L’hépatite auto-immune (HAI) est une maladie auto-immune multifactorielle du foie de pathogenèse inconnue. Cette maladie est caractérisée par une perte de la tolérance immunologique envers des antigènes du soi hépatiques entraînant une destruction progressive du parenchyme hépatique en absence de traitements. La prednisone avec l’azathioprine est le traitement de première ligne pour les patients atteints d’HAI. Cette combinaison d’immunosuppresseurs permet de réduire l’inflammation du foie et permet d’induire une rémission chez environ 80 à 90% des patients. Bien que la majorité des patients atteints d’HAI répondent bien à long terme aux traitements disponibles, 10 à 20% de ceux-ci ne répondront pas aux traitements, développeront une cirrhose et pourront nécessiter éventuellement d’une greffe hépatique. Puisqu’à l’heure actuelle aucun test clinique, biologique ou histologique n’est capable de prédire s’il y aura réponse aux traitements et rémission chez les patients atteints d’HAI, il est important d'identifier des biomarqueurs capables de prédire la réponse au traitement et l'activité de la maladie chez ces patients. L’hypothèse de ce projet est que la rémission clinique et une réponse favorable au traitement chez les patients HAI sont influencées par des médiateurs immunologiques (cellules et/ou cytokines) qui, lorsqu’identifiés, pourraient être utilisés pour évaluer la réponse au traitement. Le but de ce projet est donc d’identifier un ou plusieurs biomarqueurs de l'activité de la maladie et de la réponse au traitement chez les patients HAI. Selon les résultats obtenus, il est possible de suggérer que l’IL-16 pourrait influencer l’activité de l’HAI en affectant à la fois les voies pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Les résultats obtenus suggèrent aussi que l’IL-10, l’IL-16 et certaines sous-populations de lymphocytes T CD4 effecteurs et régulateurs pourraient être des biomarqueurs potentiels de l'activité de la maladie et de la réponse au traitement chez les patients HAI. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour valider l'utilité de ces biomarqueurs dans la prédiction de la réponse au traitement et de l'activité de la maladie chez les patients atteints d’HAI. / Autoimmune hepatitis (AIH) is a multifactorial autoimmune liver disease of unknown pathogenesis characterized by a loss of immunological tolerance towards hepatic self-antigens leading to progressive destruction of the liver parenchyma in the absence of treatment. Prednisone with azathioprine is the first-line treatment for AIH patients. This combination of immunosuppressants helps reduce liver inflammation and induces remission in approximately 80 to 90% of patients. Although most AIH patients respond to available treatments, 10 to 20% will not respond to treatment and will develop cirrhosis and may eventually require a liver transplant. Currently, no clinical, biological, or histological parameters can predict the initial response to treatment or long-term remission of patients with AIH. Therefore, there is a crying need for reliable biomarkers capable of predicting response to treatment and disease activity in these patients. The hypothesis of this project is that clinical remission and a favorable response to treatment in AIH patients are influenced by immunological mediators (cells and/or cytokines) which, when identified, could be used to evaluate the response to treatment. The aim of this project is therefore to identify biomarker(s) of disease activity and treatment response in AIH patients. According to our results, we believe that IL-16 could influence AIH activity by affecting both proinflammatory and anti-inflammatory pathways. Our results also suggest that IL-10, IL-16 and subpopulations of effector and regulatory CD4 T cells could be putative biomarkers of disease activity and response to treatment in AIH patients. However, further research is needed to validate the usefulness of these biomarkers in predicting treatment response and disease activity in AIH patients.

Au cours des deux dernières décennies, la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) a été une maladie épidémique croissante, non seulement dans les pays occidentaux mais également dans le monde entier en raison de l’augmentation continue des modes de vie sédentaires, de l’obésité, et de la résistance à l’insuline. La prévalence mondiale de la NALFD est actuellement estimée à 25% dans la population générale adulte. NALFD est composé d’un éventail d’affections hépatiques s’étendant du foie gras non-alcoolique (NAFL), stéatohépatite non-alcoolique (NASH), fibrose avancée et cirrhose qui peut progresser au carcinome hépatocellulaire (HCC). L’inflammation induite par NASH peut moduler l’activation des cellules stellaires hépatiques (CSH) et donc influencer la progression de la fibrose hépatique. Le rôle de l’inflammation de type 3, qui est caractérisée par la production des cytokines IL-17A et IL-22, dans la fibrose de type NAFLD demeure incompris. Dans cette thèse, nous avons évalué le rôle d’IL-22 et d’IL-17A dans la fibrose liée à la NAFLD. Des biopsies cliniques de foie NAFLD humain et un modèle murin in vivo de NAFLD ont été utilisés et des expériences in vitro ont été effectuées. Nous avons démontré que l’expression hépatique d’IL-22 est plus élevée chez les femmes et chez les femelles avec NAFLD versus les hommes et les mâles. Nous avons identifié les neutrophiles et les cellules T, y compris les cellules T Th17, Th22 et γδ, en tant que principaux producteurs d’IL-22 chez les sujets féminins et les souris atteintes de NAFLD. De plus, nous avons démontré que l’absence de la signalisation endogène du récepteur IL-22 (modèle IL-22RA1 knockout) chez les souris femelles avec NAFLD, aggravait les lésions hépatiques, l’inflammation et la fibrose, comparé aux mâles. Cet effet hépatoprotecteur dépend des mécanismes anti-apoptotiques médiés par la signalisation du récepteur IL-22 qui favorisent la survie des hépatocytes et réduisent au minimum les dommages au foie. Nous avons également montré que l’expression hépatique d’IL-22BP est régulé à la hausse chez les souris femelles avec NAFLD comparé aux mâles. Dans ces femelles, le ratio d’ARN messager hépatique de l’IL-22 envers celui de l’IL-22BP est corrélé positivement avec les gènes en aval de cible d’IL-22 (gènes anti-apoptotiques et antioxydants). Par ailleurs, nous avons prouvé que les neutrophiles intrahépatiques produisent l’IL-17A in situ dans notre modèle NAFLD et ceci correspondait fortement avec la progression de la fibrose de foie et les dommages hépatiques. Nous avons fourni des preuves préliminaires que l’IL-17A peut induire des pièges extracellulaires de neutrophiles (NET) in vitro, et la signature de NETs est impliquée dans la progression de la fibrose hépatique dans notre NAFLD. Pris ensemble, Ces résultats démontrent qu’identifié un nouveau rôle de l’inflammation de type 3 dans la fibrose liée au NAFLD, où l’action de l’IL-22 est dépendante du sexe et possède des 4 fonctions hépatoprotectrices contre la fibrose du foie chez les femelles, alors que l’IL-17A agit en tant que cytokine profibrogénique et favorise la fibrose de foie. / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing epidemic, not only in western countries but also worldwide due to the continuous rise in sedentary lifestyles, obesity, and insulin resistance over the last two decades. The global prevalence of NALFD is currently estimated to be 25% in the general adult population. NAFLD is comprised of a spectrum of liver disease ranging from non-alcoholic fatty liver (NAFL), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), advanced fibrosis, and finally cirrhosis that can progress to hepatocellular carcinoma (HCC). NASH-induced inflammation can modulate hepatic stellate cells (HSCs) activation and hence influence hepatic fibrosis progression. The role of type 3 inflammation, which is characterized by the production of the cytokines IL-17A and IL-22, in NAFLD-related fibrosis remain not clear. In this thesis, we evaluated the role of IL-22 and IL-17A in NAFLD-related fibrosis using clinical liver biopsies from a NAFLD human cohort, an in vivo NAFLD mouse model and in vitro experiments. We report that hepatic IL-22 expression had sexually dimorphic differences in both humans and mice with NAFLD where it was elevated in females versus males. We identified intrahepatic neutrophils in female subjects with NAFLD as well as T cells, including Th17, Th22, γδ T cells, in female mice with NAFLD as major producers of IL-22. In addition, we demonstrated that lack of endogenous IL-22 receptor signaling (IL-22RA1 knockout model), exacerbated liver injury, inflammation, and fibrosis in female but not male mice with NAFLD. This hepatoprotective effect was dependent on IL-22 receptor signaling-induced anti-apoptotic signals that promote hepatocyte survival and minimize liver damage. We also demonstrated that hepatic IL-22BP expression was upregulated in female mice with NAFLD compared to males, and the hepatic IL22/IL-22BP mRNA ratio positively correlated with IL-22 downstream target genes (anti-apoptotic and antioxidant genes) in those females. Moreover, we showed that intrahepatic neutrophils produce IL-17A in situ in our NAFLD model and this was strongly correlated with progression of liver fibrosis and liver injury. We provided preliminary evidence that IL-17A can induce neutrophil extracellular traps (NETs) in vitro, and that NETs are implicated in liver fibrosis progression in our NAFLD model. Taken together, we identified a novel role for type 3 inflammation in NAFLD-related fibrosis, where IL-22 act in sex-dependent manner and provided hepatoprotective functions against liver fibrosis in females, while IL-17A act as profibrogenic cytokine and promotes liver fibrosis through enhancing NETs.

L'inhibiteur de l'apoptose lié au chromosome X (XIAP) est une protéine antiapoptotique exprimée de manière ubiquitaire et est un puissant inhibiteur de l'apoptose en bloquant les formes actives des caspases-3, -7 et -9. D’autres fonctions de XIAP reposent sur son activité d'ubiquitine ligase impliquée dans la régulation d'importantes voies de signalisation et la transduction du signal des récepteurs de type NOD ; NOD1 et NOD2, jouant un rôle central dans l'immunité innée. Les mutations hémizygotes résultant en une perte de fonction du gène XIAP sont responsables de la survenue d’une maladie auto-inflammatoire dont le phénotype clinique englobe plusieurs de ces caractéristiques : une lymphohistiocytose hémophagocytaire (HLH), un syndrome d’activation macrophagique (MAS), une maladie inflammatoire de l'intestin mimant la maladie de Crohn. Bien que certaines études antérieures montrent que la suppression de XIAP induit l'activation de l'inflammasome NLRP3, les mécanismes physiopathologiques par lesquels ce déficit induit un syndrome autoinflammatoire ne sont pas définis. Ce projet vise à créer et caractériser une lignée cellulaire monocyte/macrophage THP-1 avec délétion de XIAP pour étudier les mécanismes moléculaires responsable de l'auto-inflammation dans les macrophages en utilisant le système CRISPR-Cas12. J'ai pu montrer que le déficit en XIAP est responsable de l’activation de l'inflammasome NLRP3 et d’un état auto-inflammatoire macrophagique indépendant de l'activité ubiquitine ligase de XIAP. Il m’a aussi été possible d'élucider la rétroaction positive de l’IL-1𝛽 et NF-κB sur l'inflammation. L'étude de ce modèle cellulaire nous permettra une meilleure compréhension des processus régulant l’activation de l'inflammasome et l’apoptose dans les macrophages déficients en XIAP. / The X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) protein is an anti-apoptotic protein. It is ubiquitously expressed and is a potent inhibitor of programmed apoptosis by blocking the activated forms of caspases-3, -7, and -9. Additional functions of XIAP rely on its ubiquitin ligase activity involved in regulating important signaling pathways. Among other important functions is the role of XIAP in the signal transduction of the NOD-like receptors; NOD1 and NOD2, which play a pivotal role in innate immunity. Hemizygous loss of function mutations in XIAP leads to XIAP deficiency. It can be considered as an autoinflammatory disease since the clinical phenotype encompasses several auto-inflammatory features: Haemophagocytic Lymphohistiocytic syndrome (HLH), macrophage activation syndrom (MAS), an inflammatory bowel disease, mimicking Crohn's disease. Interestingly, while some earlier reports have shown that deletion of XIAP induces NLRP3 inflammasome activation, the precise mechanisms by which XIAP deficiency induces an autoinflammatory syndrome are not defined. This project aims to create and characterize a THP1 monocyte / macrophage cell line with a deletion of XIAP to show the state of hyperinflammation in macrophages using the CRISPR-Cas12 system to study the role of different domains of the gene. I have shown that XIAP deficiency triggers the NLRP3 inflammasome in THP-1 macrophages independently of its ubiquitin ligase activity. In addition, it was possible to elucidate the role of the IL-1𝛽 and NF-κB backloop on inflammation. Studying this cell model will help us refine a better understanding of the dynamics of inflammasome and apoptosis in macrophages with XIAP deficiency.

Le syndrome périodique lié à NLRP12 (NLRP12-AD) est une maladie rare appartenant au groupe des maladies auto-inflammatoires systémiques héréditaires. Ces maladies sont causées par des anomalies du système immunitaire inné. Les cryopyrinopathies (CAPS) sont une famille de maladie auto-inflammatoire liées à des mutations gain de fonction du gène NLRP3. NLRP3 fait partie d’un composant central de l’inflammation, l’inflammasome. En 2007, Jéru et al. ont décrit un premier patient présentant des symptômes évocateurs d’un CAPS qui n’était pas porteur de mutation de NLRP3 mais présentait une mutation de NLRP12. Depuis, 33 patients pédiatriques atteints de NLRP12-AD ont été décrits dans la littérature. Les signes cliniques de la maladie sont variables et ne permettent pas d’établir de critères cliniques diagnostics fiables. La pathogénicité des mutations observées chez les patients est difficile à établir. Les patients atteints de NLRP12-AD représentent également un défi thérapeutique, un certain nombre d’entre eux ne répondant pas aux anti-IL1, un traitement pourtant efficace dans la plupart des inflammasomopathies. De nombreuses études se sont intéressées au rôle de NLPR12, qui posséderait à la fois des propriétés pro et anti-inflammatoires par sa capacité à inhiber les voies canoniques et non canoniques de NFkb mais aussi à former un inflammasome. Le rôle exact de NLRP12 reste controversé, avec des résultats différents selon les cellules ou les stimuli utilisés lors des expériences. L’objectif de notre étude est de créer un modèle in vitro fiable et reproductible afin de mieux comprendre la physiopathologie de NLRP12. Il permettra ensuite d’étudier les mutations de NLRP12 retrouvées chez des patients présentant des symptômes de maladie auto-inflammatoire pour améliorer les performances et la fiabilité du diagnostic et proposer des traitements personnalisés aux patients concernés. Nous avons créé un modèle de cellules THP1 NLRP12 KO en utilisant la technologie de CRISPR/Cas9 qui a permis d’induire une délétion homozygote à la jonction entre le 2ème intron et le 3ème exon de NLRP12, qui code pour le domaine fonctionnel de la protéine. Nos cellules KO semblent sécréter moins de cytokine pro-inflammatoire (IL-1β et TNFα) que les cellules WT, suggérant un rôle pro-inflammatoire de NLRP12 dans notre modèle. Nous avons par ailleurs décrit une cohorte nord-américaine de 17 patients porteurs de mutations de NLRP12 afin d’étudier leurs mutations et produit des vecteurs lentiviraux contenant ces mutations. Nous prévoyons d’explorer le rôle de NLRP12 sur l’activation de la voie NFkB et la formation d’un inflammasome puis de transduire nos cellules KO avec les différentes mutations de nos patients et d’analyser leurs conséquences sur ces mêmes voies et sur la sécrétion cytokinique. / NLRP12-AD is part of a new group of rheumatics’ diseases: the systemic autoinflammatory diseases. Those diseases are caused by defect or dysfunction in the innate immune system. Cryopyrin-associated periodic syndromes (CAPS) is a family of systemic autoinflammatory disease initially linked to NLRP3 gain-of-function heterozygous mutations. NLRP3 is part of a key component of inflammation, the inflammasome. In 2007, Jeru et al. described the first patient with CAPS phenotype, but without NLRP3 mutations. This patient had NLRP12 mutations. Since then, 33 pediatric patients with NLRP12-AD have been published. There is no specific clinical presentation that allow homogenous diagnosis. Determination of the causality of the mutations remains tricky. Lastly, some patients have shown resistance to anti-IL1 treatment, a medication that is highly effective in other inflammasomopathies such as CAPS, a puzzling observation as to the role of NLRP12. NLRP12 has been described with both anti- and pro- inflammatory roles, by its ability to inhibit the canonical and non-canonical NFkB pathways, but also through its hypothetic capacity to form an inflammasome. Hence, the exact role of NLRP12 remains controversial and its role might be stimuli- or cell-dependant. Our objective is to create a reliable and reproductible in vitro model to better understand the role of NLRP12. This model will then allow us to study NLRP12 mutations found in patients with auto-inflammatory symptoms. This will improve our diagnostic performance and help to offer to patients the most suitable therapy. We created NLRP12 knockout THP-1 cells by using the CRPISP-Cas 9 gene editing technology. We were able to induce a homozygous deletion at the intron 2/exon 3 junction that encodes the protein functional domain. Our KO cells seems to secrete less pro-inflammatory cytokines (IL-1β and TNFα) than WT cells. This suggests a pro-inflammatory role of NLRP12. We described a North American cohort of 17 pediatric patients with NLRP12 mutations to study their mutations in our model and produced lentiviral vectors containing those mutations. We planned to study the effects of NLRP12 on NFkB activation and on inflammasome formation. Then, we will transduce our KO cells with the patient’s mutations and compare their consequences on inflammation pathways and cytokine secretion.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Des souris transgéniques ont été créées chez lesquelles l'expression de l'oncostatin M (OM), une cytokine de la famille de l'interleukin-6 (IL-6), est restreinte aux lymphocytes T immatures par l'emploi du promoteur proximal de la tyrosine kinase p561ck Ces souris, nommées LckOM, dévoilent des particularités fascinantes du système . immunitaire que nos connaissances actuelles ne permettent pas de bien définir. organes lymphoïdes des souris LckOM sont étrangement affectés par la surexpression d'OM, de telle sorte que le thymus perd sa capacité de générer des nouveaux lymphocytes T, et les ganglions acquièrent cette fonction thymique et se mettent à produire un quantité phénoménale de lymphocytes T. Les mécanismes qui contrôlent cette voie de différentiation donnent naissance à des populations polyclonales de lymphocytes T matures CD4 + et CD8+ indépendamment de la fonction thymique. Une littérature abondante démontre l'existence de populations lymphocytaires extrathymiques dans le foie, les intestins et la moelle. En revanche, très peu d'études observent directement une thymopoïèse extrathmique de telle envergure dans les ganglions La présente étude a pour but de déterminer les caractéristiques des lymphocytes T issus de la différentiation extrathymique modulée par l 'OM. Les travaux menés au cours de ce projet de maîtrise visaient à caractériser phénotypiquement, par cytométrie en flux, ces lymphocytes extrathymiques et à établir la topographie et la cinétique de leur développement ainsi qu'à examiner leur comportement migratoire. Le modèle choisi pour l'étude de ces lymphocytes T d'origine extrathymique est un modèle de chimère hématopoïétique thymectomisée et reconstituée à l'aide d'une source de cellules souches hématopoïétiques (CSH) provenant de moelle osseuse transgénique (LckOM) et de foie foetal nom1al (C57BL/6). Ce modèle permet d'étudier spécifiquement le développement extrathymique de lymphocytes T normaux dans un environnement dépourvu d'influences thymiques. La prolifération et la demi-vie des lymphocytes extrathymiques sont établies grâce au marqueur de division cellulaire bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) qui est incorporé dans l'ADN lors de sa synthèse, tandis que leur migration est suivie à l'aide de la molécule fluorescente carboxy-fluorescein diacete succinimidyl ester (CFSE). Les résultats de ces travaux illustrent l'étonnant pouvoir de modulation qu'exerce l'OM sur le développement et l'homéostasie du système immunitaire. Ils démontrent premièrement que les lymphocytes T extrathymiques possèdent un répertoire Vp polyclonal et un phénotype indiquant qu'ils ont vécu une expérience antigénique antérieure. Deuxièmement, ils démontrent que le niveau de prolifération de ces lymphocytes extrathymiques est supérieur à celui des lymphocytes normaux. Troisièmement, ils démontrent que les lymphocytes T matures LckOM sont fortement attirés vers les ganglions. Ces travaux laissent sous-entendre que l'OM a des effets pléiotropiques qui engendrent des changements morphologiques et fonctionnels dans les organes lymphoïdes et des changements dans le comportement de circulation et de proliferation des lymphocytes. Ce phénomène hors du commun de thymopoïèse extrathymique est digne d'intérêt puisqu'il fait surgir des faits importants à propos de l'organisation globale et de l'homéostasie du système immunitaire qui suscite actuellement beaucoup d'intérêt dans la communauté scientifique.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'infection des cellules dendritiques (CDs) thymiques pourraient jouer un rôle dans la pathogénèse associée au virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Il a déjà été démontré que les cellules dendritiques du thymus peuvent être infectées in vitro par le VIH-1 et que cette infection cause le relargage d'un ou de plusieurs facteurs cytotoxiques dans le surnageant. Les objectifs principaux du présent travail sont séparés en 2 catégories. Tout d'abord, nous avons tenté de mieux caractériser l'entrée du virus dans les cellules dendritiques. Nous avons également essayé d'identifier la nature du ou des facteurs cytotoxiques retrouvés dans le surnageant de cellules dendritiques infectées par le VIH. Nos résultats démontrent qu'une souche du VIH-1 démontrant un tropisme pour les lignées de lymphocytes T peut entrer dans les CDs thymiques par un mécanisme qui ne requiert pas la présence des récepteurs de surface CD4 et CXCR4 habituellement utilisés par cette souche virale. Ce mécanisme d'entrée est utilisé par les virus infectieux aussi bien que les virus inactivés à la chaleur. Cette entrée virale mène à la présence de la gp120 à la surface des cellules. Nos résultats démontrent également que la cytotoxicité associée au surnageant est dûe à une combinaison de facteurs. Au moins, deux cytokines, le FasL et le TNFa ainsi que la protéine virale gp120 semblent jouer un rôle dans cette cytotoxicité. Par analogie avec les observations faites in vitro, l'infection des CDs thymiques in vivo pourrait entraîner la présentation d'antigènes viraux au cours du processus de selection négative des thymocytes et contribuer à l'élimination des lymphocytes réagissant contre le VIH. Cette infection pourrait aussi occasionner le relargage de facteurs cytotoxiques pour les thymocytes. Ces effets pourraient ultimement entraîner une diminution de la réponse immunitaire dirigée contre le VIH ansi qu'une diminution dans le réapprovisionnement en lymphocytes T matures causant ainsi un progression plus rapide de la maladie et ce, plus spécialement chez l'enfant chez lequel le thymus joue un rôle crucial.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les cellules épithéliales possèdent deux domaines membranaires distincts: le domaine apical, qui fait face à la lumière de l'organe, et le domaine basolatéral, qui interagit avec les cellules adjacentes et la matrice sous-jacente. Ces deux régions membranaires sont formées, entre autres, par la distribution particulière des protéines et des lipides membranaires. Les protéines membranaires sont transportées vers un domaine précis par l'intermédiaire de vésicules. Ce transport vésiculaire est contrôlé par des protéines spécialisées responsables d'étapes spécifiques de ce tri moléculaire. Parmi ces protéines spécialisées, les protéines "adaptrices" reconnaissent des structures ou des séquences d'acides aminés retrouvées sur les protéines membranaires. Ces signaux de transport servent d'adresses qui permettent à la machinerie cellulaire de reconnaître les protéines et de les transporter à destination. Les virus enveloppés utilisent ce processus de transport pour bourgeonner à des régions spécifiques de la cellule; notamment, à l'un ou à l'autre des domaines membranaires des cellules épithéliales. Il a précédemment été démontré que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) bourgeonne à la surface basolatérale des cellules épithéliales, et que le signal responsable de ce phénomène se trouve dans la partie cytoplasmique des glycoprotéines. Cependant, les structures ou acides aminés impliqués dans le signal n'étaient pas identifiés. Cette étude décrit le processus par lequel le signal de transport basolatéral des glycoprotéines du VIH a été identifié. Un système d'expression transitoire prenant avantage de cellules épithéliales MDCK directement cultivées sur membranes semi-perméables est utilisé. Une analyse de mutagénèse dirigée a démontré que la tyrosine amino-terminale de la région cytoplasmique est une composante essentielle du signal de transport. Cette étude suggère aussi qu'une structure locale en tours 13 contribue à la reconnaissance du signal. Enfin, les glycoprotéines mutantes ne démontrent aucune perte de fonction (infection, cinétiques de réplication virales), mais sont distribuées de façon non-polarisée à la surface cellulaire. Des observations préliminaires sur les glycoprotéines des virus de la leucémie T-lymphotropique humaine (HTLV) et de la leucémie mutine (MuL,V) suggéraient qu'elles possèdent des signaux de transport basolatéral. L'effet des glycoprotéines mutantes de ces deux virus sur le bourgeonnement polarisé du VIH a donc été étudié. Les signaux de transport de ces glycoprotéines ont été identifiés; ils se retrouvent dans la région cytoplasmique de ces glycoprotéines et une tyrosine est essentielle à chacun. La conservation d'un tel signal dans plusieurs rétrovirus suggère que le bourgeonnement polarisé est un phénomène important dans la biologie de ce groupe de virus. Enfin, étant donné que l'incorporation des glycoprotéines dans la particule virale est essentielle au bourgeonnement polarisé du VIH, les mécanismes gouvernant ce phénomène ont été étudiés. Il a été démontré que la délétion de la partie cytoplasmique des glycoprotéines du VIH permettait leur incorporation à l'intérieur de particules rétrovirales hétérologues. Ces observations sont ici reproduites en tenant compte de l'utilité de ces vecteurs en thérapie génique. Les vecteurs rétroviraux ayant incorporé les glycoprotéines tronquées transduisent spécifiquement un gène dans les cellules CD4+ d'une population mixte de lymphocytes. L'ensemble de ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'assemblage des rétrovirus et le transport intracellulaire de leurs protéines.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Pour le maintien d'une espèce, il est primordial que celle-ci soit capable, à partir des nutriments présents dans le milieu environnant, d'effecmer la biosynthèse du matériel ceUiilaire nécessaire à sa survie. Les micro-organismes par exemple, synthétisent les produits organiques dont ils ont besoin, en uulisant divers processus métaboliques afin de trouver des sources d'énergie alternatives. Cette diversité est observée chez les baaéries photosynthétiques, qui sont capables de convertir la lumière en énergie chimique, favorisant ainsi le processus de fixation de l'azote. Ce processus, qui pennet la biosynthèse de l'azote, est essentiel car l'azote diatomique limite encore la production agricole. C'est pourquoi il est important de trouver différentes méthodes permettant d'améliorer le processus de fixation de l'azote. Afin de perfectionner ce mécanisme biologique, il est nécessaire d'étudier au préalable les facteurs qui limitent et régulent l'activité de la nitrogénase (N2ase), qui est l'enzyme-clé du processus de fixation de l'azote. La N2ase est une métalloenzyme sensible à l'oxygène et constituée de deux composantes qui ont besoin de MgATP2 et nécessite un transporteur d'électrons à bas potentiel rédox. Le transport d'électrons vers la N2ase a été fermement établi chez Klebsiella pneumoniae et chez cette bactérie, le transporteur est une flavodoxine spécifique, NifF. Le mécanisme met en jeu la NifF et une pyruvate flavodoxine oxydoréductase (NifJ), qui résulte en une décarboxylation du pyruvate en CoA + COz (par NifJ) couplée à une réaction de reduction de la NifF. Cependant, ce transport d'électrons ne se résume pas seulement au système NifF/NifJ. En effet, ce système n'est pas utilisé chez tous les diazotrophes. Par exemple, chez Clostridium pasteurianum, le transport d'électrons implique une ferrédoxme. De plus, certains micro-organismes peuvent avoir plusieurs types de ferrédoxines ou des ferrédoxines et une flavodoxine ou encore plusieurs tonnes de flavodoxines. Un exemple est donné par Rhodobacter capsulatus qui possède de nombreux transporteurs d'électrons à bas potentiel rédox, mais dont seulement une de type ferrédoxine, est capable d'acheminer des électrons vers la N2ase in vivo. Le sujet de cette thèse de doctorat est l'identification d'une flavodoxine comme étant un nouveau transporteur d'électrons à bas potentiel rédox, in vivo pour la N2ase chez Rhadsbacter capsalatus. Une combinaison d'approches génétiques, biochimiques, physiologiques et d'études de cinétique de type « stopped-flow », a permis de caractériser ce transporteur. Les études biochimiques ont identifié celui-ci comme étant une flavodoxine (NifF) à longue chaîne hautement homologue à des flavodoxines nif-spécifiques. L'observation de la complémentation d'un mutant nifF de Klebsiella pneumoniae et l'obtention de la séquence nucléotidique de ce dernier ont mis en évidence la présence d'un promoteur de type spécifique. Les études sur la régulation transcriptionnelle de nifF ont confirmé son implication en tant que transporteur d'électrons dans le processus de fixation de l'azote. Par contre, il a été démontré que la transcription du gène de nifF chez Rhodobacter capsalatus est régulée à la fois par le taux intracellulaire d'azote ammoniacal et de fer, contrairement à la transcription de nifF chez Klebsiella pneumoniae. De plus, la ferrédoxine (Fdl) semble jouer un rôle dans la régulation transcriptionnelle de nifF, mais le mécanisme d'action reste encore à déterminer. Enfin, les études de cinétiques de type « stopped-flow » permettent d'affirmer que NifF peut remplacer Fdl (le transporteur d'électrons pour la N2ase chez Rhodobacter capsalatus in vivo) comme transporteur d'électrons vers la N2ase. En effet, NifF présente non seulement une interaction spécifique avec la FeP, mais cette interaction est plus forte que celle entre FdJ et FeP. Donc, même si NifF est présente en quantité intracelullaire plus faible que Fdl, elle contribue de façon importante au taux de fixation de l'azote de par sa grande réactivité avec la FeP.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Chez les procaryotes, la réplication du chromosome peut entraîner la dimérisation des deux nouveaux chromosomes par recombinaison homologue. La fréquence de ce phénomène est particulièrement élevée dans la région du terminus de réplication du chromosome de E. coli, notamment aux sites Hot et TTiZ. Si le dimère chromosomique n'est pas résolu avant la partition dans les cellules-filles, il y aura filamentation cellulaire et aberration chromosomique. Pour contrer ce phénomène, E. coli a mis en place un système de résolution de dimères, soit le système de recombinaison spécifique de site Xer. Chez E. coli, ce système comprend les recombinases XerC et XerD et le site chromosomique dif situé dans la région du terminus de réplication. Les recombinases s'arriment d'abord aux sites dif des chromosomes formant le dimère, puis il y a coupure et échange des brins libérant ainsi les chromosomes à leurs formes monomères. La répartition de ce système de résolution de dimères est assez bien documentée parmi les bactéries Gram négatives. Cependant, peu d'études se sont penchées sur les bactéries Gram positives. Le but de notre étude est de détecter la présence de ce système chez treize espèces de bactéries Gram positives du groupe des bactéries lactiques, certaines étant très importantes dans l'industrie alimentaire. Plusieurs techniques ont été employées, dont l'hybridation Southern, l'amplification génique avec amorces dégénérées issues des séquences des recombinases déjà connues, l'amplification génique dite "inverse", ainsi que le séquençage. Nous avons également utilisé un programme informatique afin de dégager la phylogénie et les ressemblances entre les recombinases de Gram positives et entre celles-ci et les recombinases déjà connues des bactéries Gram négatives. Par hybridation Southern, nous avons réussi à démontrer la présence d'un site analogue au site dif de E. coli chez Lactobacillus casei. De plus, l'amplification génique avec amorces dégénérées a montré que cette dernière espèce ainsi que les espèces Lactobacillus plantarum souche 8014, Lactobacillus plantarum souche 14917 et Lactobacillus bulgaricus 737 possèdent toutes au moins une recombinase de type Xer. Nous n'avons pas obtenu de séquences pour les autres espèces de bactéries, peut-être à cause d'un manque d'homologie entre les amorces et l'ADN ciblé. Les régions amplifiées de ces quatre souches, correspondant à environ 430 pb du bout C-terminal de la recombinase, ont été séquencées, puis des amorces ont été fabriquées à partir de la séquence de L. casei. Ces amorces devaient amplifier les régions flanquant la séquence connue (amplification "inverse"), permettant ainsi d'obtenir une séquence complète du gène. Nous n'avons pas obtenu de résultats avec cette technique, peut-être à cause de la formation de boucles C-G dans l'ADN simple-brin lors de certains cycles de l'amplification. Les quatre séquences ont ensuite été comparées et une phylogénie a été établie. Nous avons trouvé que ces séquences formaient un groupe phylogénique fortement apparenté et qu'elles ressemblaient le plus aux séquences XerD des bactéries Gram négatives, ces dernières ressemblances surpassant même celles avec la recombinase XerD de la bactérie Gram positive B. subtilis. Ces derniers résultats suggèrent la possibilité d'une évolution différente des recombinases XerD à l'intérieur du groupe des Gram positives que nous avons examiné.

Le transfert adoptif de lymphocytes T virus-spécifiques ou ‘’Chimeric Antigen Receptors’’ (CAR) s’est avéré efficace pour le traitement de plusieurs types d’infections virales et certains cancers à la suite d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Cependant, l’immunosuppression administrée pour la prévention du rejet de greffe et de la maladie du greffon contre l’hôte limite l’efficacité et la persistance à long terme des réponses médiées par ces lymphocytes. L’agent immunosuppresseur Tacrolimus (FK506) est parmi les plus utilisés, et fonctionne en liant la protéine FK506-Binding protein (FKBP12) afin d’exercer ses effets immunosuppresseurs sur les lymphocytes T. Dans le but de fournir une protection anti-virale, mais également anti-lymphoprolifératif des lymphocytes B et permettre la poursuite de cette immunosuppression préventive, nous avons pour objectif de générer des lymphocytes CAR-T et virus-spécifiques résistants à l’action du FK506 par l’invalidation du FKBP12. En utilisant la méthode d’édition génique basée sur les CRISPR ciblés par la nucléase Cas9, nous avons pu invalider le gène du FKBP12 sur des lymphocytes T stimulés par CD3-CD28. L’efficacité du knockout a été validée par Western Blot et TIDE sequencing. Le knock-out du gène du FKBP12 a conféré un maintien de la croissance cellulaire et des fonctions effectrices telles que la synthèse de cytokines IL-2, TNFα et IFN γ en présence de Tacrolimus comparativement aux cellules contrôles. Par la même méthode, nous avons pu invalider le gène du FKBP12 sur des lymphocytes T multivirus-spécifiques dont l’efficacité a été validée par cytométrie en flux. Les fonctions effectrices ont également été maintenues en présence de tacrolimus et ont été évaluées par ELISpot. Enfin, des lignées de lymphocytes T multivirus spécifiques dont le gène du FKBP12 a été invalidé ont été transduites avec un vecteur lentiviral dans le but d’exprimer un CAR CD19 dont l’expression a été validée par cytométrie en flux et la réactivité maintenue en présence de tacrolimus. En conclusion, ces résultats nous ont permis de démontrer la faisabilité de génération de lymphocytes T « triple fonction » anti-tumorales, anti-virales et résistantes au tacrolimus. L’application de cette approche semble prometteuse dans un contexte d’une immunothérapie adoptive anti-virale et anti-tumorale post-transplantation de moelle osseuse. / Adoptive transfer of virus-specific T lymphocytes or CAR-T cells has been shown to be effective for the treatment of several types of viral infections and certain cancers following hematopoietic cell transplantation. However, immunosuppression administered for the prevention of transplant rejection and graft-versus-host disease limits the efficacy and long-term persistence of responses mediated by these lymphocytes. The widely used immunosuppressive agent Tacrolimus (FK506) requires FK506-Binding protein (FKBP12) to exert its immunosuppressive effects on T cells. We undertook to engineer a multifunctional T-cell therapy to both optimally prevent viral reactivation and relapse of B-cell malignancies post-transplant in the context of immunosuppression. The objective of our work is to generate tacrolimus resistant, multivirus-specific T-cell lines expressing an anti-CD19 CAR. Using the gene editing method based on Clustered Regular interspaced short palidromic repeats (CRISPR) targeted by the CRISPR-associated protein 9 (Cas9) nuclease, we were able to invalidate the FKBP12 gene on activated T cells (confirmed by TIDE sequencing and western blotting). Invalidation of FKBP12 conferred maintenance of cell growth and effector functions such as the synthesis of cytokines IL-2, TNFα and IFNγ in the presence of Tacrolimus. Using the same method, we were able to delete the FKBP12 gene in virus-specific T lymphocytes. Effector functions were also maintained in the presence of tacrolimus. Finally, we integrated an anti-CD19 CAR by lentiviral transduction into FKBP12-edited multi-virus T-cell lines, and the efficiency of transduction was determined by flow cytometry. The cells maintained their viral reactivity in the presence of tacrolimus. In conclusion, we were able to confirm the feasibility of generation of ‘’triple function’’ T cells (anti-viral, anti-tumoral and tacrolimus resistant). Multifunctional T-cell product manufacturing is a promising approach to optimize post-transplant T-cell immunity against opportunistic pathogens and underlying malignancies.