It has been proven that platinum complexes are active in anticancer treatment as well as several other transition metals complexes. There is an effort in recent medicine to replace cisplatin complexes by drugs with smaller side effects. This work focuses on the reaction of 5'-dGMP (2'-deoxyguanosine-5'˗monophosphate) and cGMP (cyclic 2'-deoxyguanosine- monophosphate) with a platinum complex PtIV (dach)Cl4 (dach=diaminocyclohexane). In these two cases the Pt(IV) complex is only reduced in the presence of 5'-dGMP. The first part of the explored mechanism is the substitution reaction where a coordinate-covalent bond between platinum and nitrogen N7 of guanine is formed. In the next step oxygen of phosphate group is transferred to the C8 site. Subsequently the Pt(IV) complex is reduced. The final products represent 8˗oxo˗GMP and PtII (dach)Cl2, which are active in anticancer treatment in comparison with the kineticly inert reactant. The substitution of a chloride anion ends the reaction path for cGMP forming PtIV (dach)Cl3(N7-cGMP) complex. The structures were optimized at the DFT level with B3LYP functional in the basis set 6-31G(d) and PCM/UA0 solvation model. The energy parameters were computed at the B3LYP/6˗311++G(2df,2pd) level in the IEFPCM/sUAKS solvation model. Finally, the rate constants were...

Parts of human telomere sequences containing at least 4 guanine subsequences show the ability to form intrastrand quadruplexes of remarkable conformational diversity. Former studies using conventional Raman spectroscopy have revealed that the sequence G3(TTAG3)3 at milimolar concentrations in phosphate buffer solution doped with Na+ ions (ionic strength 150 mM) adopts antiparallel conformation regardless of the length of standing at room temperature or annealing, whereas K+ ions cause gradual transition to "3+1" or even parallel conformation. On the other hand, measurements carried out upon sequence AG3(TTAG3)3 at similar concentrations using Photonic Crystal Fibre-enhanced Raman Spectroscopy (PCFRS) suggest that in the respective presence of both Na+ and K+ (ionic strength 100 mM), a parallel structure is adopted. The hereby presented work employs conventional Raman spectroscopy and Drop Coating Deposition Raman spectroscopy to examine the sequence AG3(TTAG3)3 at concentrations ranging from units to hundreds of milimoles in strands. It concludes that the structure adopted in the presence of Na+, resp. K+ ions is antiparallel, resp. "3+1", and doesn't change over time despite both long standing and annealing. Two hypotheses about the cause of the differences between the results obtained by PCFRS and...

Der brustgewebsspezifische Metabolismus des weiblichen Sexualhormons 17β-Estradiol (E2) spielt eine wichtige Rolle bei der Brustkrebsentstehung. In der Brust wird E2 durch die humanen Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen (CYP) Isoenzyme 1A1 (hCYP1A1) und 1B1 (hCYP1B1) zu 2-Hydroxy (2-OH) und 4-HO-E2 oxidiert und vorrangig durch die Catechol-O-Methyltransferase (COMT) entgiftet. Bei unzureichender O-Methylierung können diese Catecholestrogene zu elektrophilen Chinonen oxidiert werden, welche mit der DNA reagieren und somit Mutationen induzieren können. Eine niedrige COMT-Aktivität, durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, könnte daher die Mutagenität von E2 und dessen Catecholestrogenen beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Hemmung der COMT-Aktivität auf die Mutagenität von E2 und dessen Catecholestrogenen untersucht. Zu diesem Zweck wurden der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT)-Test und der Mikrokern-Test eingesetzt. Die Untersuchungen erfolgten in kultivierten Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters (V79-Zellen) und in V79-Zellen, die mit hCYP1A1 transfiziert wurden. Begleitend zu den Mutagenitätsuntersuchungen wurde das Metabolitenprofil der Testsubstanzen anhand von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie bestimmt. Nach Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 wurde dieses vollständig zu dessen Methylcatecholen umgesetzt, ab 2,5 µM hingegen war zusätzlich 2 HO-E2 im Medium nachweisbar. Demnach war die Hemmung der COMT-Aktivität bei der Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 vollständig und ab 2,5 µM partiell. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität war 2 Methoxyestradiol der Hauptmetabolit. 2-HO-E2 induzierte im Konzentrationsbereich 0,08 µM - 5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, keine Erhöhung der Mutantenfrequenz im hprt-Lokus von V79-Zellen. Im Gegensatz hierzu induzierte 2 HO-E2 ab 2,5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, mindestens eine Verdreifachung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation, wobei dieser Effekt ohne Inhibierung der COMT-Aktivität stärker ausgeprägt war. Über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich (5 - 40 µM) wurde 4 HO-E2 zu dessen beiden Methylcatecholen umgesetzt, wobei 4-Methoxyestradiol den größten Anteil der detektierten Verbindungen (≥ 86%) ausmachte. Nach der Behandlung mit 3,5-Dinitrocatechol waren keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar, weswegen von einer vollständigen Hemmung der COMT-Aktivität im gesamten getesteten Konzentrationsbereich auszugehen war. 4-HO-E2 induzierte über den gesamten getesteten Konzentrationsbereich keine Genmutationen im hprt-Lokus. Erst nach Hemmung der COMT-Aktivität und Behandlung mit 20 µM 4 HO-E2 wurde eine Verdreifachung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität induzierte 4 HO E2 ab 20 µM eine Verdopplung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation. Im Kulturmedium der V79 hCYP1A1-Zellen, die mit 0,1 und 1 µM E2 für bis zu drei Wochen behandelt wurden, machten über die gesamte Versuchsdauer E2 (> 86%) und Estron (> 10%, bezogen auf die Summe aller Peakflächen) den größten Anteil der detektierten Verbindungen aus. Wie erwartet, waren nach Hemmung der COMT-Aktivität keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar. Die durchgehende, zwei- und dreiwöchige Behandlung mit jeweils 0,1 und 1 µM E2 bewirkte keine Induktion von Genmutationen im hprt-Lokus. Demgegenüber erhöhte sich die Mutantenfrequenz nach Hemmung der COMT-Aktivität und dreiwöchiger Behandlung mit 0,1 µM E2 um Faktor 4 im Vergleich zur Kontrollpopulation. Was die Mikrokerninduktion betrifft, so wurde nach 24-stündiger Inkubation mit 0,1 und 1 µM E2, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, keine Erhöhung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Über die gesamte Dauer der Mutagenitätstests von E2 und dessen Catecholestrogenen unterschieden sich die Zellzyklusverteilung, die Wachstumskurven und die Koloniebildungsfähigkeit zum Zeitpunkt der Selektion, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivität, nicht statistisch signifikant von denjenigen der Kontrollpopulationen. Demnach war von einer sicheren Detektion von Mutationen im HPRT-Test und im Mikrokerntest auszugehen. Zusammenfassend bestätigen die durchgeführten Untersuchungen, dass die zelluläre COMT-Aktivität eine essentielle Rolle zur Entgiftung mutagener Catecholestrogene spielt. Eine hundertprozentige Inhibierung der Aktivität dieses Enzyms führt zur Induktion von Genmutationen durch 4 HO-E2 in V79-Zellen ohne CYP-Aktivität und durch E2 in V79-Zellen, die hCYP1A1 exprimieren. Demnach könnte eine Reduktion der COMT-Aktivität durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, die Induktion von Genmutationen durch E2 und dessen Catecholestrogenen begünstigen. / Oxidative metabolism of the female sex hormone 17β-estradiol (E2) is considered to play a major role in the initiation of hormone-induced carcinogenesis. In extrahepatic tissues, E2 undergoes metabolic activation by human cytochrome P450-dependent monooxygenase (CYP) isozymes 1A1 (hCYP1A1) and 1B1 (hCYP1B1) to 2-hydroxy (HO)- and 4-HO-E2. If not conjugated these catecholestrogens can further oxidize to electrophilic quinones, which may react with DNA and induce thereby mutations. Conjugation of these catechols in extrahepatic tissues is mainly catalyzed by catechol-O-methyltransferase (COMT). A low COMT activity, caused for example by polymorphisms and certain food components, which influence the enzyme activity or its gene expression, may therefore enhance quinone formation and thereby the induction of mutations. The aim of the present work was to determine the effect of inhibition of COMT on the mutagenic potential of a) the catechols 2- and 4-HO-E2 in V79 wild type cells without CYP activity and b) E2 in V79 cells expressing hCYP1A1. 3,5-dinitrocatechol (20 μM) served as COMT inhibitor. Gene and chromosomal mutations were assessed using the hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase (HPRT) and the micronuclei assay. In addition, the metabolite profile of E2 and its catechols in the culture medium was analyzed via gas chromatography/mass spectrometry. After incubation of V79 cells with 2-HO-E2, 2-methoxyestradiol was the major metabolite, whereas in the presence of the COMT inhibitor, disappearance (0.08 μM) and a decreased amount (2.5 μM or more) of methylated inactivation products was observed. Treatment of V79 cells with 0.08 μM – 5 μM 2-HO-E2, neither with nor without inhibition of COMT activity induced a significant increase in mutant frequency at the hprt locus. In contrast, at concentrations above or equal to 2.5 μM 2-HO-E2, at least a 3-fold increase of the micronuclei rate compared to control cells was observed with and without inhibition of COMT activity. Over the entire concentration range (5-40 μM) 4-HO-E2 was mainly converted to its methylation products, 4-methoxyestradiol being the major metabolite (≥ 86%) of the detected compounds. After treatment with 3,5-dinitrocatechol no methylation products were detected, thus indicating a complete inhibition of COMT over the entire concentration range. 4-HO-E2 did not induce gene mutations at the hprt locus in V79 cells with active COMT. Yet, after inhibition of COMT and treatment with 20 μM 4-HO-E2, a 3-fold increase in the mutant frequency was observed in comparison to control cells. Like 2-HO-E2, induction of micronuclei by 20 µM 4-hydroxyestradiol and more, was not affected by inhibition of COMT. In the culture medium of V79 cells expressing hCYP1A1, which were incubated with 0.1 and 1 μM E2 for up to three weeks, over the entire assay duration, E2 and estrone (86% and 10% of the sum of all peak areas, respectively) were the major metabolites. As expected, no methylation products were detected after inhibition of COMT. Treatment of V79 cells expressing hCYP1A1, for two and three weeks with 0.1 and 1 μM E2 did not induce gene mutations at the hprt locus. In contrast, a 4-fold increase in mutant frequency was observed in comparison to control cells after inhibition of COMT and treatment with 0.1 μM E2 for three weeks. With and without inhibition of COMT, no increase in micronuclei rate compared to control cells was observed after incubation with 0.1 and 1 μM E2 for 24 hours. Over the entire duration of the mutagenicity assays of E2 and its catechols, cell cycle distribution, cell growth and plating efficiency at the time of mutant selection, with and without inhibition of COMT, did not differ statistically significant from control cells; therefore a reliable detection of mutations in the micronuclei and the HPRT assay can be assumed. The present work confirms that cellular COMT is essential for the inactivation of mutagenic catechols. Complete inhibition of its enzyme activity results in the induction of gene mutations by 4-HO-E2 in V79 wildtype cells without CYP activity and also by E2 in cells expressing hCYP1A1. Polymorphisms and food components lowering COMT activity could therefore mediate the potential of E2 and its metabolites to induce gene mutations.

Guanine quadruplexes are a class of unusual nucleic acids conformations based on stacked planar guanine tetrads stabilized via Hoogsteen pairing and cation coordination. They are implicated in numerous cellular processes including replication, recombination or transcription. Guanine quadruplexes are widespread within the human genome but their occurrence is highest in the single stranded guanine-rich regions at telomeres. Telomeric guanine quadruplexes are gaining growing interest due to their ability to inhibit the activity of the telomerase enzyme, which is responsible for the proliferation of tumor cells. Specifically, we investigated the conformational polymorphism of the human core telomeric sequence G3(TTAG3)3 conditioned by the concentration of DNA, metal cations (K+ , Na+ ) and/or annealing. Raman spectroscopy was employed as the primary method for this study because, unlike common spectroscopic methods, it allowed us to monitor the quadruplex structure at very high DNA concentrations mimicking molecular crowding conditions in the cell. We demonstrate that the G3(TTAG3)3 quadruplex switch between the antiparallel and parallel strand alignment as a function of nucleoside and potassium concentration. In addition, we demonstrate that cationic porphyrins can be used as sensitive probes of the quadruplex...

Title: Raman microspectroscopy of living cells and biological tissues Author: Šárka Moudříková Department / Institute: Institute of Physics of Charles University Supervisor of the doctoral thesis: doc. RNDr. Peter Mojzeš, CSc., Institute of Physics of Charles University Abstract: Raman microscopy combines Raman spectroscopy with optical confocal microscopy and thus provides information on chemical composition of a sample with a µm3 resolution. In this thesis, Raman microscopy has been used to study microalgae-unicellular photosynthetic organisms that are greatly relevant for the Earth's environment as well as for biotechnological applications. Raman microscopy of photosynthetic organisms struggles with a highly intensive background of the spectra, which is formed by fluorescence of cellular photosynthetic apparatus. In this thesis, we have developed a fast and reliable photobleaching method that suppresses the unwanted background; this method has enabled us to study intracellular distribution of algal biomolecules such as proteins, starch, lipids and polyphosphate. We have investigated an evolution of these structures during a cell cycle of a model microalga Desmodesmus quadricauda. Next, we have developed a method for quantitative analysis of polyphosphate in a cellular culture of a microalga Chlorella...

Nowadays it is attached to a major effort to study applications of nanoparticles in biosensors technology. We studied the effect of gold nanoparticles on the surface of the electrodes by Electrochemical Impedance Spectroscopy method and Cyclic Voltammetry. For impedance measurements was proposed substitute electrical model and cyclic voltammetry method was used to determine the electroactive surface of electrodes.

First of all, this thesis sets itself a goal to introduce some common technics for datamining in genomics and as a next step to implement own algorithm like algorithm BLAST. In the concrete, this work is pointed to sequences of DNA. The DNA sequence contains in itself genetic information, which is template for living organism. For explanation this information can be used number of technics. This paper describes algorithm Fasta and algorithms from BLAST family. With these algorithms, it is possible to gain a lot of important information even about such DNA sequences, where only primary structure is known. Principle of these algorithms is based on alignments of one query sequence, which we want to obtain some information from, with many sequences stored in database. According to result alignment, it is possible to determine many features of the query sequence.

Die Phospholipid-Hydroperoxid Glutathion-Peroxidase (phGPx) ist ein monomeres Selenoprotein, welches innerhalb der Familie der Glutathion-Peroxidasen aufgrund seiner breiten Substratspezifität und der Fähigkeit Proteinthiole zu modifizieren eine Sonderstellung einnimmt. Vom Gen der phGPx werden nach heutigem Kenntnisstand drei verschiedene Protein-Isoformen gebildet. Die mitochondriale Isoform enthält am N-Terminus ein mitochondriales Insertionssignal und wird bevorzugt im Testis exprimiert. Von einem im Leserahmen stromabwärts liegenden Startkodon wird die kürzere, ubiquitär exprimierte zytosolische Isoform synthetisiert. Eine dritte phGPx-Isoform besitzt eine N-terminale nukleäre Lokalisationssequenz (kodiert von einem alternativen Exon 1) und wird vornehmlich in den Kernen post-meiotischer Zellen der Spermatogenese gefunden. Aufgabe dieser Arbeit war es, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die am Zustandekommen des vielfältigen Expressionsmusters der phGPx-Isoformen beteiligt sind. Im ersten Teil der Arbeit wurden transkriptionelle Regulationsmechanismen der phGPx-Expression untersucht. Im proximalen Promotorbereich (-100 bp – +228 bp) des phGPx-Gens wurden unter in vitro (Supershift-Assay) und in vivo (Chromatin-Immunopräzipitation) Bedingungen die Transkriptionsfaktoren Sp1 und NF-Y identifiziert, die an drei GC-reiche Motive beziehungsweise zwei inverse CCAAT-Boxen binden. Darüber hinaus konnten in kompetetiven Gelshift-Assays im proximalen Promotorbereich zwei Bindungssequenzen identifiziert werden, die von Faktoren der Smad-Familie gebunden werden. Funktionelle in vitro Promotorstudien mit mutierten Promotorkonstrukten zeigten, dass die Mutagenesen der Sp1- und NF-Y Bindestellen einen starken Einfluss auf die Reportergenaktivität hatten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden durch Untersuchungen von Protein-RNA-Interaktionen post-transkriptionelle Mechanismen der Expressionsregulation studiert. Mit Hilfe des in vivo Ansatzes des Hefe Drei-Hybrid Systems wurde der Guanin-reiche Sequenz bindende Faktor 1 (GRSF1) identifiziert, der in der 5’-untranslatierte Region der mitochondrialen phGPx-mRNA bindet. In RNA Gelshift-Assays wurde die Spezifität dieser Interaktion bestätigt und näher charakterisiert. Schließlich wurden für GRSF1 und die phGPx Expressionsprofile in murinen Gewebe erstellt sowie die zeitabhängige Expression beider Proteine während der Embryogenese verfolgt. Die auffällig ähnlichen Expressionsmuster lassen ähnliche Regulationsmechanismen vermuten. Die in dieser Arbeit identifizierten trans-regulatorischen Proteine Sp1, NF-Y, Smad und GRSF1 sollten an der differentiellen Expression der phGPx-Isoformen beteiligt sein. / The Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase (phGPx) is a monomeric selenoprotein that is unique in the family of Glutathione Peroxidases due to its low substrate specificity and its ability to oxidise protein thiols. Three different isoforms are known to derive from one common gene. The mitochondrial Isoform contains an N-terminal mitochondrial insertion sequence and is preferentially expressed in postpubertal testis. The shorter, ubiquitously expressed, cytosolic isoform is expressed from an in-frame start codon. A third isoform contains an N-terminal nuclear localization signal coded for by an alternative exon 1 and is preferentially expressed in the nuclei of post-meiotic spermatides. The aim of the present study is to investigate the molecular mechanisms leading to the different isoforms and causing their tissue specific expression pattern. In the first part of this work transcriptional regulatory mechanisms will be analysed. Within the proximal promoter region (-100 to +228 bp) of the phGPx gene the transcription factors SP1 and NF-Y were identified to bind to three GC-boxes and two CCAAT-boxes respectively using in vitro methods (Supershift Assays) and in vivo methods (Chromatine immunoprecipitation). Moreover, performing competitive gel shift assays two binding elements for the smad family of transcription factors could be identified. Functional in vitro reporter gene assays provided evidence that the mutagenesis of the binding sequences for NF-Y and Sp1 has a strong impact on promoter activity. In the second part of this work post-transcriptional events in the expression regulation of the phGPx were analysed on the basis of protein/RNA interactions. Applying the in vivo approach of the yeast three hybrid system the Guanin-riche sequence binding factor 1 (GRSF1) could be identified binding to the 5’-untranslated region of the mitochondrial phGPx messenger. RNA mobility shift assays were performed to further characterize the specificity of this protein/RNA interaction. Eventually, the tissue distribution of GRSF1 and phGPx was studied in murine tissues and their expression kinetics were followed during murine embryogenesis. The obvious parallel expression kinetics for mitochondrial phGPx and GRSF1 suggest common regulatory mechanisms for these two genes. All the identified trans-regulatory elements are very likely to be involved in the differential expression regulation of the phGPx isoforms.