Les quadruplexes de guanines (G4) sont des structures polymorphiques adoptées in vitro par les séquences d’ADN et d’ARN riches en guanines. L’utilisation d’anticorps et de ligands spécifiques des structures G4 a permis leur détection au niveau cellulaire. Des études computationnelles ont prédit des séquences possédant une signature G4 au niveau de régions génomiques capitales comme les télomères ou les promoteurs de certains oncogènes. De plus, de nombreuses protéines impliquées dans des processus cellulaires comme la réplication, la transcription ou encore la réparation, peuvent interagir directement avec des G4, en facilitant leur formation ou au contraire leur dénaturation. C’est notamment le cas d’hélicases impliquées dans des pathologies humaines, comme BLM, WRN, FANC J ou PIF1. Ce sont des enzymes capables de dénaturer des G4 et dont l'inactivation induit une instabilité génomique, en particulier au niveau de régions susceptibles de former un G4. Dans ce travail, nous présentons la mise au point d’un test de criblage à moyen débit pour le suivi des interactions G4/hélicases en temps réel. Ce test nous a permis de définir les conditions favorisant ou inhibant l’interaction d’une hélicase vis-à-vis de son substrat G4. Nous avons démontré que ces conditions pouvaient différer d’une hélicase à une autre, notamment les conditions salines optimales nécessaires aux activités hélicases de ScPif1 et de RHAU. Nous avons également prouvé, à travers ce test, que l’utilisation de ligands capables de stabiliser les G4 n’induisait pas forcément d’inhibition de l’activité hélicase de ScPif1. Enfin, nous avons également pu définir la directionnalité de la protéine RPA, ce qui fait de notre test une technique prometteuse pour la caractérisation de nouvelles protéines pouvant dérouler des structures G4. / G-quadruplexes are highly polymorphic non-canonical nucleic acid structures adopted by both DNA and RNA guanine-rich sequences in vitro. They have been detected at the cellular level using structure specific antibodies and small molecule ligands. Computational studies demonstrated that G4-prone sequences are located in key genomic regions such as telomeres and oncogene promoters. Numerous studies showed that G4 sequences can interact with proteins involved in cellular processes, including replication, transcription or reparation. Those interactions include binding, G4 folding promotion or in contrary unwinding. Indeed, WRN, BLM, FANC J or Pif1 are helicases associated with human-diseases. They can unwind G4 forming sequences; mutation of these helicases lead to genomic instability of G4-prone motifs when mutated. Here, we present a medium-throughput technique to monitor G4-helicase interactions in real time. We were able to determine both favourable and deleterious conditions for G4 unwinding by a given helicase. We show that these conditions differ from one helicase to another as exemplified with the optimal salt conditions required for both ScPif1 and RHAU activities. We also reveal that the G4 ligands that stabilize G4 structures do not necessarily induce an inhibition of their unwinding by ScPif1 helicase. Finally, we also prove that our assay is adapted to clear up RPA directionality, making it an attractive technique to screen for new proteins able to unwind G4 structures.

Le syndrome de Werner est caractérisé par un vieillissement prématuré. Au niveau cellulaire, nous observons une instabilité chromosomique importante et une sénescence accélérée comparé à des cellules normales. Le gène muté (WRN) responsable de ce syndrome code pour une protéine possédant un domaine exonuclease et hélicase à ADN impliqués dans la replication de l'ADN, la réparation et la transcription. Toutefois, nous ne savons toujours pas laquelle de ses fonctions est responsable du vieillissement prématuré. Nous pensons que l'identification de nouvelles protéines interagissant directement avec la protéine WRN pourrait nous donner des réponses. Des analyses par spectrométrie de masse sur 1'immunoprecipitation de la protéine WRN ont permis d'identifier la protéine ribosomale RPS3 et plusieurs autres comme nouveaux partenaires potentiels. Plusieurs approches biochimiques furent utilisées afin de confirmer l'interaction directe entre WRN et RPS3. Nous avons démontré que RPS3 interagit directement avec la protéine WRN in vitro. Des études additionnelles sont requises pour comprendre la fonction de ce complexe in vivo.

Les protéines Piwi sont exprimées dans les gonades (testicules et ovaires) des animaux où elles s'associent à des petits ARN nommés piRNAs (Piwi-interaction RNAs) et répriment les éléments transposables, défendant ainsi de l'intégrité du génome. En effet, les animaux knock-out pour les protéines Piwi montrent une perte de piRNAs et une activation des éléments transposables avec des conséquences catastrophiques: l'arrêt du développement des cellules germinales, due potentiellement à des dommages du génome qui entraîne l'infertilité. Le « Silencing » est réalisé soit par l'activité endonucléase guidée par les piRNAs de la protéine Piwi cytosolique ou par le recrutement de la machinerie de répression transcriptionelle sur les loci génomiques des cibles par Piwi nucléaire. La biogenèse des piRNAs peut être divisée en deux voies, une primaire et une secondaire. De longs ARN précurseurs simple-brin sont transformés en piRNAs matures de 25-30 nt qui sont chargés dans les protéines Piwi. Une fois chargée avec le piRNA, Piwi se lie aux transcrits de transposons ayant la séquence complémentaire et les clive en générant deux ARN, dont l'un peut être chargé dans une nouvelle protéine Piwi, produisant un piRNA secondaire. Des études génétiques ont identifié plusieurs facteurs protéiques essentiels à ce processus. Certain de ces facteurs sont des hélicases à ARN dont le rôle spécifique reste inconnu, principalement parce que ce sont des enzymes dynamiques et l'identification de leurs cibles et leurs partenaires protéiques avec des approches biochimiques standards est difficile.Dans la première partie de cette thèse nous décrivons comment l'introduction d'une mutation ponctuelle dans la boîte DEAD de l'hélicase à ARN Vasa (DEAD à DQAD) peut bloquer son activité in vivo et figer le complexe transitoire de biogenèse qui contient VASA et les deux protéines Piwi responsables de la biogenèse secondaire.La résolution de la structure de VASADQ en complexe avec l'ATP ou l'AMPPNP a révélé les détails moléculaires de cette inhibition et a expliqué le phénotype observé in vivo. VASADQ a un taux d'hydrolyse de l'ATP réduit, car après hydrolyse, le phosphate libre est bloqué à l'intérieur du site actif en raison d'une liaison hydrogène supplémentaire formée avec la Gln mutée. La réduction de l'hydrolyse de l'ATP se traduit par une faible liaison à l'ARN mesurée par des expériences biophysiques. L'introduction de la même mutation chez l'homologue murin de VASA (MVH) produit un phénotype de dominant négatif où MVHDQ est agglutinée sur le complexe RNP contenant les protéines Piwi et les piRNAs.Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons introduit la même mutation dans TDRD9, une autre hélicase à ARN impliquée dans la voie des piRNAs mais dont la fonction est inconnue. Nous avons d'abord exprimé, purifié TDRD9 et montré que la mutation dans son domaine hélicase DEVH à DQVH abolit complètement son activité ATPase sans impacter sur sa stabilité. Par la suite, nous avons généré une souris Knock-in et analysé son phénotype. Les souris Knock-in mâles sont stériles et présentent un blocage au début de la spermatogenèse qui est probablement une conséquence des dommages de l'ADN générés par l'activation des éléments transposables. Ces éléments, comme Line-1, présentent un défaut de méthylation à leur loci génomiques, mais qui ne semble pas être contrôlé par la voie piRNA dans le mutant, étant donné que les protéines Piwis sont correctement chargées avec les piRNAs dérivés de Line-1.Dans l'ensemble, nous avons étudié le rôle moléculaire de deux hélicases à ARN dans la voie des piRNAs, nous avons élucidé le rôle de VASA et nous montrons que l'activité ATPase de TDRD9 est essentielle pour la régulation des transposons au cours de la spermatogenèse de la souris. / PIWI proteins are expressed in the gonads (testis and ovary) of animals where they associate with PIWI-interacting RNAs (piRNAs) and silence transposable elements, defending the integrity of the genome. Indeed, animal knock-outs of Piwi proteins display a loss of piRNAs and activation of transposon sequences with catastrophic consequences: block in germ cell development potentially due to genome damage, resulting in infertility. Silencing is achieved either by piRNA-guided endonuclease activity of cytosolic Piwi protein or by recruitment of transcriptional repression machinery on target genomic loci by nuclear Piwi. Biogenesis of piRNAs can be divided in primary and secondary pathway. Primary pathway describes how long single-stranded RNA precursors are processed into mature 25-30 nt piRNAs and loaded into Piwi proteins. Piwi-loaded piRNAs bind and cleave complementary transposon transcripts generating two RNA products, one of which can be loaded into a new Piwi protein, generating a secondary piRNA. Different protein factors are essential in this process as identified by genetic studies. Few of these factors are putative RNA helicases but their specific role is unknown, mainly because RNA helicase are dynamic enzymes and identification of their targets and protein partners with standard biochemical approaches is challenging.In the first part of this thesis I describe how the introduction of a point mutation in the DEAD box of the RNA helicase Vasa (DEAD to DQAD) can block its activity in vivo and freeze a transient biogenesis complex that contains Vasa and the two Piwi proteins responsible for secondary biogenesis.Crystal structure of VASADQ in complex with ATP or AMPPNP revealed the molecular details of this inhibition and explained the phenotype observed in vivo. VasaDQ has a reduced ATP hydrolysis rate because after hydrolysis the free phosphate is blocked inside the active site due to an additional hydrogen bond formed with the mutated Gln. The reduction in ATP hydrolysis is mirrored by an impaired RNA binding activity as measured with biophysical experiments. Introduction of the same mutation in the mouse homologue of Vasa (MVH) has a dominant-negative phenotype where MVHDQ is clump on an ribonucleoprotein (RNP) complex containing piRNAs and mouse Piwi proteins.In the second part of this thesis I introduce the same mutation in TDRD9, another RNA helicase involved in piRNA pathway with an unknown function. First I expressed and purified TDRD9 and showed that DEVH to DQVH mutation in its helicase domain completely abolishes its ATPase activity but do not affects its stability. Next I created a knock-in mutation in the mouse genomic locus for Tdrd9 and analysed the resulting phenotype in the mutant. Knock-in mice are male sterile with an early block in spermatogenesis that is probably a consequence of uncontrolled DNA damages generated by de-repressed transposon elements. These elements, like Line-1, fail to be correctly methylated at their genomic loci in the Tdrd9 mutant. Although Tdrd9 is important for Line-1 transposon silencing, it is likely not via a role in piRNA biogenesis since Piwi proteins are correctly loaded with Line-1 derived piRNAs. Interestingly a drop in piRNAs that derives from SINE elements is observed in the mutant, probably reflecting a role for Tdrd9 in sorting primary transcripts into MILI and MIWI2 during DNA de novo methylation.Overall I investigated the molecular role of two RNA helicases in the piRNA pathway, elucidating the role of Vasa and show that the ATPase activity of Tdrd9 is essential for transposon regulation in mouse spermatogenesis.

Le phénobarbital (PB) induit fortement la transcription des gènes hépatiques CYP2Bl et CYP2B2 chez le rat. L'inductibilité de ces deux gènes est conférée par un « enhancer » transcriptionnel de 163 paires de bases situé en amont du point d'initiation de la transcription: l'unité de réponse au PB (PBRU). La PBRU contient trois sites de liaison pour des récepteurs nucléaires: NRl, NR2 et NR3. Le modèle actuel d’induction prévoit que suite à l'exposition au PB, le récepteur nucléaire CAR est déplacé du cytoplasme vers le noyau ou il active la transcription des CYP2B en se fixant sur les sites NR de la PBRU. Les résultats obtenus suggèrent qu'il n'y a pas de corrélation évidente entre la liaison de CAR sur NR3 in vitro et l'induction observée dans des hépatocytes de rat en culture primaire. D'autres protéines peuvent se lier aux sites NRI et NR3 dont certaines se fixent sous forme de monomères et leur participation possible dans l'induction a été étudiée. D'autres analyses ont mis en évidence que CYP2B2 est une cible transcriptionnelle de l'hélicase Werner (WRN). Le syndrome de Werner est une maladie cliniquement associée à un vieillissement prématuré. Le gène WRN code pour une hélicase de la famille RecQ qui participe à la réparation de l'ADN, à la réplication et à la maintenance des télomères. Certaines études ont suggéré que WRN participe à la transcription associée à l'ARN polymérase II (Pol II) sans toutefois en préciser le rôle. Les résultats montrent que WRN est recrutée sur le promoteur de CYP2B2 en réponse au traitement au PB. De plus, le niveau basal et induit de CYP2B 1 0 est diminué dans des souris qui portent une délétion du domaine hélicase de Wrn comparativement à des souris sauvages. Enfin nous avons observé qu'il y a in vitro un site de liaison de WRN dans le promoteur de CYP2B2.

Titre de l'écran-titre (visionné le 26 juin 2023) / FMRP (Fragile X mental retardation protein) est une protéine de liaison à l'ARN dont l'absence cause le développement du syndrome du X fragile avec retard mental (FXS). Ceci serait dû en partie à la perte de la fonction traductionnelle des formes cytoplasmiques de la protéine. Des isoformes nucléaires de FMRP (nFMRP) ont également été identifiées. Cependant, leurs fonctions demeurent très peu étudiées. Ces isoformes ont été localisées au sein de structure nucléaire de traitement de l'ARN, les corps de Cajal. De plus, nos investigations ont impliqué nFMRP dans la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN identifiant nFMRP comme étant un antagoniste de la formation de structures d'instabilité génomique et empêchant l'accumulation des dommages à l'ADN associé. Toutefois, les mécanismes sous-jacents impliquant nFMRP et ses interacteurs demeurent inconnus. L'hypothèse est que nFMRP interagit avec des partenaires nucléaires impliqués dans le métabolisme de l'ARN et dans la signalisation du dommage à l'ADN afin de maintenir l'intégrité génomique cellulaire. Les objectifs sont d'identifier les partenaires de nFMRP chez l'humain et de caractériser leur interaction. Ce travail a permis de localiser nFMRP au sein de sites de réparation du dommage à l'ADN, les foyers de Fanconi et d'investiguer l'effet de la protéine sur les R-loops. Finalement, mes travaux ont identifié la protéine DDX5, une hélicase à ARN, réparant les dommages à l'ADN par la résolution de R-loops, comme étant le premier partenaire de nFMRP. Ce résultat permet de définir le rôle joué par nFMRP dans le maintien de la stabilité génomique. Des études de mutagenèses permettront de caractériser le mécanisme entre nFMRP et DDX5 et de futures analyses de protéomique à large spectre permettront d'établir le premier interactome de nFMRP. Ce travail permettra d'ouvrir des avenues de recherche dans la perspective de mieux comprendre les fonctions de nFMRP ainsi que la physiopathologie du FXS. / FMRP (Fragile X mental retardation protein) is an RNA-binding protein whose absence causes the development of Fragile X syndrome with mental retardation (FXS). This would be due in part to the loss of the translational function of the cytoplasmic forms of the protein. Nuclear isoforms of FMRP (nFMRP) have also been identified. However, their functions remain very little studied. These isoforms have been localized within the nuclear RNA processing structure, the Cajal bodies. Furthermore, our investigations implicated nFMRP in the DNA damage cellular response, identifying nFMRP as an antagonist of the formation of genomic instability structures and preventing the accumulation of associated DNA damage. However, the underlying mechanisms involving nFMRP and its interactors remain unknown. The hypothesis is that nFMRP interacts with nuclear partners involved in RNA metabolism and DNA damage signaling to maintain cellular genomic integrity. The objectives are to identify the partners of nFMRP in humans and to characterize their interaction. This work made it possible to locate nFMRP within DNA damage repair sites, the Fanconi foci, and to investigate the effect of the protein on R-loops. Finally, my work identified the protein DDX5, an RNA helicase, repairing DNA damage by resolving R-loops, as the first partner of nFMRP. This result makes it possible to define the role played by nFMRP in the maintenance of genomic stability. Mutagenesis studies will characterize the mechanism between nFMRP and DDX5 and future broad-spectrum proteomic analyzes will establish the first interactome of nFMRP. This work will open avenues of research to better understanding the functions of nFMRP as well as the pathophysiology of FXS.

Les ARN hélicases DDX5 et DDX17 sont des protéines " multi-tâches ", elles sont impliquées dans de nombreuses étapes de la régulation du métabolisme des ARNs dont la transcription, l'épissage et la dégradation des ARNs. Lors de processus biologiques complexes tels que la myogénèse, les programmes d'expression génique sont profondément modifiés. Durant mon travail de thèse, j'ai contribué à montrer que DDX5 et DDX17 sont des protéines orchestratrices de la différenciation en coordonnant de manière directe et dynamique plusieurs niveaux de régulation génique. DDX5 et DDX17 contrôlent l'activité du facteur de transcription MyoD, régulateur majeur de la myogénèse ainsi que des microARNs spécifiques du muscle miR-1 et miR-206. Ceux-ci ciblent et régulent en retour l'expression de DDX5 et DDX17 mettant en place une boucle de rétro-contrôle négative induisant la diminution d'expression de ces deux protéines au cours de la différenciation. Enfin, cette diminution d'expression permet la mise en place d'un programme d'épissage participant à l'acquisition de phénotypes morphologiques des cellules différenciées. D'un point de vue mécanistique, il apparaît qu'un sous-groupe des événements d'épissage régulés durant la différenciation est contrôlé par la coopération de DDX5 et DDX17 avec le facteur d'épissage hnRNP H/F. D'autre part, DDX5 a aussi été impliqué dans un contexte pathologique du muscle. Cette hélicase interagit avec la mutation responsable de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1). Durant ma thèse, j'ai produit des résultats préliminaires suggérant un rôle de DDX5 dans la mise en place des défauts d'épissage observés dans cette pathologie

Les ARN hélicases DDX5 et DDX17 sont des protéines « multi-tâches », elles sont impliquées dans de nombreuses étapes de la régulation du métabolisme des ARNs dont la transcription, l’épissage et la dégradation des ARNs. Lors de processus biologiques complexes tels que la myogénèse, les programmes d’expression génique sont profondément modifiés. Durant mon travail de thèse, j’ai contribué à montrer que DDX5 et DDX17 sont des protéines orchestratrices de la différenciation en coordonnant de manière directe et dynamique plusieurs niveaux de régulation génique. DDX5 et DDX17 contrôlent l’activité du facteur de transcription MyoD, régulateur majeur de la myogénèse ainsi que des microARNs spécifiques du muscle miR-1 et miR-206. Ceux-ci ciblent et régulent en retour l’expression de DDX5 et DDX17 mettant en place une boucle de rétro-contrôle négative induisant la diminution d’expression de ces deux protéines au cours de la différenciation. Enfin, cette diminution d’expression permet la mise en place d’un programme d’épissage participant à l’acquisition de phénotypes morphologiques des cellules différenciées. D’un point de vue mécanistique, il apparaît qu’un sous-groupe des événements d’épissage régulés durant la différenciation est contrôlé par la coopération de DDX5 et DDX17 avec le facteur d’épissage hnRNP H/F. D’autre part, DDX5 a aussi été impliqué dans un contexte pathologique du muscle. Cette hélicase interagit avec la mutation responsable de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1). Durant ma thèse, j’ai produit des résultats préliminaires suggérant un rôle de DDX5 dans la mise en place des défauts d’épissage observés dans cette pathologie / RNA helicases DDX5 and DDX17 are “multi-tasks” proteins involved in nearly all aspects of RNA metabolism such as transcription, splicing and RNA degradation. During complex biological processes like myogenesis, gene expression programs are deeply modified. During my PhD, I contributed to show that DDX5 and DDX17 are orchestrators of differentiation by dynamically and directly orchestrating several layers of gene expression. DDX5 and DDX17 control the activity of the transcription factor MyoD, master regulator of myogenesis, as well as the expression of miR1/206, muscle-specific micro-RNAs. During myogenesis, these miRNAs downregulate the protein expression of DDX5 and DDX17 in a negative feedback loop, contributing to the switch of splicing programs observed in differenciated cells. Mechanistically, this splicing subprogram appear to be in part regulated by DDX5 and DDX17 in cooperation with hnRNP H/F splicing factors. Moreover DDX5 has been involved in a pathological muscular pathology : Myotonic Dystrophy type 1 (DM1). This helicase interact with the DM1 pathological mutation. During my PhD, I produced preliminary results suggesting a role for DDX5 in the establishment of the splicing defects observed in DM1

Le dégradosome d'E. coli est un complexe protéique impliqué dans la dégradation des ARNm constitué de quatre protéines majeures : RNase E, PNPase, RhlB et l'Enolase. Dans le but de mieux comprendre l'action du dégradosome, des études de l'interaction de RhlB et des autres hélicases DEAD-box de la cellule avec la RNase E ont été menées. Deux sites distincts d'interaction ont été mis en évidence dont l'un spécifique de RhlB. Ceci suggère l'existence de dégradosome alternatif différents selon les conditions de croissance. Des travaux menés sur l'Enolase afin de déterminer son rôle au sein du complexe semblent écarter un rôle structural du complexe ou global de la dégradation des ARNm. L'hypothèse d'un effet plus spécifique est privilégiée. Enfin, des travaux sur la régulation de la RNase E par phosphorylation ont conduit à plusieurs modèles de mécanismes son inhibition par ce processus. Une relation étroite entre le domaine NTH et CTH de la RNase E a ainsi été mise en évidence. De plus, il semble qu'une kinase endogène de E. coli puisse phosphoryler le CTH de la RNase E, uniquement en absence du NTH.

Diverses études ont souligné le rôle prépondérant du dialogue entre les cellules NK et les cellules dendritiques au cours des réponses immunes. Cependant, les récepteurs impliqués dans ce processus restent incertains. Au cours de ce travail, nous nous sommes attachés à identifier les récepteurs mis en jeu lors de la reconnaissance virale à l’aide de modèles humains et murins. Pour cela, nous avons mimé l’infection virale en utilisant deux ARN bicaténaires synthétiques – poly(AU) et poly(IC) – et montré qu’ils sont tous deux capables d’activer TLR3 mais que seul poly(IC) engage les hélicases RIG-I et MDA5. Les deux ARN induisent l’activation des cellules NK au sein des PBMC humaines, mais seul poly(IC) induit la production d’IFN-gamma. Les DC myéloïdes (mDC) sont requises pour cette activation sans nécessité d’un contact cellulaire entre les cellules NK et les mDC. En outre, les IFN de type I et l’IL-12 secrétés par les DC sont respectivement nécessaires à l’initiation du potentiel lytique et à la production d’IFN-gamma. Poly(IC), au contraire de poly(AU), a une action synergique avec l’IL-12 produite par les mDC pour induire la production d’IFN-gamma en agissant directement sur les cellules NK. Enfin, l’activation conjointe de TLR3 et des hélicases RLR sur les mDC et RIG-I sur les cellules NK, nécessaire à la production d’IFN-gama en réponse à l’ARN bicaténaire, a été confirmée à l’aide de souris déficientes pour TLR3 et Cardif et d’un ligand spécifique de RIG-I. En conclusion, nous rapportons pour la première fois la nécessité pour un composé microbien d’engager deux familles de récepteurs sur deux populations cellulaires distinctes pour induire une réponse innée éfficace. / Crosstalk between NK cells and DC is critical for the response to the microbial mimic poly(IC) but the dsRNA receptors involved in each cell types remained to be defined. We show herein that two dsRNA, poly(AU) and poly(IC), similarly engaged TLR3 while only poly(IC) triggered the RIG-I and MDA-5 helicases. Both dsRNA triggered NK cell activation within PBMC but only poly(IC) induced IFN-gamma. mDC were required for NK cell activation by the two dsRNA, suggesting that they triggered at least TLR3 on mDC. DsRNA induction of cytolytic potential and IFN-gamma production in NK cells did not require contact with mDC but was dependent on the secretion of type I IFN and IL-12, respectively. Poly(IC) but not poly(AU) synergized with mDC-derived IL-12 for high IFN-gamma production by acting directly on NK cells. Finally, the requirement of TLR3 and the RLR on mDC and the involvement of the RIG-I but not TLR3 on NK cells for the production of IFN-gamma induced by dsRNA was confirmed using TLR3 and Cardif deficient mice and RIG-I specific activator. This cooperation was further confirmed using inactivated FLU virus infected-target cells both in human and mouse system demonstrating that NK cells were able to sense viral material by a direct transfer from infected cells likely through lytic immunological synapse without prior infection of NK cells. Thus, we report for the first time the requirement of cotriggering

L'ARN génomique du Virus de l'Immunodéficience Humaine-1 (VIH-1) est multifonctionnel. Il constitue le génome encapsidé dans les virions et sert d'ARN messager pour la traduction des protéines virales Gag et Gag-Pol. La traduction de ces protéines dépend exclusivement de la machinerie traductionnelle cellulaire et est initiée par deux mécanismes différents : l'initiation canonique dépendante de la coiffe et l'initiation par entrée interne des ribosomes (IRES). Le VIH-1 présente deux IRES, l'un dans la région 5' non traduite (5'-UTR) qui est stimulé en phase G2/M du cycle cellulaire et l'autre dans la région codante de Gag. Ce dernier permet l'initiation de la traduction sur deux AUG en phase et conduit à la production de la protéine Gag pleine longueur mais également à la production d'une isoforme alternative de Gag, tronquée en région N-terminale. Le rôle de cette isoforme reste mal connu. Toutefois la mutation du second AUG chez VIH-1 et donc la suppression de la seconde isoforme de Gag provoque une diminution importante du taux de la réplication virale. La conservation structurelle et fonctionnelle de l'IRES Gag parmi les lentivirus suggère un rôle important de cette isoforme et de l'IRES gag dans le cycle viral. Nos travaux visent à comprendre à un niveau moléculaire les relations hôtes-pathogènes lors de la traduction des messagers viraux. Je me suis particulièrement intéressée aux rôles de la sous unité ribosomale 40S et de l'hélicase cellulaire DDX3 dans l'initiation de la traduction de la polyprotéine Gag du VIH-1. La première partie de ma thèse est consacrée à l'étude de l'interaction entre la sous unité ribosomale 40S et l'IRES gag du VIH-1. Par l'utilisation d'approches complémentaires, nous avons pu démontrer la présence de deux sites distincts de liaison au ribosome qui sont présents à proximité des deux codons d'initiation. Nous avons ensuite évalué à la fois in vitro et in cellulo (en collaboration avec l'équipe de T. Ohlmann, CIRI-ENS-Lyon) l'effet de la délétion de chacun des sites de liaison au 40S sur l'efficacité de traduction de la polyprotéine Gag. Nos résultats valident l'importance fonctionnelle des sites de liaison au ribosome pour une production optimale des deux isoformes de la polyprotéine Gag. La seconde partie de mon travail a consisté à définir le rôle de DDX3 dans l'initiation « coiffe-dépendante » de la traduction de la polyprotéine Gag. DDX3 est une hélicase à ARN à boîte DEAD impliquée dans de nombreux processus cellulaires tels que la régulation du cycle cellulaire et la réponse immunitaire innée mais également dans tous les aspects du métabolisme de l'ARN comme la transcription, l'épissage, l'export nucléaire ou encore la traduction. Plus récemment, il a été montré que DDX3 est nécessaire à la traduction de l'ARN génomique du VIH-1, cependant son rôle exact n'a pas encore été défini. Nous avons purifié une forme recombinante de la protéine en fusion avec la MBP (Maltose Binding Protein) et effectué des cinétiques enzymatiques afin de caractériser ses propriétés biochimiques. Contrairement à ce qui a été précédemment décrit, nos résultats montrent que DDX3 possède une activité ATPase strictement ARN-dépendante avec des constantes cinétiques similaires à celles de son homologue chez la levure, Ded1p. Nous avons également évalué l'activité hélicase de la protéine en présence de substrats de longueur et de nature variables (duplex ARN/ARN ou des hétéroduplex ADN/ARN). D'un point de vue fonctionnel, nous avons réalisé une première série d'expériences qui confirme la stimulation exercée par DDX3 sur la traduction de Gag in vitro. Ces résultats permettent d'envisager la caractérisation biochimique fine des interactions DDX3-ARN viral ainsi que de disséquer le rôle de DDX3 dans l'expression du génome viral. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) genomic RNA is multifunctional. It acts both as a genome that is packaged within virions and as messenger RNA translated to yield the Gag and Gag-Pol polyproteins. The translation of these proteins relies exclusively on the cellular translation machinery and is initiated through two mechanisms: the canonical cap-dependent initiation pathway and the use of internal ribosome entry sites (IRESes). HIV-1 has two IRESes, one located within the 5' UTR (5' UnTranslated Region) that is stimulated during the G2/M phase of the cell cycle, and the other embedded within the Gag polyprotein coding region. The later drives translation initiation from two AUG in frame and results in the production of the full-length Gag protein but also of an additional N-terminally truncated Gag isoform. Few things are known about this isoform, but the mutation of the second AUG causes a significant decrease in the rate of viral replication. The structural and functional conservation of Gag IRES among lentiviruses suggests an important role of this isoform and thus of the IRES in the viral cycle. Our work aims to understand at a molecular level the host-pathogen relationships in the translation of the viral messenger RNA. My work focused on the roles of the 40S ribosomal subunit and of the cellular helicase DDX3 in the translation initiation of Gag. During the first part of my Phd, I studied the interaction between the 40S ribosomal subunit and HIV-1Gag IRES. Following complementary approaches, we evidenced two distinct ribosome binding sites present close to the two the initiation sites of Gag. Then, we evaluated the effect of each 40S binding site deletion on Gag translation efficiency, both in vitro and in cellulo (in collaboration with the team of T. Ohlmann, CIRI-ENS-Lyon). Taken together, our results confirm the functional relevance of the two ribosomal binding sites to ensure optimal production of the two Gag isoforms. The second part of my Phd project aims to define the role of DDX3 in the translation initiation of Gag. DDX3 is a RNA DEAD-box helicase involved in many cellular processes such as cell cycle regulation and the innate immune response but also in all aspects of RNA metabolism such as transcription, splicing, mRNA nuclear export and translation. Recently DDX3 has been shown to favor HIV-1 Gag translation. To define its role, we first purified a recombinant form of the protein and performed kinetic experiments to analyze its biochemical properties. Contrary to what has been previously described, MBP-DDX3 displays a strictly RNA-dependent ATPase activity with kinetic constants similar to those displayed by its yeast counterpart Ded1p. We next evaluated MBP-DDX3 helicase activity towards RNA duplexes or RNA/DNA hybrids, with different length and single strand overhangs. Our preliminary results indicate that DDX3 alone is sufficient to enhance Gag translation in our in vitro system which paves the way to fine biochemistry experiments such as reconstruction of functional initiation complexes assembled onto Gag RNA and evaluation of its role on Gag RNA structure.