L’hémoglobine tronquée N de Mycobacterium tuberculosis (TrHbN) protège la respiration aérobie de Mycobacterium bovis BCG contre l’inhibition causée par le •NO. De plus, TrHbN catalyse efficacement la dioxygénation du •NO en NO3- (« réaction NOD », TrHbN-Fe2+–O2 + •NO  TrHbN-Fe3+ + NO3-) avec une constante bimoléculaire de 745 µM-1s-1 à 20°C. Cette haute efficacité, pratiquement limitée que par la vitesse de diffusion du substrat, a été associée en grande partie à la présence de deux tunnels hydrophobes visibles dans la structure de tridimensionnelle de TrHbN. L’objectif de cette thèse s’inscrit dans ce contexte, soit l’étude de la structure et de la dynamique de TrHbN à l’aide d’outils bio-informatiques, en particulier l’utilisation de simulations de dynamique moléculaire. Plusieurs simulations de dynamique moléculaire de TrHbN sous ses formes deoxy, oxygénée et cyanomet ont été menées. Ces simulations ont permis d’étudier la dynamique de la chaîne principale, du site actif et en particulier, celle des tunnels. Ces simulations ont révélé que les tunnels sont dynamiques, davantage complexes que le suggère la structure cristalline et que ceux-ci prennent place au cœur d’un repliement 2 sur 2 rigide. D’autres simulations incluant cette fois des molécules de •NO libres ont permis de mettre en évidence l’utilisation des tunnels de TrHbN par ceux-ci pour diffuser jusqu’au site actif. Ces simulations ont permis de proposer plusieurs hypothèses sur les routes utilisées et sur la diffusion des substrats du solvant vers le site actif. Pour valider ces hypothèses et pour pousser davantage nos connaissances, d’autres simulations couplées à diverses approches expérimentales ont été employées. D’abord, des simulations de TrHbN sous sa forme cyanomet couplées à une étude RMN approfondie ont permis de confirmer les résultats de DM quant à la rigidité du squelette de la protéine. De plus, ces derniers travaux ont révélé i) des mouvements lents (µs-ms) localisés le long des hélices B et G et ii) que la région pre-A n’est pas structurée contrairement à ce que suggère la structure cristalline. Enfin, d’autres simulations et des travaux de cinétiques enzymatiques ont été réalisés sur des mutants avec tunnel(s) obstrué(s). Ces travaux ont mené à des résultats démontrant que la matrice enzymatique de TrHbN est très plastique, permettant la diffusion du •NO malgré les mutations créées. Quoique notre compréhension sur les liens entre la structure et la fonction de TrHbN soit toujours incomplète, les travaux présentés dans cette thèse constituent un avancement considérable des connaissances. Plusieurs de nos découvertes mènent à une meilleure compréhension s’appliquant aux globines en général, aux protéines contenant un ou plusieurs tunnels et enfin, sur les mécanismes de diffusion des substrats gazeux à l’intérieur des enzymes. / The truncated hemoglobin N from Mycobacterium tuberculosis (TrHbN) protects aerobic respiration of Mycobacterium bovis BCG cells from the inhibitory effect of •NO. In addition, TrHbN catalyses the very rapid dioxygenation of •NO into the innocuous NO3- ions (NOD reaction: TrHbN-Fe2+–O2 + •NO  TrHbN-Fe3+ + NO3-) with a bimolecular rate constant of 745 µM-1s-1 at 20°C. This high efficiency was largely associated to the presence of two hydrophobic tunnels visible in the 3D-structure of TrHbN. In this context, the main goal of this thesis is to study TrHbN structure and dynamics with bioinformatics tools, especially molecular dynamics simulations. Several molecular dynamics simulations of TrHbN under its deoxy, oxygenated and cyanomet forms were conducted. These simulations allowed to study dynamics of TrHbN backbone, that of the active site and especially, that of the tunnels. As a main result, our simulations revealed that tunnels are highly dynamics, more complex than anticipated from the 3D-structure and that they are hosted in a very rigid two-on-two fold. Other simulations, this time including free •NO molecules, highlighted the use of these tunnels to reach the buried active site. These simulations allowed to propose many hypotheses regarding the preferred routes and to propose diffusions mechanisms from the solvent to the active site. In order to validate our hypotheses and to push further our knowledge on TrHbN, other simulations coupled with some experimental approaches were performed. First, simulations on TrHbN under its cyanomet form coupled with a detailed NMR confirmed that the backbone of the protein is ridig. In addition, this work revealed i) the presence of µs-ms motions localized along B and G helices and ii) that the pre-A region is not structured in contrast to the alpha helice seen in the crystal structure. Finally, other simulations along with kinetics characterizations of obstructed tunnel mutants were conducted. As a main result, the latter work revealed that TrHbN core is quite plastic, allowing substrate diffusion despite the presence blocking mutations. Our comprehension on TrHbN is still incomplete, however the work presented in this thesis constitutes a considerable progress. Moreover, the work presented herein contributes to other fields of research, especially on globins, to tunnel-containing proteins and finally, to gaseous substrates diffusion inside proteins.

L'analyse de la structure cristallographique de l'hémoglobine tronquée N de Mycobacterium tuberculosis (trHbN) a mis en évidence deux tunnels hydrophobes reliant le site actif à l'extérieur de la protéine. TrHbN a la capacité de protéger la respiration aérobique en phase stationnaire de Mycobacterium bovis de l'inhibition par le NO, possiblement grâce à son activité NO-dioxygénase. De plus, trHbN présente une des affinités pour l'oxygène les plus élevées observées pour une globine (K<i = 9 nM). Ces caractéristiques pourraient dépendre des tunnels de trHbN qui, par leur topologie, leur taille et leur caractère hydrophobe, pourraient servir à la migration sélective de ligands apolaires. Pour étudier cette hypothèse, des mutants aux entrées des tunnels obstruées ont été conçus in silico dans un premier temps, par une approche rationnelle. L'effet de ces mutations a été étudié par dynamique moléculaire d'une part et par spectroscopie et enzymologie d'autre part. Cette approche a montré que ces mutations n'ont pas perturbé le repliement de la protéine, la dynamique des résidus impliqués dans la stabilisation de ligands exogènes ou les caractéristiques spectrales de trHbN. De plus, la stabilisation d'une molécule d'eau au site distal est demeurée l'étape limitante de l'association de ligands à Thème. L'obstruction partielle à l'addition du NO à trHbNFen02 pour les mutants du tunnel court indique que celui-ci, ainsi que des voies de migration autres que les tunnels cristallographiques sont impliqués dans la migration de substrats apolaires au site distal.