Le but de cette étude exploratrice est d'investiguer le rôle potentiellement paradoxal de la radiothérapie sur le caractère invasif des glioblastomes multiformes (GBM). Utilisant le modèle murin de tumeur astrocytaire F98/Fisher, nous avons dans un premier temps irradié soit le cerveau (BrainlR) de l'animal, les cellules cancéreuses implantées (F98IR), ou ces deux composantes (Brain+F98IR), afin d'étudier l'effet des radiations sur le développement tumoral. De plus, un regard particulier a été porté sur la cinétique de moléculaires inflammatoire et pro-migratoires induite par les radiations. Finalement, une approche pharmacologique a été utilisée dans le but de contrôler la réaction inflammatoire radio-induite pour diminuer les effets potentiellement néfastes des radiations sur l'augmentation de la migration des cellules F98 dans le cerveau de rat. Les analyses histologiques des cerveaux portant une tumeur F98 ont démontré une augmentation de l'infiltration pour les rats ayant été irradiés avant l'implantation. Ce même groupe a démontré une augmentation de létalité et une immunoréactivité accrue pour la nestine, illustrant une différence phénotypique. De façon opposée, le groupe où les cellules F98 sont irradiées avant l'implantation n'a démontré aucune différence flagrante dans leur profil de migration comparativement au groupe contrôle. Les analyses moléculaires ont illustré la présence d'une réaction inflammatoire suite à une exposition du cerveau aux radiations. Une stimulation de la production d'IL-1[beta] et de TGF-[beta] aptes l'exposition, supporte cette observation. De plus, une augmentation des niveaux de collagénase (MMP-2), permettant l'infiltration cellulaire, a été démontrée pour une période allant jusqu'à 20 jours post-irradiation. L'analyse de prostanoïdes pro-inflammatoires a révélé des niveaux augmentés des prostaglandines (PGE [indice inférieur 2] /PGD [indice inférieur 2] ) jusqu'à une période de 20 jours également. A la suite de ces résultats d'analyse moléculaire, nous avons choisi d'utiliser un anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) pour diminuer cette réaction due aux radiations pour ainsi réprimer la formation de molécules potentiellement néfastes. Le traitement au Meloxicam des rats avec des doses de 1 mg/kg quotidiennement, s'est traduit par une diminution du caractère invasif des tumeurs implantées dans un cerveau irradié. Ces données sur l'utilisation du Meloxicam comme approche pharmacologique sont encourageantes dans l'optique de diminuer l'invasion radio-induite. Notre étude illustre donc l'importance de se soucier de l'irradiation des tissus sains lors des traitements de radiothérapie pouvant jouer un rôle lors de la récurrence rapide observée en clinque chez les patients atteint de GBM. De plus, l'utilisation d'AINS pourrait s'avérer un outil efficace pour augmenter l'espérance de vie des patients atteints de glioblastomes.

Les glioblastomes sont des tumeurs fatales du fait de leur agressivité et du manque de traitements efficaces. La prolifération accrue, le caractère invasif et la résistance à la mort cellulaire du compartiment tumoral des glioblastomes leur confèrent une croissance rapide et une invasion du parenchyme cérébral environnant, à l’origine de leur systématique récidive. De plus, le processus d’angiogenèse au sein de ces tumeurs participe activement au mauvais pronostic en développant une forte vascularisation qui favorise leur croissance.Un peptide vasoactif l’Adrénomédulline (AM), est exprimé de façon ubiquitaire chez l’homme et a de ce fait un large champ d’action à travers l’organisme dont la progression tumorale en agissant de façon autocrine et paracrine via ses récepteurs CLR/RAMP2 et CLR/RAMP3 (« AMR »). Or l’expression de l’AM est corrélée avec le grade des gliomes. De plus, il a été démontré au sein de notre équipe que des anticorps polyclonaux anti-AM développés au laboratoire inhibent la prolifération des cellules gliales tumorales de glioblastomes in vitro ainsi que la croissance tumorale in vivo. Il a également été montré que des anticorps polyclonaux (anti-AMR) dirigés contre les récepteurs de l’AM (CLR, RAMP2 et RAMP3) inhibent in vitro la croissance, la migration et la formation en pseudo-capillaires des cellules endothéliales (HUVECs), suggérant une neutralisation par ces anticorps, de certaines étapes de l’angiogenèse. De même, il a été démontré dans des modèles in vivo que les anticorps anti-AMR inhibent la croissance tumorale en supprimant l’angiogenèse et la croissance des cellules tumorales, suggérant ainsi que les récepteurs de l’AM constitueraient une bonne cible thérapeutique. Ces études ayant été effectuées à partir de lignées cellulaires, nous avons caractérisé le système AM/AMR au sein des composantes gliales et microvasculaires provenant des cultures primaires de glioblastomes de patients puis nous avons testé l’effet de l’AM dans certains phénomènes caractéristiques des glioblastomes comme l’invasion et certaines étapes de l’angiogenèse tumorale. Il résulte de cette étude que l’AM est trois fois plus secrétée par la composante microvasculaire tumorale au sein de laquelle l’AM favorise la migration, l’invasion et l’organisation en pseudo-capillaires. De plus, l’AM favorise l’invasion des cellules de la composante gliale tumorale.Des anticorps capables de reconnaître et neutraliser à la fois l’AM, le CLR, RAMP2 et RAMP3 agissant de la même manière sur la croissance tumorale et l’angiogenèse représenteraient un bénéfice thérapeutique majeure. Le laboratoire a alors développé des anticorps dirigés contre un peptide chimérique constitué de l’enchainement de séquences peptidiques des protéines CLR, RAMP2, RAMP3 et du peptide AM (« AMRc »). Les tests effectués avec les anticorps anti-AMRc nous permettent d’affirmer leur efficacité sur le système AM/AMR. Le traitement par ces anticorps diminue la croissance in vitro et in vivo des cellules tumorales de glioblastomes U87, ainsi que leur migration et leur invasion et la densité vasculaire au sein de xénogreffes, ce qui suggère leur effet sur l’angiogenèse tumorale. De plus, le traitement par ces anticorps augmente la perméabilité du modèle de cellules endothéliale microvasculaires HMECs. Ces résultats très encourageants, nous permettent donc pour le moment de valider la faisabilité du concept d’anticorps développés à partir d’un peptide chimère pour neutraliser le sytème AM/AMR, dans le but d’envisager dans le futur une application thérapeutique. / Glioblastomas are fatal tumors because of their aggressiveness and the lack of effective treatments. The increased proliferation, invasiveness and resistance in cell death of glioblastomas tumoral compartment confer them a fast growth and an invasion of the surrounding cerebral parenchyma, at the origin of glioblastomas systematic recurrence. Furthermore, angiogenesis within these tumors participates actively in the poor prognosis developing a strong vascularization, which favors their growth.Adrenomedullin (AM), is a vasoactive peptide ubiquitously expressed in humans and thus induces multiple biological actions through the body as tumor growth, via autocrine and paracrine activation of its receptors CLR/RAMP2 and CLR/RAMP3 (« AMR »). But AM expression is correlated with gliomas grading and our team demonstrated that polyclonal antibodies « anti-AM » developped in the laboratory inhibited in vitro glioblastoma tumoral cells proliferation and in vivo tumor growth. Polyclonal antibodies (anti-AMR) directed against AM receptors (CLR, RAMP2 and RAMP3) also inhibited in vitro growth, migration and endothelial cells (HUVECs) pseudo-capillar formation, suggesting neutralization of some steps of angiogenesis. Moreover, anti-AMR antibodies inhibited in vivo tumor growth by suppression of angiogenesis, suggesting AM receptors as a therapeutical target.These studies have been done from lineage cells. We thus characterized AM/AMR system within glial and microvascular components from patients glioblastoma primary cultures and we investigated AM impact in some stages of angiogenesis. We showed that AM was three fold higher expressed by microvascular cells in whom AM induces migration, invasion and organization into a meshwork of capillary-like tubular structures. AM increased too, glial tumoral cells migration and invasion.Antibodies able to recognize and neutralize AM, CLR, RAMP2, RAMP3 and acting in tumor growth and angiogenesis would represent a major therapeutic benefit. Then, the laboratory developped polyclonal antibodies directed against one chimeric peptide synthesized with AM, CLR, RAMP2 and RAMP3 peptide sequences (named « AMRc »). The tests made with anti-AMRc antibodies allow us to assert their efficiency on the AM / AMR system. Glioblastoma cell line U87’s growth decreases in vitro and in vivo after treatment with anti-AMRc antibodies, as well as its migration, invasion and vascular density inside tumor xenografts, suggesting an impact in tumor angiogenesis. Furthermore, the treatment with these antibodies increases the microvascular endothelial HMECs permeability. These promising results allow us to validate the feasibility of a concept of antibodies developed against one peptide to neutralize AM/AMR system, in order to envisage a future therapeutic application.

Les Glioblastomes (GBM) sont des tumeurs cérébrales de trés sombre pronostic malgré leur traitement associant résection chirurgicale et chimio/radiothérapie. Ils contiennent notamment une sous-population de cellules souches/initiatrices de GBM (GIC) impliquée dans la radio/chimiorésistance et la récidive de ces tumeurs en étant capable de générer la majorité des cellules tumorales plus différenciées. Des études ont montré que les cellules tumorales pourraient avoir la capacité de se dédifférencier et d'acquérir un phénotype plus proche des GIC en réponse à des stress. Notre hypothèse est qu'une telle plasticité pourrait avoir lieu en réponse aux radiations ionisantes (RI) et participer à la récidive rapide de ces tumeurs après thérapie. En effet, j'ai montré que l'exposition de cultures primaires de cellules de GBM établies à partir de résection de patients à une dose infra-toxique et cliniquement relevante de RI potentialise à long terme la réacquisition de caractéristiques associées au phénotype des GIC (auto-renouvellement, expression de marqueurs souches et tumorigénicité). J'ai identifié au cours de ce processus (1) une surexpression de la protéine anti-apoptotique Survivine; dont l'inhibition pharmacologique bloque la plasticité radio-induite, (2) une reprogrammation métabolique précoce et (3) une enzyme impliquée dans l'acidification du pH extracellulaire, qui semble favoriser le processus de dédifférenciation radio-induite. A terme, le ciblage des mécanismes impliqués dans de ce processus adaptif aux RI pourrait contribuer à développer des stratégies thérapeutiques innovantes pour radiosensibiliser ces tumeurs. / Glioblastomas (GBM) are some highly lethal brain tumors despite a treatment associating surgical resection and radio-chemotherapy. Amongst these tumors, a subpopulation of radio/chemoresistant GBM stem-like/initiating cells (GIC) appears to be involved in the systematic GBM recurrence through the generation of more differenciated tumoral cells. Recent studies showed that tumor cells may have the ability to dedifferentiate and acquire a GIC phenotype in response to microenvironment stresses. We hypothesized that GBM cells could be subjected to a similar dedifferentiation process after ionizing radiations (IR), then supporting the GBM rapid recurrence after radiotherapy. Indeed, I showed that the exposure of several primo-cultures of differentiated GBM cells isolated from patient resections to a subtoxic and clinically relevant IR dose potentiated the long-term reacquisition of GIC properties (self-renewal ability, expression of stemness markers and tumorigenicity). I also identified during this process (1) an up-regulation of the anti-apoptotic protein Survivin whose pharmacological down-regulation led to a blockade of the IR-induced plasticity, (2) the presence of a metabolic shift occurring quickly after IR and (3) an enzymatic target, which appears to be involved in extracellular acidification under IR and could also potentiate the long term dedifferentiation induced by IR. At term, targeting the mechanisms associated with IR-induced plasticity in order to inhibit the IR-induced adaptive processes will likely contribute to develop some innovating pharmacological strategies for an improved radio-sensitization of these brain tumors.

Les glioblastomes (GB) sont des tumeurs cérébrales invasives, résistantes et qui récidivent systématiquement malgré un traitement associant chirurgie, radio- et chimiothérapie. Ces tumeurs de très mauvais pronostic, se caractérisent par une survie médiane de 15 mois. L'agressivité des GB est notamment due à la présence d'une sous-population de cellules souches (GSC). Les GSC sont caractérisées par leurs capacités d'auto-renouvellement, d'expression de différents marqueurs souches, de multipotence et de tumorigenèse. Elles sont fortement impliquées dans la résistance et la récidive tumorale et leur ciblage pourrait améliorer le traitement des GB. Au vu de la littérature et de résultats obtenus au laboratoire, l'intégrine ß8 est apparue comme une nouvelle cible potentielle de ces GSC. Cette intégrine est décrite comme possédant un rôle majeur dans la survie et l'auto-renouvellement des cellules progénitrices neurales saines et sa surexpression est associée à une diminution de la survie des patients. Nous avons alors émis l'hypothèse que l'intégrine ß8 pourrait être impliquée dans le maintien de l'état souche des GSC. J'ai démontré au cours de ma thèse que cette intégrine est surexprimée dans des primocultures de GSC issues de résections de GB ainsi que dans des coupes de tumeurs de patients. De plus, j'ai mis en évidence que ß8 est associée à l'état souche et à des fonctionnalités propres à ces cellules, notamment leur auto-renouvellement, leur viabilité, leur migration et leur radiorésistance. En inhibant sélectivement ß8 dans nos primocultures de GSC par si/shRNA, j'ai en effet observé in vitro une diminution de la formation de neurosphères et de la migration cellulaire ainsi qu'une augmentation de la différentiation et de la mort cellulaire, cette dernière étant potentialisée après irradiation. Enfin, in vivo, j'ai mis en évidence que l'inhibition de ß8 se traduit par une diminution de la tumorigenèse et une augmentation de la survie des souris. En conclusion, mes résultats de thèse permettent d'identifier l'intégrine ß8 comme une protéine membranaire nécessaire au maintien de l'état souche dans les GSC mais surtout comme une potentielle cible thérapeutique radiosensibilisante dans les GB. / Glioblastomas (GB) are invasive, resistant and recurrent brain tumors (median overall survival of 15 months) despite standard treatment including surgical resection, radio- and chemotherapy. This tumor aggressiveness could partly be explained by the presence into the tumor of Glioblastoma-Stem like Cells (GSC), characterized by their ability to self-renew, their higher expression of specific GSC markers, their multipotent aptitude and their high tumorigenic potential. They are strongly involved in tumor resistance and recurrence and their targeting could improve GB treatment. Regarding current literature but also transcriptomic results obtained in our lab, a specific ß8 integrin emerged as a potential selective target in GSC. We then hypothesized that ß8 integrin could be involved in stemness maintenance of GSC. I first demonstrated, during my doctoral thesis, that ß8 is overexpressed in primocultures of GSC isolated from patients resections and also in human GB samples. Moreover, I showed that this integrin could be associated with stemness and features unique to these cells, including self-renewal ability, viability, migration and radioresistance. Indeed, the selective inhibition of ß8 in GSC by si/shRNA resulted in vitro in a decrease of neurosphere formation and migration, associated with an increase of differentiation patterns and cell death, this one being potentiated after irradiation. Finally, in vivo, I showed that ß8 inhibition decreased tumorigenesis and increased mice survival. In conclusion, my doctoral results allow to identify ß8 integrin as a membrane protein essential for stemness maintenance of GSC but mostly as a new potential radiosensitizing therapeutic target for GB.

Le travail de cette thèse s’est articulé autour de l’étude de CRMP5 au cours du développement du système nerveux central. Nous avons mis en évidence une interaction directe entre CRMP5 et la tubuline, conduisant à une inhibition de la pousse neuritique dans différentes lignées cellulaires, ainsi qu’à une inhibition d’élongation uniquement au niveau des dendrites et non de l’axone, dans des cultures primaires de neurones de l’hippocampe. De plus, nous avons montré que CRMP5 pouvait annuler l’action de CRMP2, connue pour promouvoir la pousse neuritique, de façon dominante mais dépendante de la présence sur CRMP5 du site de fixation à la tubuline. Contrairement à CRMP2, l’expression de CRMP5 étant transitoire pendant la différentiation neuronale, elle permettrait de restreindre de façon spatio-temporelle l’effet de CRMP2 sur la pousse neuritique, régulant ainsi la polarité neuronale. D’autre part, nous avons également rapporté la présence de CRMP5 au niveau mitochondrial où elle pourrait jouer un rôle dans le processus d’autophagie des mitochondries. Enfin, nous nous sommes intéressés à l’étude de la CRMP5 exprimée en conditions pathologiques, et nous avons observé une nouvelle localisation nucléaire de la protéine dans certaines cellules cancéreuses. Etant localisée dans plusieurs compartiments subcellulaires et impliquée dans différents mécanismes moléculaires, l’ensemble de ce travail décrit donc la protéine CRMP5 comme une protéine « multi-fonctionnelle ». / The purpose of this work is to focus on the study of CRMP5 during development of the central nervous system. We have demonstrated a direct interaction between CRMP5 and tubulin, leading to inhibition of neurite outgrowth in different cell lines, and inhibition of growth only at dendritic but not axonal level, in hippocampal neurons. Furthermore, we showed that CRMP5 could counteract the previously described CRMP2 effect on neurite outgrowth. The CRMP5 acted as a dominant signal to counteract CRMP2 outgrowth promotion and this function is also dependent on the tubulin-binding capacity of CRMP5.Unlike CRMP2, the CRMP5 expression being transient during neuronal differentiation, it would imply in the spatiotemporal regulation of the CRMP2 effect on neurite outgrowth, thereby regulating neuronal polarity. In another part, we also reported the presence of CRMP5 at mitochondrial level in vivo where it could play a role in mitochondrial autophagic process.Finally, we were interested in the study of CRMP5 expressed in pathological conditions, and we discovered a new nuclear localization of the protein in some cancer cells. Being localizedin several subcellular compartments and involved in different molecular mechanisms, this work describes CRMP5 as a "multi-functional" protein.

Les glioblastomes sont des tumeurs cérébrales très agressives présentant une médiane de survie de 15 mois malgré l’usage du traitement de référence. Parmi les stratégies innovantes anti-glioblastome, les microARNs (miARN) constituent de nouvelles cibles et des outils thérapeutiques à fort potentiel. En outre, pour atteindre les cellules tumorales notamment au niveau loco-régional, les miARNs nécessitent d’être administrés grâce à des vecteurs sûrs et efficaces. L’objectif de ce travail a été de développer un système nanoparticulaire original de polyamidoamine réticulé (PAA) capable de véhiculer des miARNs au niveau cellulaire et tissulaire. Dans un premier temps, un test basé sur l’expression de la luciférase a été mis au point afin d’étudier la cytotoxicité et l’efficacité de nanoparticules des miARNs. Dans un second temps,des nanoparticules PAA-miARN ont été développées. Différentes conditions de formulation ont été testées afin d’optimiser la complexation entre miARNs et polymères. En l’absence d’efficacité cellulaire significative des premiers objets obtenus, des modifications du procédé de formulation ont été apportées, permettant une plus grande stabilité et une meilleure efficacité. Une fonctionnalisation par greffage de groupements biotine à des complexes PAA thio-réticulés a amélioré l’efficacité des internalisations. En conclusion, ce travail a permis le développement d’une méthode simple et rapide pour l’évaluation de l’efficacité et de la cytotoxicité de nanoparticules de miARN. La stabilité des nanoparticules a été augmentée par réticulation de thiolet leur internalisation a été améliorée par le greffage,adapté et modulable, d’un ligand cellulaire. / Glioblastoma are aggressive brain tumours with a median survival of 15 months even with the best currently available treatment options. microRNAs (miRNA) are ~23 nucleotide natural silencing RNAs that have great potentials to improve cancer treatment outcomes. Lack of a safe, stable and efficient delivery system has, however, hindered the use of miRNAs inclinical applications. The aim is therefore to develop amiRNA delivery system adapted to glioblastoma using linear chain cationic polyamidoamine (PAA) polymers.The first part involved the development of luciferase assay that combined the measurement of gene-knockdown efficiency and cytotoxicity of miRNA nanoparticles. The simple two-step procedure was more effective and sensitive compared to the conventional protein-based normalization method. The second part was focused on the development of miRNA nanoparticles. In the initial phase, conditions required for maximum miRNA-polymer binding was achieved, however, the newly developed miRNA-PAA nanoparticlesdid not produce significant functional gene-knockdown after cell treatment. The second stage was focused on the optimization of nanoparticle formulation as a function of stability in physiologicalionic concentration. Stable PAA-nanoparticles displaying moderate cellular uptake and gene-knockdown were obtained. The final stage of development was focused on PAA-nanoparticle tagging with biotin, which improved their cellular uptake. This work developed simple and informative luciferase assay ; the stability of miRNA-PAA-nanoparticles was improved by thiol-crosslinking and the functional performance was strongly enhanced by a simple butsmart method of ligand tagging.

Les gliomes malins sont les tumeurs les plus fréquentes du système nerveux central. Les glioblastomes représentant plus de 50% des gliomes, constituent la forme la plus agressive et sont particulièrement résistants à la radiochimiothérapie. Au sein de ces tumeurs réside une sous-population de cellules souches tumorales (CSG) qui pourrait être responsable de leurs initiation, progression et résistance aux traitements. Ces processus sont gouvernés par des voies de signalisation, pour la plupart activées de manière constitutive et dont l’étude est nécessaire afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la gliomagenèse. L’objectif de ces travaux de thèse consistait en l’exploration des voies de signalisation STAT3 et Hippo dans les gliomes dans le but d’identifier de nouveaux marqueurs pronostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. La première partie de ces travaux a montré que la phosphorylation S727 de STAT3 jouait un rôle important dans la radioresistance des CSG et que son inhibition pharmacologique induisait leur radiosensibilisation. Dans un second temps, ces travaux ont montré que deux effecteurs de la signalisation Hippo, YAP1 et TEAD3, sont associés à un mauvais pronostic et qu’ils seraient impliqués dans la prolifération cellulaire et le phénotype des CSG notamment par inhibition de la signature proneurale. Ainsi, ces travaux visent à proposer de nouvelles pistes thérapeutiques, d’une part l’inhibition de la pS727-STAT3 afin de potentialiser les effets de la radiothérapie et d’autre part, les effecteurs de la signalisation Hippo comme biomarqueurs pronostiques et potentielles cibles thérapeutiques. / Malignant gliomas are the most common tumors of central nervous system. Glioblastomas represent more than 50% of all glioma and constitute the most aggressive form of the tumor which is particularly resistant to radiotherapy. The presence of the subpopulation of glioblastoma stem cells (GSC) could be involved in tumor initiation, progression and therapeutic resistance. Hence, these processes are governed by signaling pathways which are mostly constitutively activated and their study is necessary for a better understanding of gliomagenesis. The aim of this PhD thesis was to assess STAT3 and Hippo signaling pathways in glioma to identify new prognostic markers and potential therapeutic targets. The first part on this work showed that pS727 phosphorylation of STAT3 could be involved in radioresistance and its inhibition induced GCS radiosensitization. Additionally, this work showed that YAP1 and TEAD3, two effectors of Hippo signaling, are associated with poor patient survival and could be involved in GSC proliferation and phenotype maintenance by inhibiting proneural gene signature. Thereby, this work aims to offer new therapeutic avenues, on the one hand the inhibition of pS727-STAT3 for radiotherapy potentiation and on the other hand the effectors of Hippo signaling as prognostic biomarkers and potential therapeutic targets.

Les glioblastomes (GBs) sont les tumeurs primitives du SNC les plus agressives de l’adulte. Les causes d’échec thérapeutiques sont multiples, comme une résistance des cellules tumorales à l’apoptose, l’existence de cellules souches cancéreuses ou un microenvironnement pro-tumoral. La découverte de molécules thérapeutiques qui pourraient avoir une action pléiotrope est particulièrement attractive. Dans ce contexte nous nous sommes intéressés aux mimétiques de Smac (MS), antagonistes des inhibiteurs de l’apoptose (IAP), qui inhibent le plus souvent cIAP1, cIAP2, XIAP et ML-IAP. Nous avons recherché si les IAP pouvaient être des cibles thérapeutiques dans les GBs humains en étudiant leur expression et leurs valeurs pronostiques éventuelles : les IAP sont exprimés dans les GBs et ML-IAP est associé à un plus mauvais pronostic. Nous avons choisi d’utiliser pour la suite de nos expériences, un MS qui avait une action sur les IAP et en particulier ML-IAP : le GDC-0152. Le GDC-0152 induit l’apoptose in vitro, augmente la survie des souris porteuses de GB et ralentit la croissance tumorale in vivo. Ensuite nous avons recherché si l’effet du GDC-0152 pouvait être différent en fonction du taux d'oxygène. En effet, les GBs sont des tumeurs hypoxiques. Nous avons cultivé en normoxie et en hypoxie, quatre lignées de cellules souches de GBs. En normoxie, le GDC-0152 induit la différenciation des cellules souches (voie NF-κB) et en hypoxie il induit l’apoptose et diminue la prolifération cellulaire (voie ATR).Ces travaux soulignent l’importance du modèle préclinique utilisé dans la caractérisation de l'effet de nouvelles molécules et le potentiel thérapeutique des MS dans les GBs. / Glioblastomas (GBs) are the most aggressive primary brain tumors in adults. The causes of therapeutic failure are unknown and are multiples, such as tumor cell resistance to apoptosis, the presence of cancer stem cells or a pro-tumor microenvironment. Thus, the discovery of therapeutic molecules with pleiotropic action is particularly interesting. In this context, we are interested in smac mimetics (SM), antagonists of inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) and most often antagonize cIAP1, cIAP2, XIAP and ML-IAP.We investigated whether IAPs could be attractive therapeutic targets in human GBs by studying their expression and their possible prognostic values. All IAPs were expressed in various degrees in GBs and ML-IAP was associated with a worse prognosis. Therefore, we chose GDC-0152 for the rest of our experiments because it antagonizes the different IAPs and in particular ML-IAP. We showed that GDC-0152 induces apoptosis in vitro, increases the survival of GB-bearing mice and slows tumor growth in vivo.We investigated whether the effect of GDC-0152 could be different depending on the oxygen level. Indeed, GBs are part of the most hypoxic tumors. For this purpose, four GB stem cell lines were grown in normoxia and hypoxia. We found that GDC-0152 has an anti-tumor effect regardless of oxygen level, but the signaling pathways involved were different. In normoxia, GDC-0152 induces differentiation of GB stem cells (NF-κB pathway) and in hypoxia it induces apoptosis and decreases cell proliferation (ATR pathway).This work highlights the importance of the preclinical model used in the characterization of a new molecule effects and the therapeutic potential of SM in GBs.

Les glioblastomes (GBMs) sont des tumeurs cérébrales au pronostic défavorable. La résistance aux thérapies actuelles et la rechute des GBMs pourraient être due à l'existence de cellules aux propriétés souches. L'objectif de ma thèse a été la caractérisation des cellules souches de GBMs (CSGs) isolées à partir de tumeurs. L'analyse du profil souche et de pluripotence des CSGs a montré qu'elles sont maintenues dans un état souche par SOX2 et que COL1A1 et IFITM1 peuvent être des cibles thérapeutiques potentielles. L'étude de la radiosensibilité des CSGs à travers l'analyse des courbes de clonogénicité a mis en évidence deux groupes dont un «atypique» pouvant être composé de sous-populations de cellules aux radiosensibilités différentes qu'il conviendra de caractériser. L'étude de la réparation a mis en évidence deux autres groupes dont un ayant un fort potentiel de réparation qui exprime plus fortement le gène RAD51 après irradiations. Le traitement par un inhibiteur spécifique de RAD51 ralentirait la capacité de réparation de ces cellules. Malgré cette hétérogénéité, l'inhibition de la voie Hedgehog (HH) par un vecteur glucuronylé de la cyclopamine, activé par le microenvironnement tumoral, inhibe la prolifération et l'auto-renouvellement des CSGs in vitro et ralentit la croissance tumorale in vivo. La voie HH semble être une cible thérapeutique intéressante commune à toutes les CSGs. Néanmoins, il est nécessaire de prendre en compte l'hétérogénéité dans les populations tumorales pour le développement de la médecine personnalisée. / Glioblastomas (GBMs) are brain tumors with a poor prognosis. Their resistance to current therapies and the occurrence of tumor relapse may be related to the existence of cells bearing stem cell characteristics. The aim of this PhD research was to characterize glioblastoma stem cells (GSCs) having been isolated from tumors. Analysis of the stemness and pluripotency profiles of GSCs indicated that their stemness states are maintained by SOX2 and that COL1A1 and IFITM1 may be potential therapeutic targets. Clonogenic studies of GSC radiosensitivity underscored the presence of two groups, one of them composed of sub-populations of cells with different degrees of radiosensitivity that have yet to be fully characterized. Study of DNA repair capacity highlighted two additional groups including one with high repair potential overexpressing the RAD51 gene after 4Gy. However, treatment with RAD51 inhibitor is likely to slow down repair of GSC lesions. Notwithstanding GSC heterogeneity, in our study inhibition of the Hedgehog pathway (HH) by a cyclopamine glucuronid prodrug, activated by the tumor microenvironment, inhibited in vitro proliferation and self-renewal in all the GSCs tested and slowed down tumor growth in vivo. Hence, HH pathway appears to be conserved among GSCs and constitutes an interesting potential therapeutic target. With regard to the development of personalized medicine, it is nevertheless highly advisable to take into account the pronounded heterogeneity of tumor populations.

Les glioblastomes (GBM) sont des tumeurs astrocytaires au pronostic défavorable. L’échec des thérapies actuelles (chimio et radiothérapies) est principalement lié à la résistance des cellules souches cancéreuses (CSCs). Ces cellules ont besoin de communiquer en permanence avec leur microenvironnement pour leur survie et pour maintenir une niche favorable à leur développement. Le transfert de matériel entre les CSC, les cellules tumorales et le microenvironnement contribue à l’échappement thérapeutique. Des travaux récents révèlent l’importance des récepteurs aux neurotrophines TrkB et TrkC dans la survie et la croissance des CSC de GBM. Nos travaux préliminaires dans le cancer bronchique démontrent que les récepteurs aux neurotrophines sont transférés aux cellules du microenvironnement via les exosomes afin de les contrôler. Cependant, le mécanisme de diffusion de récepteurs oncogéniques à partir de CSC n’a jamais été étudié. Notre objectif principal était donc de déterminer l’implication des récepteurs des neurotrophines dans le transfert du phénotype agressif des CSC vers les cellules du microenvironnement afin de favoriser la résistance thérapeutique du glioblastome. Nos résultats ont permis d’établir un lien entre le stade de différenciation des cellules tumorales, l’expression des neurotrophines et leur interaction avec le microenvironnement tumoral via les exosomes. Le transfert de TrkB au sein des exosomes joue un rôle clé dans la progression tumorale du GBM et dans l’agressivité cellulaire. Néanmoins, le transfert des récepteurs aux neurotrophines via les exosomes pourrait également être impliqué dans les mécanismes de radiorésistance. Des études menées sur des cellules de GBM humain irradiées et traitées par des exosomes démontrent l’implication de ces derniers dans l’échappement thérapeutique. Parmi les cellules du microenvironnement ciblées par les exosomes, les CSM sont celles qui ont été les moins étudiées bien qu’elles possèdent un tropisme spécifique pour le GBM. Nos travaux démontrent que les exosomes de GBM modifient le phénotype des CSM et augmentent leurs capacités prolifératives et migratoires. La fonction exacte du transfert des récepteurs des neurotrophines devra être analysée dans ces différents modèles afin de préciser son importance dans la physiopathologie du glioblastome et sa progression. L’expression des récepteurs aux neurotrophines dans ces exosomes permet d’envisager leur utilisation en tant que biomarqueurs diagnostiques et/ou pronostiques dans le GBM. Mots clés : Glioblastomes, cellules souches cancéreuses, neurotrophines, TrkB, radiothérapie, cellules souches mésenchymateuses, exosomes. / Glioblastoma are tumors derived from astrocytes with a dark prognosis. Current therapies fail to inhibit relapses due to radioresistant properties of cancer stem cells (CSC). Communication between CSC and their microenvironment is required for maintain “stem cells niche” and cell survival . The transfer of materials between CSC, tumor cells and microenvironment contributes to therapeutic resistance. In glioma, recent studies reveal the major role of TrkB and TrkC in survival of CSC. Our previous work, in lung cancer, have shown that neurotrophin receptors exhibits a control on microenvironment cells and angiogenesis through exosome transfer. However, similar mechanism of oncogenic receptor transfer from CSC has never been studied. Our main goal was to determine the involvement of neurotrophin receptors in the transfer of biological aggressiveness to microenvironment cells in order to promote therapeutic resistance in glioblastoma. Our findings suggest a relationship between cell differentiation status, expression of neurotrophin receptors and their interaction with the microenvironment through exosomes. TrkB-containing exosomes play a key role in the control of glioblastoma progression and cell aggressiveness. Mechanisms of radioresistance might also be dependent of the transfer of neurotrophin receptors through exosomes. Indeed, our results on irradiated human GBM cells and treated by exosomes demonstrate the involvement of exosome in radioresistance mechanisms. Although mesenchymal stem cells (MSCs) are considered as stromal components of glioblastoma, their communication with CSC, particularly through exosomes, remain largely undefined. Our results show that GBM-derived exosomes modify the phenotype of MSCs and increase their proliferative and migratory abilities. The putative function of neurotrophin receptors transfer should be analyzed in these models to determine their prime role in glioblastoma pathogenesis and progression. This finding suggest that the neurotrophin receptor expression in exosomes could be used as diagnostis and prognosis biomarkers of GBM.