculada a ação deste receptor. / RAGE is a transmembrane, immunoglobulin-like receptor that exists in multiple isoforms and interacts with a broad repertoire of extracellular ligands. RAGE is expressed at low levels in most cells, but the increased presence of its ligands initiates a complex intracellular signaling cascade resulting in oxidative stress, activation of transcription factor NF-B, increased expression of cytokines in addition to concomitant upregulation of RAGE itself. In this thesis we used 3 experimental models which induce systemic inflammation (Leishmania amazonensis, Lipopolysaccharide and sepsis) and 1 experimental model that mimics neuronal denervation (experimental models in vivo). In addition, different approaches to block RAGE were used to elucidate the function of this receptor. Based on our results the experimental models were efficient in inducing the increase of RAGE and its signaling in the central nervous system, triggering the synthesis and release of proinflammatory molecules and the increase of oxidative stress, culminating in neuroinflammation and neurodegeneration. The RAGE blocking interventions were effective in inhibiting receptor-mediated signaling, proving the signaling pathway. Considering our main results, we conclude that: a) RAGE acts as a mediator of neuronal loss triggered by inflammatory insults in various CNS structures; b) RAGE is present in the body of dopaminergic neurons and is involved in the death of these neurons; c) the increase of RAGE is time-dependent, and the neuronal death is dependent on the action of this receptor.

INTRODUÇÃO Produtos intermediários da reação de Maillard e da peroxidação, como os compostos dicarbonílicos, reagem facilmente com grupamentos aminas de proteínas e ácidos nucléicos levando a modificações biológicas que podem resultar em patologias observadas no diabetes, aterosclerose e doenças neurodegenerativas. O consumo de Produtos da Reação de Maillard (PRM) aumentou nas últimas décadas e há evidências de que estas substâncias são absorvidas e podem tomar parte em processos patológicos, embora ainda não haja consenso sobre os possíveis efeitos deletério à saúde a partir do aumento de sua ingestão. Ressalta-se a necessidade de estimar o consumo destes PRMs a partir de dados sobre os conteúdos e a ingestão habitual do alimento em questão como cereais matinais e café. Objetivos: a) validar metodologia para quantificar indicadores da reação de Maillard: hidroximetilfurfural (HMF), furosina (FUR), carboximetilisina (CML) e Compostos Intermediários Fluorescentes (CIF) em cereais matinais (flocos e granola) e café; b) avaliar se há diferenças nos teores desses compostos nas diferentes marcas destes produtos comercializados em São Paulo; METODOLOGIA: Foram analisados dois lotes de três marcas de cereais do tipo flocos, três marcas de cereais do tipo granola e cinco marcas de café presentes em 100 por cento dos hipermercados visitados no município de São Paulo. A validação da metodologia para quantificação, empregando HPLC, consistiu no cálculo da exatidão (recuperação), repetibilidade e sensibilidade para os compostos: HMF e FUR. Foram determinados os teores de CIF por espectrofotometria de fluorescência e os teores de CML por teste imunoenzimático. RESULTADOS: Os métodos de determinação de FUR e HMF foram validados conforme o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e 9 Qualidade Industrial (INMETRO). O teor médio de CIF livre e total foram maiores para as amostras de café, com média de 232CIF/mg e 765CIF/mg respectivamente. Não houve diferença (p>0,05) no teor de CIF livre e total entre os flocos F1 e F2. O mesmo foi observado para a granola marcas. G1, G2 e G3 A granola foi o produto com maior teor médio de HMF (67,5mg/Kg) e furosina (301mg/100g de proteína). A FUR não foi detectado nas amostras de café. Todas as marcas dos alimentos estudados para os indicadores HMF e FUR apresentaram diferença estatisticamente significativa (p<0,05). O café apresentou maior teor médio de CML (1823,5ng/mg de proteína), sem diferença entre as marcas (p>0,05) CONCLUSÕES: Os cereais do tipo flocos contribuem para maior ingestão de PRMs da fase inicial da reação de Maillard (RM), a granola contribui para maior ingestão de PRMs da fase intermediária da RM e o café contribui de forma significativa para maior ingestão de PRMs da fase avançada da RM. O café, por ser submetido a tratamento térmico mais severo apresenta maior concentração de PRMs da fase avançada da reação / INTRODUCTION Maillard reaction products and lipid peroxidation, such as dicarbonyl compounds easily react with amino groups of proteins and nucleic acids leading to biological changes that can result in complications in diseases such as diabetes, atherosclerosis and neurodegenerative. The consumption of Maillard Reaction Products (MRP) has increased in recent decades and there is evidence that these substances are absorbed and can participate in pathological processes, although there is no consensus about the possible harmful health effects from their intake. We highlight the need to identify the consumption of MRP, mainly in vulnerable populations like children and diabetics, in order to establish acceptable daily intakes and guidelines for the food industry. OBJECTIVES: a) validate the methodology to measure indicators of the Maillard reaction: hydroxymethylfurfural (HMF), Furosine (RUF) carboxymethylysine (CML) and fluorescent intermediate compounds (FIC) in breakfast cereals (corn flakes and granola) and coffee, b) to evaluate if there are differences in the levels of these compounds contents among brands commercialized in São Paulo METHODS: two lots of 3 brands of flakes cereal, 3 brands of granola and 5 coffee brands present in 100 per cent of supermarkets visited in the city Sao Paulo were analyzed. HPLC methodology validation was assessed by determining accuracy (recovery), repeatability, and sensibility (linearity, limits of detection and quantitation) for the compounds: HMF and FUR. The contents of the Fluorescent Intermediary compounds (FIC) was measured by spectrophotometric method and the levels of CML by ELISA. RESULTS: Calibration curves determination coefficient (r 2) were higher than 0,99 for all compounds. Recovery ranged from 84 to 110 per cent and repeatability average was 3,5 per cent. The average content of free and total FIC was higher for coffee 232CIF/mg and 765CIF/mg respectively. The brands of granola and flakes was similar but just brands F1 and F2 was similar between brands (p<0,05). For HMF the higher values were for granola 67,5mg/kg. The presence of dried fruit in these grains may 11 have contributed significantly to the higher rate of this indicator. For indicator FUR average was higher in granola samples (301mg/100g of protein) and it was not possible to quantify the levels of FUR for coffee. All brands analyzed for HMF and FUR was similar (p<0,05). CML average was higher for coffee (1823,5ng/mg of protein). The brands analyzed was similar for all samples (p <0.05). CONCLUSIONS: Flakes contribute to higher intake of MRPs from early stage of the Maillard reaction (MR), the granola contributes to higher intake of MRPs from intermediate phase of MR and coffee contributes significantly to higher intake of final MRPs. Data suggest that coffee has more severe thermal treatment causing a higher concentration of MRPs from the final phase of the MR

AGEs (advanced glycation end products) are end products of aminocarbonilics interactions exogenous sources whose main foods are subjected to high temperatures and dry heat. Have antigenic properties, pro-oxidant, proinflammatory, pro-fibrotic, pro-coagulants and nephrotoxic. The kidney tissue becomes a particular target for their role in the clearance of these substances, and preventing the accumulation preventing sustained increase in its serum levels, which is influenced by the aging due to the decreased renal clearance naturally present in the process physiological. The renal accumulation of AGEs may result from his imprisonment by the quantitative movement, local generation of these substances, proteins involving pre-existing pathological or decrease its clearance. The presence of AGEs in normal kidneys has been associated with the appearance of histological features similar to diabetic glomerulosclerosis, with enlargement of the basement membrane, increased glomerular volume, mensangial extracellular matrix expansion, focal glomerulosclerosis and albuminuria, and stimulate inflammation, fibrosis and hypertrophy. Kidney structures susceptible to the accumulation of AGEs include basement membrane, mesangial and endothelial cells, podocytes and tubules. Antioxidant and anti-glycantion agents as vitamin thiamine may prevent exacerbated the effects of endogenous formation and accumulation of AGEs. In this assay, we investigated the effect of chronic ingestion of diet subjected to heat treatment (autoclaving at 121.5°C for 30 min) with different levels of thiamine on renal physiology in healthy adult Wistar rats. The results indicate that after six months of treatment, there were no histological changes of renal tissue or serum biochemistry between the groups. The chronic consumption of diet termolized not promote the appearance of morphological and functional changes in kidney tissue of adult rats. It is considered that the diet composition administered may have contributed to the observed result. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / AGEs (do inglês advanced glycation end products) são produtos finais de interações aminocarbonílicas cujas principais fontes exógenas são alimentos submetidos a altas temperaturas e calor seco. Apresentam propriedades antigênicas, pró-oxidantes, pró-inflamatórias, pró-fibróticas, pró-coagulantes e nefrotóxicas. O tecido renal torna-se um alvo particular por seu papel na depuração dessas substâncias, impedindo que se acumulem e evitando o aumento sustentado de seus níveis séricos, o que sofre a influência do envelhecimento, devido a diminuição da depuração renal naturalmente presente durante esse processo fisiológico. O acúmulo renal de AGEs pode resultar de seu aprisionamento quantitativo pela circulação, da geração local dessas substâncias, envolvendo proteínas pré-existentes, ou da diminuição patológica de sua depuração. A presença de AGEs em rins normais tem sido associada ao aparecimento de características histológicas semelhantes à glomerulosclerose diabética, com alargamento da membrana basal, aumento do volume glomerular, expansão da matriz mensangial extracelular, glomerulosclerose focal e albuminúria, além de estimular inflamação, fibrose e hipertrofia. As estruturas renais suscetíveis ao acúmulo de AGEs incluem membrana basal, células mesangiais e endoteliais, podócitos, e túbulos. Agentes antioxidantes e anti-glicantes como a vitamina tiamina podem prevenir os efeitos da exacerbada formação e acúmulo endógeno de AGEs. No presente protocolo experimental foi investigada a repercussão da ingestão crônica de dieta submetida a tratamento térmico (autoclavagem a 121,5°C, por 30 min) e diferentes níveis de tiamina sobre a fisiologia renal em ratos Wistar adultos saudáveis. Os resultados indicam que, após seis meses de tratamento, não foram encontradas alterações histológicas do tecido renal nem bioquímicas séricas entre os grupos estudados. O consumo crônico de dieta termolizada não promoveu o aparecimento de alterações morfo-funcionais no tecido renal de ratos adultos. Considera-se que a composição da dieta administrada tenha contribuído para o resultado observado.