L’herpèsvirus humain de type 6B (HHV-6B) infecte près de 100% des humains et établit une latence pour le reste de la vie de l’hôte. L’épidémiologie d’HHV-6A est moins connue. Ces deux virus sont capables d’intégrer leur génome dans les télomères des chromosomes humains. Lorsque cette intégration a lieu dans une cellule germinale et qu’il y a fécondation, ceci mène à un individu portant une copie du génome viral dans chacune des cellules de son corps. Cette condition, appelée inherited chromosomally-integrated HHV-6 (iciHHV-6), résulte en une transmission du génome viral intégré à 50% des descendants et est retrouvée chez environ 1% des humains. Malgré cette importante fréquence dans la population, l’intégration de HHV-6, de même que son infection et son effet sur ses cellules hôtes, demeurent peu caractérisés. Dans ce travail, nous avons étudié l’effet de l’infection d’HHV-6A et HHV-6B sur la réponse de dommages à l’ADN (DDR). Nous avons observé une forte réponse DDR localisée dans les compartiments de la réplication virale (RC), colocalisant avec une grande quantité d’ADN télomérique d’origine virale. De plus, les niveaux des ARNm des gènes TRF1, TRF2 et TPP1, membres du complexe shelterin protégeant les télomères, étaient surexprimés dans les cellules infectées. Cette augmentation se traduit par une surexpression de la protéine TRF2, recrutée aux séquences télomériques virales dans les RC. Finalement, nous avons étudié l’effet de BRACO-19, un inhibiteur de la télomérase, sur l’intégration d’HHV-6A et sa persistance. En utilisant un essai d’intégration récemment mis au point dans notre laboratoire, nous avons démontré que l’inhibition de la télomérase menait à une diminution significative de la fréquence de cellules porteuses d’intégration. Ce travail apporte de nouvelles connaissances sur l’infection de HHV-6 et sur son mécanisme d’intégration potentiel, de même que la première observation d’une possible participation des protéines du complexe shelterin dans l’infection de HHV-6. / Human herpesviruse 6B (HHV-6B) is a very prevalent virus that infect nearly 100% of humans and establish a life-long latency. Much less is known regarding HHV-6A epidemiology. Both viruses can integrate their genome into the telomeres of human chromosomes. When this integration occurs in a germinal cell, it can lead to an individual carrying one copy of the viral genome in every cell of its body. This condition, called inherited chromosomally-integrated HHV-6 (iciHHV-6), will then be transmitted to 50% of offspring and is found in approximately 1% of individuals across the world. Despite being so frequent, much remains to be studied on HHV-6 infection and integration processes. In this work, we studied the effects of viral infection on DNA damage response (DDR) signaling. We observed a DDR located in viral replication compartments (RC), together with a large amount of telomeric sequences that we confirmed to be of viral origin. In addition, mRNAs coding for TRF1, TRF2 and TPP1, members of the shelterin complex protecting telomeres, were upregulated during infection. Consequently, TRF2 protein was overexpressed and relocated to viral telomeric sequences in RC. Lastly, we’ve examined the effects of BRACO-19, a compound that affects telomerase activity, on HHV-6 integration and persistence. Using an integration assay recently developed in our laboratory, we could demonstrate that in the presence of the telomerase inhibitor, the frequency of cells containing integrated HHV-6 was significantly reduced. This work brings new knowledge regarding HHV-6 infection and its potential integration mechanism, as well as the first observation of a possible participation of the shelterin complex proteins during HHV-6 infection.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie héréditaire liée au chromosome X. Elle est principalement causée par la délétion d’un ou plusieurs exons du gène DMD, ce qui entraine un changement du cadre de lecture et l’obtention d’une protéine dystrophine tronquée et inactive. L’édition de génome par les systèmes TALEN ou CRISPR/Cas9 est devenue dans les dernières années un grand espoir pour le développement de traitements pour ce type de maladie. Dans ce travail, nous illustrons la faisabilité d’un traitement pour la DMD en utilisant les protéines TALENs ou le complexe CRISPR/Cas9 purifiés. Ces protéines sont donc transduites afin de générer des cassures double brin dans l’ADN génomique. Ainsi, la correction de cette mutation par recombinaison non homologue pourra corriger le cadre de lecture du gène codant pour la protéine dystrophine, produisant ainsi une protéine tronquée, mais active, telle que pour les patients Becker. Bien que les protéines TALENs montrent une bonne activité in vitro, l’efficacité de coupure n’a pas pu être observée dans les cellules, ce qu’indiquerait un défaut lors de la transduction protéique. Toute fois, dans le cas du système CRISPR/Cas9, l’essai surveyor a permis d’observer les produits de coupure attendus lors de la transduction de ce système avec des lipides cationiques. Ceci indique donc que le système CRISPR/Cas9 peut être utilisé de façon efficace sous forme protéique tout en ciblant le gène DMD. Finalement, l’utilisation de ce système a été confirmée in vivo chez la souris hDMD, où il a été possible d’observer la présence des délétions ciblées. La transduction de protéines en utilisant le système CRISPR/Cas9 illustre donc une approche thérapeutique prometteuse dans le but de développer un traitement pour les maladies génétiques. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an hereditary disease linked to chromosome X. It is mainly caused by the deletion of one or more exons of the DMD gene, which causes a change in the reading frame, obtaining a truncated and inactive protein. Genome editting by TALEN or CRISPR/cas9 systems has become in the recent years a powerfull tool for developing treatments for this type of disease. However, the use of plasmids encoding these systems leads to a prolonged expression, which may increase the off-target risk. Thus, it is important to note that today, viruses vectors remain the most effective delivery system for these plasmids, which always entails a risk of integration into the genome, increasing the probability of side effects for a treatment. In this work, we illustrate the development of a genome edditing treatment for DMD, but using purified protein TALENs or Cas9. These proteins are transduced in order to generate double strand breaks in the genomic DNA. Thus, the correction of this mutation by non-homologous end joining can correct the reading frame of the gene, producing a functional Dystrophin protein, as for Becker patients. Although TALEN proteins show a good activity in vitro, the cut-effectiveness has not been observed in the cells. It would indicate a defect in the protein transduction. However, in the case of CRISPR/cas9 system, we have obtained the expected cleavage products during the transduction with cationic lipids in both cell lines. These results are similar with those obteined when the plasmids coding for both systems were transfected. This indicates that the CRISPR/cas9 system can be used effectively in protein form while targeting a gene specifically. Protein therapy using the CRISPR/cas9 system can be a promising method in order to develop an alternative treatment for genetic diseases. Finally, in order to confirm that this system can be used in vivo, we will soon test it in the hDMD mouse model, containing the complete human DMD gene.

Le virus humain herpès-8 (HHV-8) est un virus oncogene associé au développement de cancers dont le sarcome de Kaposi (KS) et le lymphome primitif des séreuses (PEL). Plusieurs études mettent en évidence l'importance de différents facteurs dont les cytokines pour la survie et la prolifération des cellules tumorales infectées par HHV-8. Les médiateurs lipidiques bioactifs, provenant de l'hydrolyse des phospholipides, jouent un rôle important dans plusieurs formes de cancer en influençant le développement, la progression ainsi que le potentiel métastatique. En effet, la littérature scientifique décrit de plus en plus clairement que l'autotaxine (ATX)/acide lysophosphatidique (LPA) ainsi que la cyclooxygénase-2 (COX-2)/prostaglandine E2 (PGE2) sont intimement liés au développement du cancer. Par conséquent, l'utilisation d'inhibiteurs ciblant la synthèse ou l'action biologique de ces médiateurs lipidiques représente une avenue thérapeutique fort prometteuse. À ce jour, le rôle des médiateurs lipidiques dans la tumorigénèse associée à HHV-8 n'est pas clairement défini. Cette thèse présente donc deux projets directement reliés à la surexpression de d'ATX et de COX-2 suivant une infection par HHV-8. Nos résultats démontrent que l'ATX, une enzyme responsable de la production de LPA, est surexprimée dans les lignées cellulaires, dans l'ascite et les biopsies cutanées provenant respectivement de patients atteints du lymphome primitif des séreuses et du sarcome de Kaposi. L'augmentation de l'activité enzymatique de l'autotaxine in vitro favorise la prolifération et/ou la survie des cellules infectées. Notre étude permet aussi de confirmer l'induction de la COX-2 suivant une infection des cellules endothéliales par HHV-8. De plus, nous avons étudié les effets de la protéine Kl5 d'HHV-8 sur l'expression et la régulation du gène de la COX-2. Nos résultats ont permis de démontrer que la protéine Kl5 induit l'expression du gène de la COX-2 via les facteurs de transcription NFAT et AP-1. L'ensemble des résultats obtenus au cours de mes études de doctorat met en évidence une conséquence importante et spécifique de l'infection par HHV-8 soit l'induction des enzymes permettant la production de lipides bioactifs. Le LPA mène à une augmentation de la prolifération et/ou de la survie des cellules infectées alors que la COX-2 est essentielle à une infection efficace in vitro ainsi qu'au maintient de la latence virale.

L'herpèsvirus humain 8 (HHV-8) est un pathogène reconnu récemment dont l'infection est associée à des maladies telles que le sarcome de Kaposi, le lymphome primitif des séreuses, et la maladie de Castleman. Le génome de HHV-8 code pour de nombreuses protéines impliquées dans l'interférence avec les mécanismes de défense immunitaire de l'hôte. Nos travaux portent sur la caractérisation de la protéine K-bZIP de HHV-8. Cette protéine précoce-immédiate dans le cycle viral, est issue du gène ORFK8, et est principalement décrite comme un répresseur transcriptionnel. L'étude de son impact sur la voie de transcription de l'interféron α/β a permis d'identifier un mécanisme original par lequel K-bZIP inhibe l'activation de l'interféron (IFN). En se fixant directement aux éléments de liaison de IRF3 contenus dans le promoteur de l'IFN, K-bZIP active faiblement sa transcription. En revanche, lors d'une activation des kinases cellulaires impliquées dans la transcription de l'IFN, K-bZIP entraîne une forte inhibition de l'expression du gène de l' Ifn-β. De plus, nous avons pu déterminer que K -bZIP avait un rôle inhibiteur dans la cascade d'activation induite par la liaison de l'IFN de type 1 sur son récepteur. Cette inhibition est indépendante de la phosphorylation des STATs et de la formation du complexe ISGF3. Nous avons également identifié le fait que la sumoylation joue un rôle déterminant dans la répression liée à K-bZIP. Enfin, grâce à la génération d'un ARN interférant dirigé contre le transcrit de l'ORFK8, nous avons démontré que K-bZIP est requis pour la réplication du génome viral, pour la production de virions matures, et pour une transactivation optimale des messagers lytiques viraux. Globalement, ces travaux nous procurent une vision plus affinée du rôle de la protéine K-bZIP dans le contexte viral.

La purification par affinité couplée à l’analyse par spectrométrie de masse (AP-MS) est une méthode de choix pour l’étude des interactions protéines-protéines chez les cellules humaines. Par contre, cette technique est sensible aux perturbations causées par la surexpression ectopique des protéines cibles. Des effets anormaux, tels que la formation d’agrégats et la délocalisation des protéines cibles, peuvent mener à des conclusions erronées. Il est donc important de reproduire le plus précisément possible les niveaux physiologiques normaux des protéines à l’étude. Les travaux présentés dans ce mémoire décrivent le développement d’un système robuste et rapide couplant l’édition du génome et la protéomique permettant l’isolation de complexes protéiques natifs exprimés à des niveaux quasi physiologiques. L’approche a servie de tremplin afin d’atteindre l’objectif ultime qui est de caractériser les protéines exprimées à partir de leur contexte génomique naturel. À l’aide des outils d’édition génomique, nous avons introduit de façon ciblée au locus AAVS1 une cassette permettant l’expression de protéines d’intérêt étiquetées avec une séquence permettant la purification par affinité. Ainsi, nous avons purifié de nombreuses holoenzymes impliquées dans la réparation de l’ADN et la modification de la chromatine. Nous avons identifié de nouvelles sous-unités et interactions au sein de complexes déjà bien caractérisés et rapportons l’isolation de MCM8/9, soulignant ainsi l’efficacité et la robustesse de notre approche. La technique présentée dans ce mémoire améliore et simplifie l’exploration des interactions protéiques ainsi que l’étude de leur activité biochimique, structurelle et fonctionnelle. / Conventional affinity purification followed by mass spectrometry (AP-MS) analysis is a broadly applicable method to decipher molecular interaction networks and infer protein function. However, it is sensitive to perturbations induced by ectopically overexpressed target proteins and does not reflect multilevel physiological regulation in response to diverse stimuli. Here, we developed an interface between genome editing and proteomics to isolate native protein complexes produced from their natural genomic contexts. We used CRISPR/Cas9 and ZFNs to insert cDNA of interest in the endogenous genomic safe harbor locus AAVS1 and purified several DNA repair and chromatin modifying holoenzymes to near homogeneity. We uncovered novel subunits and interactions amongst well-characterized complexes and report the isolation of MCM8/9, highlighting the efficiency and robustness of the approach. These methods improve and simplify both small and large-scale explorations of protein interactions, as well as the study of biochemical activities and structure-function relationships.

Les technologies CRISPR-Cas9 révolutionnent la façon dont on interroge les systèmes biologiques et offrent un immense potentiel thérapeutique pour diverses maladies génétiques. Malgré les progrès fulgurants des dernières années, l'ingénierie ciblée du génome des cellules humaines demeure un défi de taille dans certains types cellulaires. La cosélection sans marqueur est une méthode qui consiste à introduire une mutation précise dans un gène endogène pour conférer de la résistance à une molécule toxique pour les cellules non modifiées, permettant l'enrichissement des cellules modifiées par CRISPR-Cas9. Comme deux différents évènements de modifications génétiques ne sont pas statistiquement indépendants au sein d'une même cellule, la sélection des cellules ayant la première modification permet l'enrichissement d'une deuxième modification d'intérêt à un locus distant par cosélection. Dans le cadre du premier chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode de cosélection pour permettre l'enrichissement des cellules modifiées par éditeur de type PE, de l'anglais pour « prime editing ». Nous avons identifié des mutations dominantes avec gain de fonction du gène ATP1A1 qui confèrent différents niveaux de résistance à l'ouabaïne, un inhibiteur de la pompe à sodium/potassium (ATPase Na⁺/K⁺). Ces nouvelles mutations permettent d'effectuer jusqu'à trois étapes successives de cosélection en augmentant la dose d'ouabaïne à chape étape. La cosélection facilite grandement l'enrichissement de populations de cellules hautement modifiées et l'isolement de clones dérivés d'une seule cellule homozygote pour une modification désirée. La caractérisation des clones a révélé que l'utilisation de l'éditeur PE3 génère fréquemment des modifications non voulues et plus difficiles à détecter étant donné leurs plus grandes tailles. En somme, nos méthodes devraient faciliter l'ingénierie ciblée du génome des cellules humaines pour créer des modèles cellulaires pour la recherche biomédicale. Dans le cadre du deuxième chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode de sélection sans marqueur pour l'ingénierie ciblée du génome des lymphocytes T pour diverses applications en thérapie cellulaire. Cette méthode permet de simultanément intégrer un transgène codant pour un récepteur antigénique chimérique (CAR) et une mutation gain de fonction dans le locus MTOR. Cette mutation permet la sélection sans marqueur avec la rapamycine, un inhibiteur de mTOR couramment utilisé en clinique comme immunosuppresseur. Notre approche permet donc d'enrichir les cellules modifiées par CRISPR-Cas9 qui expriment un transgène thérapeutique d'intérêt. À partir d'un rapporteur fluorescent de signalisation mTORC1, nous avons démontré que mTOR demeure fonctionnelle en présence de rapamycine après l'intégration du transgène d'intérêt et de la mutation dominante. Cette méthode permet l'enrichissement efficace de lymphocytes T primaires exprimant un récepteur CD19-CAR. À partir d'essais de cytotoxicité in vitro et d'un modèle murin de leucémie lymphoblastique aiguë, nous avons observé un effet combiné des lymphocytes CAR-T et de la rapamycine en ciblant des lymphocytes B cancéreux (CD19⁺). En somme, notre stratégie devrait faciliter l'ingénierie ciblée du génome des lymphocytes T pour diverses applications en thérapie cellulaire. / CRISPR-based technologies are revolutionizing the way we interrogate biological systems, and offer a diverse array of therapeutic opportunities to treat genetic diseases. Despite significant improvements, genome editing in human cells remains challenging in a variety of cell types. Marker-free co-selection is based on the installation of a specific mutation at an endogenous locus to confer cellular resistance to a molecule that is otherwise toxic for unmodified cells, allowing the enrichment of CRISPR-engineered cells. Considering that two genome editing events at distant loci are not statistically independent within the same cell, selection for the first modification allows the enrichment of a second modification of interest via co-selection. As part of the first chapter of this thesis, we developed a marker-free co-selection method to perform successive rounds of prime editing in human cells. We first identified new ATP1A1 gain-of-function mutations to confer different levels of resistance to ouabain, a plant-derived inhibitor of the essential and ubiquitous sodium-potassium pump (Na⁺/K⁺ ATPase). Introducing these mutations sequentially allowed up to three successive rounds of selection to be performed by increasing the dose of ouabain at each step. Co-selection greatly facilitates the isolation of highly-modified populations of cells and homozygous single cell-derived clones. Characterization of single cell-derived clones revealed that the use of a complementary nick sgRNA (PE3) frequently generates tandem duplications and large deletions at the target site. Overall, our co-selection toolkit should facilitate prime editing in human cells to create cellular models for biomedical research. As part of the second chapter of this thesis, we have developed a marker-free selection method to enrich CRISPR-engineered T cells for cell therapy applications. We devised a strategy to simultaneously introduce a rapamycin resistance mutation and a CAR gene cassette to the MTOR locus via intron nesting to generate rapamycin-resistant CD19-CAR-T cells. Our strategy allows the enrichment of CRISPR-engineered T cells expressing a therapeutic transgene of interest with rapamycin, a widely used immunosuppressant. Using a fluorescent mTORC1 signaling reporter, we confirmed that mTORC1 signaling remained functional in the presence of rapamycin after the installation of the dominant gain-of-function mutation and a therapeutic transgene of interest. Using luciferase-based and FACS-based in vitro cytotoxicity assays, and a mouse model of acute lymphoblastic leukemia, we confirmed that our CAR-T cells could efficiently target CD19⁺ leukemia cells in combination with rapamycin. We foresee that our strategy could both facilitate the enrichment of CRISPR-engineered CAR-T cells and improve tumor eradication.

Québec Université Laval, Bibliothèque 2014

Nous proposons, à l’aide d’une approche pluridisciplinaire, de mieux rendre compte des compétences entrepreneuriales d’un dirigeant de PME, de jeter les bases d’un modèle d’évaluation de la capacité à entreprendre à partir de l’analyse des cycles d’exploitation. Ce modèle sera construit sur les bases d’une enquête exploratoire, puis testé au sein d’une PME de négoce afin d’en vérifier la pertinence et d’en améliorer l’applicabilité.Une estimation pertinente de la capacité à entreprendre pourrait rendre possible une meilleure évaluation de la valeur ajoutée des dirigeants de PME et une esquisse plus précise de la stratégie de soutien aux actions entrepreneuriales. Evaluer la capacité à entreprendre est tout autant un défi pour la communauté financière et comptable que l’est l’évaluation du capital humain. La présente propose une nouvelle approche pour mieux aborder la "vraie" valeur d’une entreprise, avec l’espoir que notre modèle sera utile aux parties prenantes de l’entrepreneuriat. / We suggest, by means of a multidisciplinary approach, reporting better entrepreneurial skills of a leader of SME, to lay the foundations for a model of evaluation of the capacity to be undertaken from the analysis of the cycles of exploitation. This model will be built on the bases of an exploratory investigation, then tested within a trade SME to verify the relevance and improve the applicability.A relevant estimation of the capacity to be undertaken could make possible a better evaluation of the added value of the leaders of SME and a more precise sketch of the strategy of support for the entrepreneurial actions To estimate the capacity to be undertaken is just as much a challenge for the financial and accounting community than is it the evaluation of the human resources. The present proposes a new approach to approach better the "real" value of a company, with the hope than our model will be useful for the stakeholders of the entrepreneurship.

Texte remanié de: Thèse de doctorat--Littérature française--Paris 4, 2000. Titre de soutenance : Le corps dans l'oeuvre de Jean Giono. / Bibliogr. p. 422-437. Index.

Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 18 juillet 2006). Publié aussi en version papier.