Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:37:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 341690.pdf: 954761 bytes, checksum: 3149bde378d50bbaf2b1e527eca472db (MD5) Previous issue date: 2016 / As discinesias são caracterizadas como diversos movimentos involuntários, que podem afetar diversas partes corporais. Muitas doenças neurológicas podem apresentar esse sintoma, como a doença de Parkinson (DP). As discinesias podem ser induzidas através da administração de várias classes de drogas, entre elas a reserpina. A reserpina é um alcalóide isolado das raízes da planta Rauwolfia serpentina e atua como inibidor do transportador vesicular de monoaminas - dopamina, noradrenalina, adrenalina e serotonina - (VMAT-2) no Sistema Nervoso Central (SNC). Desta maneira, a reserpina leva à depleção destes neurotransmissores nos terminais nervosos e, como consequência, induz hipolocomoção, rigidez muscular transitória e movimentos involuntários, sendo estas respostas dependentes da dose e tempo de tratamento utilizado. Muita atenção tem sido dada ao efeito biológico da guanosina. Ainda que não tenha sido completamente caracterizado um possível receptor específico para a guanosina, são notáveis as evidências que demonstram os efeitos neuroprotetores deste nucleosídeo endógeno. Neste estudo foi avaliado o potencial terapêutico da guanosina em camundongos tratados com reserpina (1 mg/kg, duas administrações subcutânea em dias alternados). A guanosina (7,5 mg/kg) administrada oralmente reverteu o aumento de discinesias orofaciais induzidas pela reserpina. Além disto, o efeito antidiscinético da guanosina foi abolido com a prévia administração do antagonista do receptor de adenosina A1, o 8-Ciclopentil-1,3-dipropilxantina (DPCPX, 0,75 mg/kg). O teste da barra evidenciou um estado cataléptico nos camundongos após o tratamento com reserpina. Este efeito foi revertido pela administração da guanosina ou de DPCPX. Porém, quando administrado antes da guanosina, o DPCPX abole o efeito da guanosina. Como o mesmo protocolo de tratamento, a reserpina também induziu em fatias do estriado um aumento do dano celular, mostrado pela incorporação da sonda iodeto de propídeo (IP) e um aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs) revelado pela sonda (H2DCFH-DA). Essas alterações não foram vistas no córtex cerebral nem no hipocampo. A administração de guanosina foi efetiva em diminuir o aumento das EROs, porém sem efeito no dano celular. A avaliação do potencial de membrana mitocondrial pela sonda TMRE não evidenciou alteração em fatias de córtex cerebral, hipocampo e estriado. Com o presente estudo, demonstramos o efeito antidiscinético da guanosina e a modulação dos distúrbios motores e neuroquímicos relacionados à DP.<br> / Abstract : Dyskinesias are characterized as several involuntary movements, which can affect several body parts. Many neurological disorders can exhibit this symptom, as Parkinson?s Disease (PD). Dyskinesias can be induced by administration of various classes of drugs including reserpine. Reserpine is an alkaloid isolated from Rauwolfia serpentina plant roots and acts as an inhibitor of vesicular monoamine - dopamine, norepinephrine, epinephrine and serotonin - transporter (VMAT-2) in the central nervous system. Reserpine leads to depletion of these neurotransmitters, and consequently, induces hypolocomotion, muscle rigidity and involuntary movements. Guanosine, an endogenous nucleoside, has been highlighted due to its biological effect, mainly as a neuroprotective agent, although its exact mechanisms of action has not been fully characterized. This study evaluated the therapeutic potential of guanosine in reserpinized mice. Guanosine (7.5 mg / kg) administered orally prevented the increase of orofacial dyskinesia induced by reserpine. Additionally, the antidyskinetic effect of guanosine was abolished by prior administration of the A1 adenosine receptor antagonist, 8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine (DPCPX, 0,75 mg/kg). The bar test showed a cataleptic state of mice after treatment with reserpine. This behavior was prevented by acute administration of guanosine. Interestingly, DPCPX also prevented this effect, however DPCPX also abolished the anti-cataleptic effect of guanosine. Reserpine also induced increased cell damage, shown by incorporation of the propidium iodide (PI) probe and increased reactive oxygen species (ROS), in the striatum. These changes were not seen in the cerebral cortex or the hippocampus. Guanosine was effective in reducing the increase in ROS, but did not alter cell damage induced by reserpine in the striatum. Assessment of mitochondrial membrane potential showed no changes in any analyzed brain structure. This study demonstrated the antidyskinetic effect of guanosine and its possible modulation of motor and neurochemical impairments related to Parkinson´s disease.

Várias evidências indicam que os derivados da guanina (nucleotídeos GTP, GDP, GMP e o nucleosídeo guanosina) são capazes, além de atuarem intracelularmente, de atuarem do lado externo da membrana plasmática celular, exercendo efeitos neuromoduladores no sistema nervoso central. Funções tróficas, mitóticas e até antiapoptóticas nas diferentes células neurais já foram descritas para alguns dos derivados, mas são os efeitos relacionados ao antagonismo do sistema glutamatérgico que parecem indicar um grande potencial terapêutico para os derivados da guanina. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico em ratos e camundongos. Tanto o aumento provocado na captação de glutamato, como o efeito anticonvulsivante parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Nesta dissertação, demonstramos que o GMP administrado tanto sistemicamente, como centralmente é capaz de exercer um efeito amnésico em camundongos na tarefa da esquiva inibitória. Como na ação anticonvulsivante e, sobre a modulação da captação de glutamato, a guanosina parece ser a real efetora do efeito amnésico apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de um inibidor da conversão de GMP para guanosina leva à inibição do seu efeito. Ainda, essa conversão do GMP a guanosina parece ser realizada tanto sistemicamente como centralmente em camundongos. Desta forma, a administração de GMP parece ser uma efetiva estratégia para aumentar os níveis de GUO em futuros estudos sobre as possíveis ações terapêuticas da GUO. / Several evidences report that guanine based purines (nucleotides GTP, GDP, GMP and guanosine nucleoside) acts , besides intracellularly, at the outside of plasmatic membrana, exerting neuromodulatory roles in central nervous system. Trophic, mitotic and even antiapoptotic functions in different neural cells have been described to some of the guanine based purines, however the effects in relation to the glutamatergic system seem to indicate an important therapeutic potential for guanine based purines. The guanine based purines, mainly guanosine, are able to stimulate the glutamate uptake in astrocyte culture and brain tissue slices. They act as anticonvulsant by different vias of administration, and also display an amnesic effect in rats and mice. Both the stimulatory upon the glutamate uptake, and the anticonvulsant effects seem to be specifically to guanosine, given that the nucleotides has to be hydrolyzed to display these effects. In this study, we showed that both a systemic or a centrally administration of GMP is able to display an amnesic effect at the inhibitory avoidance task in mice. Like the anticonvulsant and stimulatory upon glutamate uptake effects, the guanosine seems to be the real agent for the amnesic effect displayed by GMP, since when an inhibitor of the conversion of GMP to guanosine is used before the centrally nucleotide administration, the amnesic effect is not observed. In addition, the conversion of GMP to guanosine seems to occur both systemically and centrally in mice. the action of ecto- 5V-nucleotidase. Therefore, administration of GMP may also be an effective strategy to increase GUO levels in future studies of possible therapeutic actions of GUO.

A isquemia cerebral é a terceira maior causa de morte em países industrializados, sendo a maior causa de morbidade e mortalidade em indivíduos de meia idade e idosos. A redução do suprimento de glicose e oxigênio ao cérebro, o que ocorre na isquemia, leva a uma complexa cascata de eventos celulares, resultando em degeneração neuronal e, conseqüentemente, na perda das funções cerebrais. Altas concentrações extracelulares de glutamato ocorrem em decorrência a um episódio isquêmico devido ao bloqueio da captação de glutamato, assim como ao aumento na sua liberação e a uma reversão de seus transportadores. A manutenção de seus níveis abaixo dos neurotóxicos é realizada por transportadores de alta afinidade dependentes de sódio, principalmente nos astrócitos. Modelos de isquemia in vitro e in vivo foram utilizados nos trabalhos que compõem esta tese. No primeiro capítulo, usamos um modelo de privação de oxigênio e glicose (POG) em fatias de hipocampo de ratos jovens e adultos. A POG diminuiu a captação de glutamato em todos os tempos de reperfusão estudados em ambas as idades, sendo essa diminuição menos pronunciada em animais jovens. Fatias de hipocampo de animais adultos parecem ser mais resistentes ao insulto que as provenientes de animais jovens, visto que o dano celular se dá primeiramente nestes. A guanosina (GUO) foi capaz de evitar a queda da captação somente em animais jovens 3hs após a POG e também foi capaz de reduzir o dano celular em ambas as idades. A padronização da metodologia da captação de glutamato em cultura organotípica de fatias de hipocampo foi montada a fim de estudar alterações neste parâmetro após a POG. Nesse modelo, há um aumento da captação após 1h de reperfusão e uma queda após 24hs. A morte celular medida, pela incorporação de iodeto de propídio, foi significativa a partir das 13hs e há uma queda nos níveis de GLT-1 24hs pós-POG. A GUO protegeu parcialmente a morte induzida pela POG, mas não foi capaz de reverter a queda da captação de glutamato 24hs pós-insulto. O modelo in vivo de isquemia utilizado foi a hipóxia-isquemia (HI) neonatal. Houve um aumento da captação de glutamato 24hs pós-insulto no hemisfério ipsilateral e uma queda significativa 72hs após nos dois hemisférios. Alterações de GFAP e S100B foram analisadas. Houve um aumento dos níveis de GFAP dependente de idade nos três tempos estudados e nas duas estruturas. Nos animais submetidos à HI, o aumento de GFAP foi significativamente maior no hemisfério ipsilateral e esse foi diferente de seu respectivo controle 48 e 72hs após o insulto. Houve um aumento nos níveis de S100B dependente de idade no córtex, sem diferença entre o grupo controle e o HI. No hipocampo ipsilateral, observamos um aumento de S100B dependente de tempo no grupo HI e HI-GUO, mas somente o grupo HI-GUO foi diferente de seu controle 48 e 72hs após o insulto. A GUO não teve nenhum efeito sobre a captação de glutamato em córtex, sobre os níveis de GFAP em ambas as estruturas e sobre a S100B em córtex. O APDC, um potente agonista de receptor metabotrópico de grupo II, foi testado no modelo in vitro de POG com fatias de hipocampo. Ele foi capaz de evitar, parcialmente, a queda da captação de glutamato e esse efeito foi inibido por APICA, um antagonista de grupo II. Esses dados são preliminares e necessitam de maiores estudos. Podemos concluir que quando se usam diferentes modelos experimentais, tanto in vitro quanto in vivo, estes podem nos fornecer dados distintos sobre um mesmo parâmetro ou uma mesma droga em estudo e, mesmo assim, são importantes, pois cada modelo pode representar uma situação completamente diferente da outra. / Cerebral ischemia is the third leading cause of death in the industrialized countries being the major cause of morbidity and mortality in middle and later life. The reduction in the supply of glucose and oxygen to the brain that occurs in cerebral ischemia leads to a complex cascade of cellular events, resulting in neuronal degeneration and, consequently, in loss of brain functions. It has been shown that stroke and ischemia increase the extracellular glutamate levels due to impairment of glutamate uptake, as well as an increase in glutamate release and reversal of glutamate transporters. The maintenance of extracellular glutamate below neurotoxic levels is an essential role for glial cells and this is achieved through high affinity sodium-dependent glutamate transporters present mainly in astrocytes. Ischemic models in vitro and in vivo were used in this work. In the first chapter, we used a model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in hippocampal slices of young and adult rats. OGD decreased glutamate uptake in all reperfusion times and in both ages studied, being this decrease less pronounced in young rats. Hippocampal slices of adult animals seemed to be more resistant to OGD than youngs, since cell damage was first seen in young. Guanosine (GUO) was able to avoid the decrease in glutamate uptake only in young animals 3h after OGD e also to reduce cell damage in both ages. To study glutamate uptake alterations after OGD in organotypic culture of hippocampal slices, we first standardized this method. There is an increase in glutamate uptake after 1h of reperfusion and a decrease 24h later. Cell death was measured by propidium iodide incorporation and it was significative increased from 13h. There is a decrease in GLT1 levels 24h after OGD. GUO was able in partially protect cells from death, but not able in recovering glutamate uptake decrease 24h after the insult. Neonatal hypoxia-ischemia (HI) was the in vivo model used here. There was an increase in glutamate uptake 24h after the insult in the ipsilateral hemisphere and a decrease 72h later in both hemispheres. GFAP and S100B alterations were also analyzed. There was an increase in GFAP levels dependent of age in all times studied and in both structures. In the HI group, the increase of GFAP was significatively higher in the ipsilateral hemisphere and this was different from its control 48 and 72h after the insult. There was an increase in S100B levels dependent of age in cortex, without difference between control and HI group. In the ipsilateral hippocampus, there was an increase of S100B dependent of time in HI and HI-GUO group, but only HI-GUO was different from its control 48 and 72h after the insult. GUO had no effect over glutamate uptake in cortex, GFAP levels in both structures, and S100B in córtex. APDC, a potent agonist of methabotropic receptors of grup II, was tested in the same OGD model used in the first chapter. APDC was able in partially avoid glutamate decrease induced by OGD in hippocampal slices, and this effect was abolished by APICA, a group II antagonist. These results are preliminary and deserve more study. We could conclude that when different experimental models are used, as in vitro or in vivo, these could give us distinct date about the same parameter or about the same drug in study, and even that happens, they are very important since each model might represent a complete different situation.

A encefalopatia hepática é uma disfunção cerebral causada por insuficiência hepática que se manifesta através de um amplo espectro de anormalidades neurológicas e psiquiátricas, variando de alterações subclínicas à coma. Sua base fisiopatológica é complexa, envolvendo principalmente o aumento de amônia, glutamato, glutamina, estresse oxidativo e alteração no metabolismo cerebral. O nucleosídeo guanosina apresenta propriedades neuroprotetoras frente à excitotoxicidade glutamatérgica, estresse oxidativo e convulsão, tendo um potencial papel neuroprotetor em encefalopatia hepática e hiperamonemia. Nesta tese, apresentamos dois modelos experimentais. No primeiro, induzimos encefalopatia através da administração de acetato de amônia por via intraperitoneal em ratos. O grupo tratamento recebeu guanosina 20 minutos antes de receber acetato de amônia. Analisamos alterações hepáticas e sistêmicas, letalidade, análises neurológicas (normal, pré-coma, coma e morte) e eletroencefalográficas, níveis liquóricos de glutamato, glutamina, alanina e amônia, marcadores de estresse oxidativo no sistema nervoso central, captação de glutamato cortical, e atividade e imunoconteúdo cortical da enzima glutamina sintetase. A guanosina drasticamente reduziu a taxa de letalidade (50%) e duração de coma (30%). Outros desfechos foram melhora no traçado eletroencefalográfico, normalização de níveis liquóricos de glutamato, normalização na captação de glutamato e manutenção dos níveis normais de estresse oxidativo no sistema nervoso central. No segundo modelo, induzimos encefalopatia hepática em ratos através de hepatectomia subtotal (92%). Tivemos como objetivos aprofundar o conhecimento nos mecanismos da encefalopatia hepática e consequentes alterações no metabolismo cerebral. Avaliamos letalidade cirúrgica, alterações hepáticas e sistêmicas, atividade comportamental em teste de campo aberto, análise eletroencefalográfica, níveis liquóricos de aminoácidos, imunoconteúdo de transportadores glutamatérgicos, marcadores de estresse oxidativo, atividade das enzimas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos e oxidação de glutamato, além de glutamina e glicose no sistema nervoso central. A cirurgia de hepatectomia subtotal provocou profundas alterações na análise eletroencefalográficas e no perfil comportamental dos animais, que apresentaram diminuição da locomoção. Também, houve alterações no metabolismo cerebral e em marcadores de estresse oxidativo compatíveis com aumento de proteólise cerebral (aumento de glutamina, glutamato e aminoácidos de cadeia ramificada), aumento de glicólise, aumento na oxidação cerebral de glutamato e diminuição na oxidação de glicose e lactato. Com dois modelos complementares, correlacionamos alterações neuroquímicas, metabólicas, eletroencefalográficas e comportamentais, aprofundando-nos na fisiopatologia da EH. Esta tese traz novas evidências para a utilização do nucleosídeo guanosina em tratamento de hiperamonemia e encefalopatia hepática. / Hepatic encephalopathy is a brain dysfunction caused by liver failure that manifests itself through a broad spectrum of neurological and psychiatric abnormalities, ranging from subclinical symptoms to coma. Its pathophysiological basis is complex, involving mainly the increase of ammonia, glutamate, glutamine, oxidative stress and alteration in cerebral metabolism. The nucleoside guanosine has neuroprotective properties against glutamatergic excitotoxicity, oxidative stress and convulsion, and has a potential neuroprotective role in hepatic encephalopathy and hyperammonemia. In this thesis, we present two experimental models. In the first, we induced encephalopathy through the administration of ammonia acetate intraperitoneally in rats. The treatment group received guanosine 20 minutes before receiving ammonia acetate. We analyzed hepatic and systemic changes, lethality, neurological scale (normal, pre-coma, coma and death) and electroencephalographic analyzes, cerebrospinal fluid level of glutamate, glutamine, alanine and ammonia, oxidative stress markers in the central nervous system, cortical glutamate uptake and, finally, activity and immunocontent of the enzyme glutamine synthetase. Guanosine dramatically reduced lethality rate (50%) and coma duration (30%). Other outcomes were: improvement in electroencephalographic tracing, normalization of glutamate levels, normalization of glutamate uptake and maintenance of normal levels of oxidative stress in the central nervous system. In the second model, we induced hepatic encephalopathy in rats through subtotal hepatectomy (92%). We aimed to better understand the mechanisms of hepatic encephalopathy and consequent alterations in cerebral metabolism. We evaluated surgical lethality, hepatic and systemic alterations, behavioralal activity in the open field test, electroencephalographic analysis, cerebrospinal fluid levels, immunocontent of glutamatergic transporters, oxidative stress markers, activity of tricarboxylic acid cycle enzymes and glutamate, glucose and lactate oxidation. Subtotal hepatectomy surgery caused profound alterations in the electroencephalographic analysis and in the behavioral profile of the animals, which showed a decrease in locomotion. Also, there were alterations in cerebral metabolism and markers of oxidative stress compatible with increased cerebral proteolysis (increase of glutamine, glutamate and branched-chain amino acids), increased glycolysis, increased cerebral oxidation of glutamate, and decreased glucose and lactate oxidation . With two complementary models, we correlate neurochemical, metabolic, electroencephalographic and behavioral changes, beeter comprehensing the physiopathology of hepatic encephalopathy. This thesis brings new evidence for the use of the nucleoside guanosine in the treatment of hyperammonemia and hepatic encephalopathy.

A isquemia cerebral é uma das principais causas de morte no mundo, sendo decorrente de uma interrupção transitória ou permanente do fluxo sanguíneo, podendo levar à massiva morte neuronal. Um dos eventos neurotóxicos relacionados à isquemia é o aumento excessivo da concentração de glutamato extracelular, o que leva a hiperestimulação do sistema glutamatérgico (excitotoxicidade) podendo assim desencadear uma cascata de eventos intracelulares nos neurônios culminando em sua morte. Nos últimos anos, o nucleosídeo guanosina tem ganhado atenção dos pesquisadores devido ao seu potencial efeito neuroprotetor frente a insultos envolvendo excitotoxicidade. Na maioria dos experimentos in vivo no qual foram observados efeitos neuroprotetores, a guanosina foi administrada sistemicamente, apresentando considerável variabilidade na magnitude de seus efeitos entre os animais. Dado que a guanosina é uma molécula endógena, podendo ser rapidamente metabolizada via sistêmica até alcançar o cérebro, novas vias de administração devem ser exploradas a fim de maximizar seus efeitos neuroprotetores. A administração pela via intranasal tem se mostrado uma excelente alternativa visto que a boa perfusão da mucosa nasal fornece um excelente local para uma rápida absorção de drogas e transporte para o cérebro via líquido cefalorraquidiano (liquor). Neste sentido, nesta dissertação avaliamos o perfil farmacocinético da administração intranasal de guanosina e seu potencial neuroprotetor em um modelo de isquemia do córtex parietal cerebral por termocoagulação em ratos. Desta maneira, investigamos a concentração de guanosina e seus metabólitos em diferentes estruturas cerebrais, além do liquor e plasma após administração de diferentes doses, volumes de injeção e tempos após injeção intranasal de guanosina pelos métodos de CLAE e de quantificação de radioatividade. Houve diferenças significativas na concentração de purinas presentes nas estruturas analisadas (bulbo, córtex e hipocampo) além do liquor e do plasma. Observamos uma proporcionalidade entre o aumento significativo de radioatividade em relação ao aumento da concentração e do volume. Além disso, comparamos os parâmetros, acima citados, de animais que receberam administração de guanosina pela via intranasal ou intraperitoneal ou não receberam guanosina, apresentando diferenças significativas entre os grupos analisados. A indução isquêmica causou prejuízo sensoriomotor e lesão cerebral nos animais, os quais foram revertidos pelo tratamento com guanosina. Além disso, diferenças significativas na concentração das purinas foram observadas no plasma e no liquor desses animais as quais podem estar envolvidas tanto com o dano nos animais isquêmicos quanto com o efeito neuroprotetor da guanosina. Assim, este trabalho é o pioneiro mostrando a viabilidade da administração intranasal de guanosina, além de reforçar o efeito neuroprotetor da mesma frente a um modelo de isquemia. / Cerebral ischemia is a major cause of death worldwide is caused by a transient or permanent interruption of blood flow and can lead to massive neuronal death. One of neurotoxic events related to ischemia is the excessive increase in the extracellular concentration of glutamate, which leads to hyperstimulation of the glutamatergic system (excitotoxicity) thus triggering a cascade of intracellular events culminating in neurons death. In recent years, the guanosine nucleoside has claimed researchers attention because of its potential neuroprotective effect against insults involving excitotoxicity. In most in vivo experiments in which guanosine presented neuroprotective effects, it was administered systemically, resulting in considerable variability in the magnitude of their effects. Since guanosine is an endogenous molecule being rapidly metabolized systemically before to reach the brain, new routes of administration should be explored in order to maximize their neuroprotective effects. The intranasal route has proven to be an excellent alternative because the good perfusion of the nasal mucosa provides a great via for a quick absorption for drug transport to the brain via cerebrospinal fluid (CSF). In this sense, this thesis evaluated the pharmacokinetic profile of intranasal administration of guanosine and its potential neuroprotective in a model of cerebral ischemia in parietal cortex by thermocoagulation in rats. Thus, we investigated the concentration of guanosine and its metabolites in different brain structures, as well as CSF and plasma after administration of different doses, injection volumes and times after intranasal injection of guanosine by HPLC methods and quantification of radioactivity. There were significant differences in the concentration of purines present in the analyzed structures (cerebral bulb, cortex and hippocampus) plus CSF and plasma. We observed proportionality between the significant increase of radioactivity in relation to the increased concentration and volume. Furthermore, we analyzed these parameters in the plasma and CSF of rats which received intranasally or intraperitoneally injection of guanosine and with those that did not receive it, showing significant differences between these groups. The ischemic induction caused sensorimotor deficit and brain injury, which were reversed by guanosine treatment. Moreover, significant differences in the concentration of purines were observed in plasma and CSF of the animals which can be related with both the ischemic damage as well as with the neuroprotective effect of guanosine. In conclusion, this work is the pioneer showing the viability of intranasal administration of guanosine, in addition to reinforcing the potential neuroprotective effect of guanosine.

A isquemia cerebral é uma doença grave, sendo a segunda causa mais comum de morte e a principal causa de incapacidade em todo o mundo. A redução repentina do fluxo sanguíneo cerebral leva à diminuição do fornecimento de oxigênio e de glicose, resultando em uma falha no metabolismo energético cerebral. Este desequilíbrio no metabolismo energético é claramente o elemento chave no processo isquêmico, resultando em danos celulares e comprometimento das funções neurológicas. A excitotoxicidade glutamatérgica, o estresse oxidativo e processo inflamatório desempenham papéis importantes na lesão cerebral isquêmica, levando a danos teciduais que comprometem a integridade do tecido durante a isquemia. A guanosina e a inosina são conhecidas por desempenhar um papel neuroproteção ao sistema nervoso central, agindo como um modulador negativo do sistema glutamatérgico e possuindo efeitos tróficos em células neurais. Desta forma, nesta tese, avaliaram-se diversos mecanismos que são modulados pela guanosina e inosina em modelos experimentais de isquemia cerebral in vivo. Inicialmente, demonstrou-se que a guanosina é efetiva na neuroproteção contra a isquemia cerebral focal em ratos, causando redução de danos neuronais e astrogliais, diminuindo a peroxidação lipídica e o volume de enfarte cerebral e, consequentemente, recuperando a função motora do membro anterior debilitado pela isquemia. Esta neuroproteção estaria envolvida na manutenção do ambiente redox celular, na modulação da resposta inflamatória e na modulação do sistema glutamatérgico, mecanismos ligados à lesão isquêmica. A isquemia cerebral causou um aumento do número total de células micróglias e também uma maior ativação destas células, efeito inibido pela administração de guanosina. Nesta tese, também investigamos os efeitos agudos relacionados à neuroproteção da administração de guanosina e de inosina como reposição volêmica em um modelo de choque hemorrágico (que, potencialmente, diminui a perfusão sanguínea cerebral) em suínos. A guanosina e a inosina foram capazes de diminuir os níveis de glutamato mais rapidamente do que o controle e de modular o ambiente de citocinas pró-inflamatórias, diminuindo os níveis de IL-1β e TNF-α (apenas inosina) após choque hemorrágico. Esta supressão pode estar associada com diminuição na morte neuronal tardia, o que implicaria em uma melhora no prejuízo cognitivo que ocorre choque hemorrágico. No geral, nosso trabalho representa uma importante contribuição para o conhecimento sobre os possíveis mecanismos neuroprotetores da guanosina e da inosina em modelos de isquemia cerebral. / Cerebral ischemia is a devastating disease, being the second most common cause of death and the major cause of disability worldwide. The sudden reduction in cerebral blood flow leads to decreased oxygen and glucose supplies, resulting in a failure of cellular bioenergetics. Disruption of brain energetics metabolism is clearly a key element in stroke, resulting in cellular damage and impairment of neurological functions. Glutamate excitotoxicity, oxidative stress and neuroinflammation play important roles in ischemic brain injury, with harmful impacts on ischemic cerebral tissue. As guanosine and inosine play an important neuroprotective role in the central nervous system, exerting glutamatergic system antagonism and trophic effects on neural cells, in this study, it was evaluated the neuroprotective effects of guanosine and inosine against in vivo cerebral ischemia models. Initially, we demonstrated that guanosine was neuroprotective against cerebral focal ischemia in rats causing reduction of neuronal and astroglial damage, decreasing lipid peroxidation and cerebral infarct volume, and consequently recovery in the function of impaired forelimb. These neuroprotection could be involved in the maintenance of the cellular redox environment, modulating the inflammatory response and the glutamatergic systems. Furthermore, ischemia increased the total number of microglial cells, and changed the morphological characteristics. These effects were inhibited by guanosine treatment. Additionally, it was also investigated the acute neuroprotective effects of guanosine and inosine as a fluid resuscitation in a model of hemorrhagic shock in swines. The treatment with guanosine or inosine was able to decrease glutamate levels faster than control group and also was able to modulate the proinflammatory cytokines environment, decreasing IL-1β and TNF-α (only inosine) levels after hemorrhagic shock. These effects could be associated with reduction delayed neuronal cell damage, improving cognitive impairment that occurs in hemorrhagic shock. Overall, our work represents an important contribution to the knowledge regarding the putative neuroprotective mechanisms of guanosine and inosine in cerebral ischemia models.

Os transtornos de ansiedade estão entre os mais prevalentes de todos os transtornos mentais no mundo. Estão associados a sofrimento subjetivo e prejuízo na qualidade de vida dos pacientes. Porém os mecanismos fisiopatológicos da ansiedade ainda necessitam de muita investigação. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a administração sistêmica de GMP é capaz de induzir um efeito típico ansiolítico em ratos, contudo, o mecanismo de ação deste efeito ainda não foi esclarecido. Assim, no presente estudo buscamos investigar os mecanismos envolvidos no efeito ansiolítico do GMP, além de avaliar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO), e explorar o envolvimento do sistema adenosinérgico e glutamatérgico nos efeitos observados. Nossos resultados evidenciam que o GMP é capaz de promover efeito típico ansiolítico quando a administração é central, aumentar os níveis de GUO e adenosina (ADO) no liquor quando sua administração é intraperitoneal (i.p.). Ainda, observamos que a administração i.p. de GUO possui efeito típico ansiolítico, aumentando apenas os níveis de ADO no liquor. Com isso, demonstramos que a administração de GUO foi capaz de diminuir os níveis de glutamato no liquor, sem alterar a captação de glutamato em regiões do cérebro relacionadas com a ansiedade. Por fim, mostramos que o pré-tratamento com cafeína foi capaz de abolir o efeito ansiolítico da GUO e parcialmente bloquear a diminuição dos níveis de glutamato no liquor. Como conclusão, este estudo fornece novas evidências sobre o mecanismo de ação do GMP e da GUO, e mostra que o efeito ansiolítico pode estar relacionado com a modulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / Anxiety disorders represent the most common worldwide psychiatric diseases but nowadays there is no satisfactory strategy to their treatment without severe adverse effects. Recently, we demonstrated that a systemic administration of GMP induces anxiolytic-like effect in rats but its mechanism of action remains unclear. In the present study we aimed to investigate the mechanisms insights into how GMP induces anxiolytic-like effects and further explored the anxiolytic potential of guanosine (GUO) and the involvement of the adenosinergic and glutamatergic system on those effects. Our results showed that GMP induces anxiolytic-like behaviors centrally and increases cerebrospinal fluid (CSF) CSF GUO and adenosine (ADO) levels 60 min after a systemic administration. Furthermore, systemic administration of GUO produced anxiolytic-like behaviors but enhance only CSF ADO level 60 min after administration. In addition, GUO treatment decreased CSF glutamate level but did not change glutamate uptake in brain regions related to anxiety. Moreover, the pre administration of CAF abolished GUO anxiolytic-like effects and partially blocked GUO effects on CSF glutamate level. In summary, the present work presents the anxyolitic effects of GMP and GUO and provides new evidence that these effects seem to be related to the modulation of adenosinergic and glutamatergic systems.

Os transtornos de ansiedade estão entre os mais prevalentes de todos os transtornos mentais no mundo. Estão associados a sofrimento subjetivo e prejuízo na qualidade de vida dos pacientes. Porém os mecanismos fisiopatológicos da ansiedade ainda necessitam de muita investigação. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a administração sistêmica de GMP é capaz de induzir um efeito típico ansiolítico em ratos, contudo, o mecanismo de ação deste efeito ainda não foi esclarecido. Assim, no presente estudo buscamos investigar os mecanismos envolvidos no efeito ansiolítico do GMP, além de avaliar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO), e explorar o envolvimento do sistema adenosinérgico e glutamatérgico nos efeitos observados. Nossos resultados evidenciam que o GMP é capaz de promover efeito típico ansiolítico quando a administração é central, aumentar os níveis de GUO e adenosina (ADO) no liquor quando sua administração é intraperitoneal (i.p.). Ainda, observamos que a administração i.p. de GUO possui efeito típico ansiolítico, aumentando apenas os níveis de ADO no liquor. Com isso, demonstramos que a administração de GUO foi capaz de diminuir os níveis de glutamato no liquor, sem alterar a captação de glutamato em regiões do cérebro relacionadas com a ansiedade. Por fim, mostramos que o pré-tratamento com cafeína foi capaz de abolir o efeito ansiolítico da GUO e parcialmente bloquear a diminuição dos níveis de glutamato no liquor. Como conclusão, este estudo fornece novas evidências sobre o mecanismo de ação do GMP e da GUO, e mostra que o efeito ansiolítico pode estar relacionado com a modulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / Anxiety disorders represent the most common worldwide psychiatric diseases but nowadays there is no satisfactory strategy to their treatment without severe adverse effects. Recently, we demonstrated that a systemic administration of GMP induces anxiolytic-like effect in rats but its mechanism of action remains unclear. In the present study we aimed to investigate the mechanisms insights into how GMP induces anxiolytic-like effects and further explored the anxiolytic potential of guanosine (GUO) and the involvement of the adenosinergic and glutamatergic system on those effects. Our results showed that GMP induces anxiolytic-like behaviors centrally and increases cerebrospinal fluid (CSF) CSF GUO and adenosine (ADO) levels 60 min after a systemic administration. Furthermore, systemic administration of GUO produced anxiolytic-like behaviors but enhance only CSF ADO level 60 min after administration. In addition, GUO treatment decreased CSF glutamate level but did not change glutamate uptake in brain regions related to anxiety. Moreover, the pre administration of CAF abolished GUO anxiolytic-like effects and partially blocked GUO effects on CSF glutamate level. In summary, the present work presents the anxyolitic effects of GMP and GUO and provides new evidence that these effects seem to be related to the modulation of adenosinergic and glutamatergic systems.

Várias evidências indicam que os derivados da guanina (nucleotídeos GTP, GDP, GMP e o nucleosídeo guanosina) são capazes, além de atuarem intracelularmente, de atuarem do lado externo da membrana plasmática celular, exercendo efeitos neuromoduladores no sistema nervoso central. Funções tróficas, mitóticas e até antiapoptóticas nas diferentes células neurais já foram descritas para alguns dos derivados, mas são os efeitos relacionados ao antagonismo do sistema glutamatérgico que parecem indicar um grande potencial terapêutico para os derivados da guanina. Os derivados da guanina, especialmente a guanosina, são capazes de estimular a captação de glutamato em cultura de células astrocitárias e em fatias de tecido cerebral. Atuam como anticonvulsivantes pelas mais diversas vias de administração, e ainda possuem efeito amnésico em ratos e camundongos. Tanto o aumento provocado na captação de glutamato, como o efeito anticonvulsivante parece ser realizado especificamente pela guanosina, uma vez que os nucleotídeos necessitam ser hidrolisados para exercerem tais efeitos. Nesta dissertação, demonstramos que o GMP administrado tanto sistemicamente, como centralmente é capaz de exercer um efeito amnésico em camundongos na tarefa da esquiva inibitória. Como na ação anticonvulsivante e, sobre a modulação da captação de glutamato, a guanosina parece ser a real efetora do efeito amnésico apresentado pelo GMP, uma vez que o uso de um inibidor da conversão de GMP para guanosina leva à inibição do seu efeito. Ainda, essa conversão do GMP a guanosina parece ser realizada tanto sistemicamente como centralmente em camundongos. Desta forma, a administração de GMP parece ser uma efetiva estratégia para aumentar os níveis de GUO em futuros estudos sobre as possíveis ações terapêuticas da GUO. / Several evidences report that guanine based purines (nucleotides GTP, GDP, GMP and guanosine nucleoside) acts , besides intracellularly, at the outside of plasmatic membrana, exerting neuromodulatory roles in central nervous system. Trophic, mitotic and even antiapoptotic functions in different neural cells have been described to some of the guanine based purines, however the effects in relation to the glutamatergic system seem to indicate an important therapeutic potential for guanine based purines. The guanine based purines, mainly guanosine, are able to stimulate the glutamate uptake in astrocyte culture and brain tissue slices. They act as anticonvulsant by different vias of administration, and also display an amnesic effect in rats and mice. Both the stimulatory upon the glutamate uptake, and the anticonvulsant effects seem to be specifically to guanosine, given that the nucleotides has to be hydrolyzed to display these effects. In this study, we showed that both a systemic or a centrally administration of GMP is able to display an amnesic effect at the inhibitory avoidance task in mice. Like the anticonvulsant and stimulatory upon glutamate uptake effects, the guanosine seems to be the real agent for the amnesic effect displayed by GMP, since when an inhibitor of the conversion of GMP to guanosine is used before the centrally nucleotide administration, the amnesic effect is not observed. In addition, the conversion of GMP to guanosine seems to occur both systemically and centrally in mice. the action of ecto- 5V-nucleotidase. Therefore, administration of GMP may also be an effective strategy to increase GUO levels in future studies of possible therapeutic actions of GUO.

A isquemia cerebral é a terceira maior causa de morte em países industrializados, sendo a maior causa de morbidade e mortalidade em indivíduos de meia idade e idosos. A redução do suprimento de glicose e oxigênio ao cérebro, o que ocorre na isquemia, leva a uma complexa cascata de eventos celulares, resultando em degeneração neuronal e, conseqüentemente, na perda das funções cerebrais. Altas concentrações extracelulares de glutamato ocorrem em decorrência a um episódio isquêmico devido ao bloqueio da captação de glutamato, assim como ao aumento na sua liberação e a uma reversão de seus transportadores. A manutenção de seus níveis abaixo dos neurotóxicos é realizada por transportadores de alta afinidade dependentes de sódio, principalmente nos astrócitos. Modelos de isquemia in vitro e in vivo foram utilizados nos trabalhos que compõem esta tese. No primeiro capítulo, usamos um modelo de privação de oxigênio e glicose (POG) em fatias de hipocampo de ratos jovens e adultos. A POG diminuiu a captação de glutamato em todos os tempos de reperfusão estudados em ambas as idades, sendo essa diminuição menos pronunciada em animais jovens. Fatias de hipocampo de animais adultos parecem ser mais resistentes ao insulto que as provenientes de animais jovens, visto que o dano celular se dá primeiramente nestes. A guanosina (GUO) foi capaz de evitar a queda da captação somente em animais jovens 3hs após a POG e também foi capaz de reduzir o dano celular em ambas as idades. A padronização da metodologia da captação de glutamato em cultura organotípica de fatias de hipocampo foi montada a fim de estudar alterações neste parâmetro após a POG. Nesse modelo, há um aumento da captação após 1h de reperfusão e uma queda após 24hs. A morte celular medida, pela incorporação de iodeto de propídio, foi significativa a partir das 13hs e há uma queda nos níveis de GLT-1 24hs pós-POG. A GUO protegeu parcialmente a morte induzida pela POG, mas não foi capaz de reverter a queda da captação de glutamato 24hs pós-insulto. O modelo in vivo de isquemia utilizado foi a hipóxia-isquemia (HI) neonatal. Houve um aumento da captação de glutamato 24hs pós-insulto no hemisfério ipsilateral e uma queda significativa 72hs após nos dois hemisférios. Alterações de GFAP e S100B foram analisadas. Houve um aumento dos níveis de GFAP dependente de idade nos três tempos estudados e nas duas estruturas. Nos animais submetidos à HI, o aumento de GFAP foi significativamente maior no hemisfério ipsilateral e esse foi diferente de seu respectivo controle 48 e 72hs após o insulto. Houve um aumento nos níveis de S100B dependente de idade no córtex, sem diferença entre o grupo controle e o HI. No hipocampo ipsilateral, observamos um aumento de S100B dependente de tempo no grupo HI e HI-GUO, mas somente o grupo HI-GUO foi diferente de seu controle 48 e 72hs após o insulto. A GUO não teve nenhum efeito sobre a captação de glutamato em córtex, sobre os níveis de GFAP em ambas as estruturas e sobre a S100B em córtex. O APDC, um potente agonista de receptor metabotrópico de grupo II, foi testado no modelo in vitro de POG com fatias de hipocampo. Ele foi capaz de evitar, parcialmente, a queda da captação de glutamato e esse efeito foi inibido por APICA, um antagonista de grupo II. Esses dados são preliminares e necessitam de maiores estudos. Podemos concluir que quando se usam diferentes modelos experimentais, tanto in vitro quanto in vivo, estes podem nos fornecer dados distintos sobre um mesmo parâmetro ou uma mesma droga em estudo e, mesmo assim, são importantes, pois cada modelo pode representar uma situação completamente diferente da outra. / Cerebral ischemia is the third leading cause of death in the industrialized countries being the major cause of morbidity and mortality in middle and later life. The reduction in the supply of glucose and oxygen to the brain that occurs in cerebral ischemia leads to a complex cascade of cellular events, resulting in neuronal degeneration and, consequently, in loss of brain functions. It has been shown that stroke and ischemia increase the extracellular glutamate levels due to impairment of glutamate uptake, as well as an increase in glutamate release and reversal of glutamate transporters. The maintenance of extracellular glutamate below neurotoxic levels is an essential role for glial cells and this is achieved through high affinity sodium-dependent glutamate transporters present mainly in astrocytes. Ischemic models in vitro and in vivo were used in this work. In the first chapter, we used a model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in hippocampal slices of young and adult rats. OGD decreased glutamate uptake in all reperfusion times and in both ages studied, being this decrease less pronounced in young rats. Hippocampal slices of adult animals seemed to be more resistant to OGD than youngs, since cell damage was first seen in young. Guanosine (GUO) was able to avoid the decrease in glutamate uptake only in young animals 3h after OGD e also to reduce cell damage in both ages. To study glutamate uptake alterations after OGD in organotypic culture of hippocampal slices, we first standardized this method. There is an increase in glutamate uptake after 1h of reperfusion and a decrease 24h later. Cell death was measured by propidium iodide incorporation and it was significative increased from 13h. There is a decrease in GLT1 levels 24h after OGD. GUO was able in partially protect cells from death, but not able in recovering glutamate uptake decrease 24h after the insult. Neonatal hypoxia-ischemia (HI) was the in vivo model used here. There was an increase in glutamate uptake 24h after the insult in the ipsilateral hemisphere and a decrease 72h later in both hemispheres. GFAP and S100B alterations were also analyzed. There was an increase in GFAP levels dependent of age in all times studied and in both structures. In the HI group, the increase of GFAP was significatively higher in the ipsilateral hemisphere and this was different from its control 48 and 72h after the insult. There was an increase in S100B levels dependent of age in cortex, without difference between control and HI group. In the ipsilateral hippocampus, there was an increase of S100B dependent of time in HI and HI-GUO group, but only HI-GUO was different from its control 48 and 72h after the insult. GUO had no effect over glutamate uptake in cortex, GFAP levels in both structures, and S100B in córtex. APDC, a potent agonist of methabotropic receptors of grup II, was tested in the same OGD model used in the first chapter. APDC was able in partially avoid glutamate decrease induced by OGD in hippocampal slices, and this effect was abolished by APICA, a group II antagonist. These results are preliminary and deserve more study. We could conclude that when different experimental models are used, as in vitro or in vivo, these could give us distinct date about the same parameter or about the same drug in study, and even that happens, they are very important since each model might represent a complete different situation.