Die Hymenopterengiftallergie ist eine IgE-vermittelte Überempfindlichkeit, welche innerhalb der Allgemeinbevölkerung weit verbreitet ist und im Rahmen einer Anaphylaxie lebensbedrohlich werden kann. Geht die Reaktion auf einen Insektenstich über Symptome im Bereich der Einstichstelle hinaus spricht man von systemischen oder anaphylaktischen Reaktionen. Insektengift ist im Kindesalter mit 20,2 % der zweithäufigste Auslöser einer Anaphylaxie. Bei mittel- bis schwergradigen allergischen Stichreaktionen (Grad II-IV nach Ring und Messer) ist die Spezifische Immuntherapie (SIT) indiziert, welche als einzige kausale Therapie zur Verfügung steht. Die SIT ist ein Verfahren welches durch schrittweise Desensibilisierung eine Allergentoleranz induziert. Während der Ablauf und die Wirksamkeit der SIT mittlerweile recht gut erforscht sind, gibt es bislang wenige Erkenntnisse über den Langzeitverlauf der Hymenopterengiftallergie nach Therapieabschluss bei pädiatrischen Patienten. Ziel dieser Arbeit war es das Langzeitoutcome von Kindern und Jugendlichen mit Hymenopterengiftallergie nach SIT, sowie die Einhaltung von Anaphylaxieleitlinien im Hinblick auf Notfallsets und Wissensstand der Patienten zu untersuchen.

Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit den tumorbedingten Überlebensdaten der Melanompatient:innen am Hauttumorzentrum Leipzig mit Primärdiagnose in den Stadien II bis IV zwischen 2006 bis Ende 2019. Aufgrund der im letzten Jahrzehnt etablierten neuen innovativen Therapiemöglichkeiten für die Stadien III bis IV wird angenommen, dass sich ab 2011 für Patient:innen in diesen Stadien Verbesserungen der Überlebensdaten eingestellt haben. In der Kontrollgruppe von Patient:innen im Tumorstadium II hingegen wird bei nahezu gleichgebliebenen Therapieoptionen keine Änderung der Mortalitätsraten im Gesamtbetrachtungszeitraum von 2006 bis 2019 erwartet. Die Auswertung erfolgte retrospektiv anhand der am Klinisches Krebsregister Leipzig (KKRL) erhobenen Daten. Es sind 840 Melanompatient:innen eingeschlossen. Von diesen erhielten 554 Patient:innen die Erstdiagnose im Stadium II, 250 im Stadium III und 36 im Stadium IV. Verglichen werden die Zeiträume 2006 bis 2010 (Ära der Chemotherapien, Gruppe 1, 292 Patient:innen), 2011 bis 2013 (Zulassung der ersten neuen innovativen Therapien im fortgeschrittenen Tumorstadium, Gruppe 2, 161 Patient:innen) und 2014 bis 2019 (umfängliches zugelassenes Arsenal neuer innovativer Therapien einschließlich adjuvanter Therapien, Gruppe 3, 387 Patient:innen). Kaplan Meier Darstellungen sowie Log Rank Tests betrachten die Fragestellung in Hinblick auf statistisch signifikante Unterschiede. Auswertungen zur Gruppenzusammensetzung und zu den Beobachtungszeiträumen ermöglichen eine Aussage über die Vergleichbarkeit der drei Patient:innengruppen. Betrachtet werden das Gesamtüberleben (OS), das progressionsfreie Überleben (PFS) in Hinblick auf den Tumorstadien-Shift von III zu IV sowie das rezidivfreie Überleben (RFS). Im Ergebnis können für Patient:innen im Tumorstadium III Veränderungen hinsichtlich des OS, PFS sowie RFS im Vergleich der drei Zeiträume aufgezeigt werden. Für das OS kann ein statistisch signifikanter Vorteil der Patient:innen für den letzten Zeitraum nachgewiesen werden. In Gruppe 3 überleben prozentual und statistisch signifikant die meisten Patient:innen bis zum fünften Jahr. Bei der Betrachtung des PFS tritt der Stadien-Shift bei Melanom-Patient:innen in den beiden letzten Zeiträumen später und prozentual weniger auf, wobei noch kein Nachweis einer statistischen Signifikanz gelingt. Für das RFS kann ebenfalls keine statistische Signifikanz berechnet werden. Zwar ist ein Anstieg der Mediane von Gruppe 1 zu 3 zu verzeichnen, jedoch gleicht sich der prozentuale Anteil der Rezidive bis zum fünften Jahr über alle drei Zeiträume hinweg an. Damit kann für die am Hauttumorzentrum Leipzig behandelten Patient:innen im Tumorstadien III in der Ära der neuen Therapeutika eine Verbesserung der Gesamt- und progressionsfreien Überlebensdaten demonstriert werden. Diese Real-life Daten entsprechen den Studiendaten der Literatur und unterstreichen den Überlebensvorteil im Stadium III nicht zuletzt aufgrund der adjuvanten Therapien. Das sich über alle Zeiträume angleichende RFS hingegen weist darauf hin, dass das Krankheitsrezidiv weniger beeinflusst wird. Bei der Auswertung des OS im fernmetastasierten Tumorstadium IV zeigen sich eine Verdreifachung der 5-Jahres-Überlebensrate (5-JÜR) von Gruppe 3 zu Gruppe 1 sowie ein Anstieg der Mediane und Mittelwerte. Diese Berechnungen sind hinweisend auf einen Benefit der neuen Immuntherapeutika im Tumorstadium IV, wenngleich ein statistisch signifikanter Unterschied nicht nachgewiesen werden kann. Das RFS kann aufgrund des häufig frühzeitigen Todeseintritts im fortgeschrittenen Stadium IV nicht ausreichend beurteilt werden. In der Kontrollgruppe Stadium II kann wie erwartet bei dem Vergleich des OS zwischen den drei Zeiträumen kein statistisch signifikanter Unterschied ermittelt werden. Bei der Berechnung der Mittelwerte des OS sowie der JÜR zeigt sich eine tendenzielle Verschlechterung der Überlebensdaten von Gruppe 1 zu 3. Allerdings sind die Beobachtungszeiträume von einem Teil der Patient:innen in der letzten Gruppe zum Zeitpunkt der Auswertung noch kurz, was die Auswertbarkeit einschränkt. Unerwartet aber statistisch signifikant verschlechtert sich ebenfalls das RFS der Stadium II Patient:innen von Gruppe 1 zu 3. Möglicher Grund für diese Entwicklung könnte der langsame Rückgang der adjuvanten Interferon-Therapie über den Beobachtungszeitraum sein, welche aufgrund der schwachen und uneinheitlichen weltweiten Studiendaten auch in Deutschland zunehmend verlassen wurde und welche zuletzt aufgrund der Einstellung der Produktion durch die Pharmahersteller zudem nicht mehr verfügbar war. Es ist demzufolge anzunehmen, dass eine Roferon-Therapie möglicherweise doch einen positiven Einfluss auf das OS sowie RFS in Leipzig hat. Wünschenswert für die abschließende Darstellung der Leipziger Überlebensdaten wäre die erneute Auswertung nach längeren Beobachtungszeiten für die letzte Gruppe. Einen ersten Ausblick hierfür gibt der Vergleich der Berechnungen der Daten aktualisiert bis zum 01.01.2021 und bis zum 01.04.2022. Insbesondere im Tumorstadium III des letzten Zeitraums sind Zunahmen der Mittelwerte sowie Mediane des OS, RFS und PFS zu verzeichnen. Damit kann der Nachweis eines statistisch signifikanten Unterschiedes insbesondere für das RFS sowie PFS im Stadium III in zukünftigen Auswertungen und im Hinblick auf die vielversprechenden Angaben in der Literatur erwartet werden.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Aufgabenstellung 3 Materialien und Methoden 4 Ergebnisse 4.1 Patient:innenprofil 4.2 Therapeutika 4.3 Gesamtüberleben 4.3.1 Gesamtüberleben im primär diagnostizierten Tumorstadium II 4.3.2 Gesamtüberleben im primär diagnostizierten Tumorstadium III 4.3.3 Gesamtüberleben im primär diagnostizierten Tumorstadium IV 4.4 Tumorstadien-Shift vom primär diagnostizierten Stadium III zu IV 4.5 Rezidivfreies Überleben . 4.5.1 Rezidivfreies Überleben im primär diagnostizierten Tumorstadium II 4.5.2 Rezidivfreies Überleben im primär diagnostizierten Tumorstadium III 4.5.3 Rezidivfreies Überleben im primär diagnostiziertenTumorstadium IV 4.6 Beobachtungszeitraum 5 Diskussion 5.1 Patient:innenprofil 5.2 Gesamtüberleben 5.3 Tumorstadien-Shift von III zu IV 5.4 Rezidivfreies Überleben 5.5 Beobachtungszeitraum 6 Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang Eigenständigkeitserklärung

In this work, bispecific antibodies were produced by coupling TNFR-specific antibodies with checkpoint inhibitors, tested for their functionality and compared with each other. This combination should enable a targeted TNFR activation in tumor tissue, where a high PDL1 expression is frequent and therefore the formation of oligomeric transactivating (TNFSF3-TNFRSF3)2 complexes should only occur there by binding to PDL1-expressing cells. These receptor-ligand complexes are a prerequisite for the agonistic activity of the antibodies. / In dieser Arbeit wurden bispezifische Antikörper durch Kopplung von TNFR-spezifischen Antikörpern mit Checkpoint-Inhibitoren hergestellt, auf ihre Funktionalität getestet und miteinander verglichen. Diese Kombination sollte eine gezielte TNFR-Aktivierung im Tumorgewebe ermöglichen, wo eine hohe PDL1-Expression häufig ist und daher die Bildung oligomerer transaktivierender (TNFSF3-TNFRSF3)2-Komplexe nur dort durch Bindung an PDL1-exprimierende Zellen erfolgen sollte. Diese Rezeptor-Liganden-Komplexe sind eine Voraussetzung für die agonistische Aktivität der Antikörper.

Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare, but highly aggressive endocrine malignancy. Tumor-related hypercortisolism is present in 60 % of patients and associated with worse outcome. While cancer immunotherapies have revolutionized the treatment of many cancer entities, the results of initial studies of different immune checkpoint inhibitors in ACC were heterogeneous. Up to now, five small clinical trials with a total of 121 patients have been published and demonstrated an objective response in only 17 patients. However, one of the studies, by Raj et al., reported a clinically meaningful disease control rate of 52 % and a median overall survival of almost 25 months suggesting that a subgroup of ACC patients may benefit from immunotherapeutic approaches. Following the hypothesis that some ACCs are characterized by a glucocorticoid-induced T lymphocytes depletion, several studies were performed as part of the presented thesis. First, the immune cell infiltration in a large cohort of 146 ACC specimens was investigated. It was demonstrated for the first time, and against the common assumption, that ACCs were infiltrated not only by FoxP3+ regulatory T cells (49.3 %), but also that a vast majority of tumor samples was infiltrated by CD4+ TH cells (74 %) and CD8+ cytotoxic T cells (84.3 %), albeit the immune cell number varied heterogeneously and was rather low (median: 7.7 CD3+ T cells / high power field, range: 0.1-376). Moreover, the presence of CD3+-, CD4+- and CD8+ ACC-infiltrating lymphocytes was associated with an improved recurrence-free (HR: 0.31 95 % CI 0.11-0.82) and overall survival (HR: 0.47 96 % CI 0.25-0.87). Particularly, patients with tumor-infiltrating CD4+ TH cells without glucocorticoid excess had a significantly longer overall survival compared to patients with T cell-depleted ACC and hypercortisolism (121 vs. 27 months, p = 0.004). Hence, the impact of glucocorticoids might to some extent be responsible for the modest immunogenicity in ACC as hypercortisolism was reversely correlated with the number of CD4+ TH cells. Accordingly, CD3+ T cells co-cultured with steroidogenic NCI-H295R ACC cells demonstrated in vitro an enhanced anti-tumoral cytotoxicity by secreting 747.96 ±225.53 pg/ml IFN-γ in a therapeutically hormone-depleted microenvironment (by incubation with metyrapone), versus only 276.02 ±117.46 pg/ml IFN-γ in a standard environment with glucocorticoid excess. Other potential biomarkers to predict response to immunotherapies are the immunomodulatory checkpoint molecules, programmed cell death 1 (PD-1) and its ligand PD-L1, since both are targets of antibodies used therapeutically in different cancer entities. In a subcohort of 129 ACCs, expressions of both molecules were heterogeneous (PD-1 17.4 %, range 1-15; PD-L1 24.4 %, range 1 - 90) and rather low. Interestingly, PD-1 expression significantly influenced ACC patients´ overall (HR: 0.21 95 % CI 0.53-0.84) and progression- free survival (HR: 0.30 95 % CI 0.13-0.72) independently of established factors, like ENSAT tumor stage, resection status, Ki67 proliferation index and glucocorticoid excess, while PD-L1 had no impact. In conclusion, this study provides several potential explanations for the heterogeneous results of the immune checkpoint therapy in advanced ACC. In addition, the establishment of PD-1 as prognostic marker can be easily applied in routine clinical care, because it is nowadays anyway part of a detailed histo-pathological work-up. Furthermore, these results provide the rationale and will pave the way towards a combination therapy using immune checkpoint inhibitors as well as glucocorticoid blockers. This will increase the likelihood of re-activating the immunological anti-tumor potential in ACC. However, this will have to be demonstrated by additional preclinical in vivo experiments and finally in clinical trials with patients. / Das Nebennierenrindenkarzinom (ACC) ist ein seltenes, aber äußerst aggressives endokrines Malignom. Ein tumorbedingter Hyperkortisolismus liegt bei 60 % der Patienten vor und ist mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Während Krebsimmuntherapien die Behandlung vieler Krebsentitäten revolutioniert haben, waren die Ergebnisse der ersten Studien zu verschiedenen Immun-Checkpoint-Inhibitoren beim ACC heterogen. Die fünf klinischen Studien mit insgesamt 121 Patienten zeigten ein objektives Ansprechen bei nur 17 Patienten. Eine Studie von Raj et al. berichtete über eine klinisch bedeutsame Krankheitskontrollrate von 52 % und ein medianes Gesamtüberleben von fast 25 Monaten. Diese beträchtliche Anti-Tumor-Aktivität legt nahe, dass eine Subgruppe von ACC-Patienten von immuntherapeutischen Ansätzen profitieren könnte. Der Hypothese folgend, dass einige ACCs durch eine Glukokortikoid-induzierte T Lymphozyten-Depletion gekennzeichnet sind, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit mehrere Studien durchgeführt. Zunächst wurde die Immunzellinfiltration in einer großen Kohorte von 146 ACC-Proben untersucht. Entgegen der verbreiteten Annahme konnte erstmals gezeigt werden, dass ACCs nicht nur von FoxP3+ regulatorischen T Zellen (49,3 %), sondern die Mehrheit der ACCs von CD4+ TH (74 %) und CD8+ zytotoxischen T Zellen (84,3 %) infiltriert wurde, wenngleich die Immunzellanzahl heterogen und eher gering war (7,7 CD3+ T Zellen/HPF). Darüber hinaus war die Präsenz von CD3+-, CD4+- und CD8+ ACC-infiltrierenden Lymphozyten mit einem rezidivfreien (HR:0,31;95%CI0,11-0,82) und verbesserten Gesamtüberleben (HR:0,47;95%CI 0,25-0,87) assoziiert. Insbesondere Patienten mit tumorinfiltrierenden CD4+ TH Zellen ohne Glukokortikoid-Überschuss hatten im Vergleich zu Patienten mit T Zell-depletiertem ACC und Hyperkortisolismus ein signifikant län- geres Gesamtüberleben (121 vs. 27 Monate; p = 0.004). Daher könnte die Wirkung von Glukokortikoiden für die moderate Immunogenität verantwortlich sein, da Hyperkortisolismus umgekehrt mit der Zahl der CD4+ TH Zellen korreliert war. Dementsprechend zeigten CD3+ T Zellen, die mit steroid-produzierenden NCI-H295R ACC-Zellen co-kultiviert wurden, in vitro eine erhöhte anti-tumorale Zytotoxizität in einem durch Metyrapon-induzierten Mikromilieu ohne Glukokortikoide im Vergleich zu einem Glukokortikoid- Überschuss (IFN-γ Sekretion: 747,96 pg/ml vs. 276,02 pg/ml). Andere potenzielle Biomarker zur Vorhersage des Ansprechens auf Immuntherapien sind die immunmodulatorischen Checkpoint-Moleküle, Programmed cell death 1 (PD-1) und sein Ligand PD-L1, da beide Ziele von Antikörpern sind, die therapeutisch bei verschiedenen Krebsentitäten eingesetzt werden. In einer Subkohorte von 129 ACCs waren die Expressionen beider Moleküle heterogen (PD-1 17,4 %, PD-L1 24,4 %). Interessanterweise beeinflusste die PD-1-Expression signifikant das Gesamtüberleben (HR: 0,21; 95 % CI 0,53-0,84) und das progressionsfreie Überleben (HR: 0,30; 95 % CI 0,13-0.72) unabhängig von etablierten Faktoren, wie dem ENSAT Tumorstadium, Resektionsstatus, Ki67 Proliferationsindex und Glukokortikoid-Überschuss, während PD-L1 keinen Einfluss hatte. Zusammenfassend liefert diese Studie mehrere mögliche Erklärungen für die heterogenen Ergebnisse der Immun-Checkpoint-Therapie bei fortgeschrittenem ACC. Darüber hinaus ist die Etablierung von PD-1 als prognostischer Marker anwendbar als Teil einer detaillierten histo-pathologischen Untersuchung. Zudem liefern diese Ergebnisse die Rationale und ebnen den Weg für eine Kombinationstherapie von Immun-Check- point-Inhibitoren sowie Anti-Glukokortikoiden, um die Wahrscheinlichkeit einer Reaktivierung des immu- nologischen Anti-Tumor-Potenzials beim ACC zu erhöhen. Dies muss jedoch durch zusätzliche präklinische in vivo Experimente und schließlich in klinischen Studien mit Patienten nachgewiesen werden.

Trotz einer multimodalen Standardtherapie des Glioblastoma multiforme bestehend aus Resektion, Bestrahlung (IR) und Chemotherapie gehört der WHO Grad IV Tumor mit einer medianen Überlebensrate von nur 14 bis maximal 48 Monaten zu den unheilbaren Tumorentitäten. Die Erweiterung des Therapiestandards um eine Immuntherapie und Photodynamische Therapie könnte die Prognose der Patienten in Zukunft verbessern. Ziel dieser Arbeit war es, eine effektive murine dendritische Zellvakzine zu generieren. Durch die Vorbehandlung der Tumorzellen mit THPTS-PDT und/oder Bestrahlung sollte eine optimale tumorspezifische Aktivierung von Immunzellen induziert werden.

Die vergangenen Jahre haben eindrucksvoll gezeigt, dass CD19 und BCMA chimäre Antigen-Rezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien nicht nur das Potential haben, die progres¬si-ons¬freie Überlebenszeit von Patienten mit hämatologischen Neoplasien zu verlängern, sondern auch diese erkrankten Menschen in einigen Fällen dauerhaft zu heilen. Trotz der noch immer bestehenden großen Herausforderung CAR-T-Zell-Therapien für mehr Tumorentitäten verfügbar zu machen, insbesondere was die Bekämpfung solider Tumore betrifft, haben die Entdeckung neuer Tumorantigene und Checkpoint-Inhibitoren in den letzten Jahren dazu beigetragen, dass sich immuntherapeutische Ansätze, insbesondere die der adoptiven Immunzelltherapie stetig weiterentwickeln konnten. Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene maligne Bluterkrankung mit schlechten Überlebens¬prognosen und die am häufigsten auftretende Leukämieform bei Erwachsenen. AML ist somit eine der hämatologischen Krebserkrankungen, die noch immer dringend medizini¬sche Innovation benötigt. CAR-T-Zell-Therapien gelten als attraktive neue Strategie, um AML zu bekämpfen, da die leukämischen Blasten empfindlich für T-Zell-vermittelte Lyse sind. In dieser Studie stellen wir Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin (Siglec) 6 als neues Zielmolekül für CAR-T-Zell-Therapien in AML vor. Wir entwickelten einen Siglec 6-spezifischen CAR mit einer vom humanen monoklonalen Antikörper JML 1 abgeleiteten Antigen-bindenden Domäne. Unsere Untersuchungen ergaben, dass Siglec 6 auf AML-Zelllinien als auch primären AML-Blasten sowie leukämischen Stamm¬zellen (LSCs) detektierbar ist. Die Behandlung mit Siglec 6 CAR-T-Zellen vermittelte eine anti-leukämische Reaktivität, die mit der Siglec 6-Expressionsstärke in präklinischen Modellen korrelierte. So bewirkten Siglec 6 CAR-T-Zellen eine komplette Remission in einem Xenograft-AML-Modell mit immundefizienten Mäusen und Tumorzellen mit hoher Siglec 6-Expression (NSG/U937). Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass Siglec 6 nicht auf gesunden hämatopoetischen Stamm(vor)läuferzellen (HSC/Ps) exprimiert wird. Unsere Daten legen damit nahe, dass die Siglec 6 CAR-T-Zell-Therapie zur AML-Behandlung eingesetzt werden kann, ohne dass eine nachfolgende hämatopoetische Stammzelltransplantation notwendig wird. In gesunden Blutzellen detektierten wir Siglec 6 auf einer Fraktion naiver B-Zellen und B-Gedächtniszellen sowie basophiler Gra¬nulozyten, sodass insgesamt mit einer limitierten On-Target Off-Tumor-Reaktivität ge¬rechnet werden kann. Die fehlende Siglec 6-Expression auf gesunden HSC/Ps ist ein sig¬nifikantes Unterscheidungsmerkmal zur Expression anderer zuvor untersuchter AML-CAR-Antigene wie CD33 oder CD123. Auch CD70 wird von HSC/Ps nicht exprimiert und wurde in dieser Studie als möglicher Kombinationspartner für duales Targeting in AML evaluiert. Dabei konnten wir feststellen, dass mehrheitlich mindestens eines der beiden CAR-Antigene, Siglec 6 oder CD70, von AML-Zelllinien und primären AML-Zellen expri¬miert wird. Ebenso ließ sich experimentell bestätigen, dass Siglec 6 CAR-T-Zellen mit JML 1-single chain variable fragment (scFv) und jeweils optimierten CAR-Spacersequen¬zen, keine signifikanten Funktionalitätsunter¬schiede aufweisen. Die Vorbehandlung von AML-Zellen mit Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitoren konnte die zytolytische Aktivität der Siglec 6 CAR-T-Zellen durch Steigerung der Siglec 6-Oberflächenexpression auf den Targetzellen erhöhen. Sowohl Siglec 6 als auch CD70 CAR-T-Zellen konnten erfolgreich mit virusfreiem Gentransfer hergestellt werden, wobei die getesteten CD70 CAR-Kon¬strukte aufgrund der CD70-Expression aktivierter T-Zellen zu Fratricide führten und die CAR-Antigen-abhängige als auch unabhängige Proliferation der CD70 CAR-T-Zellen limitierte. Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass sowohl Siglec 6 als auch CD70 hilf¬reiche Targetantigene zur CAR-T-Zellbehandlung der AML sein können und dass eine klinische Überprüfung, insbesondere von Siglec 6 CAR-T-Zellprodukten, gewährleistet ist. / In recent years, it could be impressively demonstrated that CD19 and BCMA chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies not only have the potential of prolonging progression-free and overall survival of patients with hematological malignancies, but in many cases are even able to cure them. Despite major challenges still hampering the broad applicability of CAR T-cells therapies, especially in the combat against solid tumors, the discoveries of novel tumor antigens and checkpoint inhibitors in past years have contributed to the steady development of immunotherapeutic approaches particularly those of adoptive immune cell therapy. Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous malignant blood disorder with poor survival prognosis that accounts for the most common form of leukemia in adults. Hence, AML is still one of the hematologic cancers with high unmet medical need. CAR T-cell therapies are considered an attractive new strategy to tackle AML as leukemic blasts are susceptible to T-cell-mediated lysis. In this study, we introduce sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin (Siglec)-6 as a novel target for CAR T-cell treatment in AML. We developed a Siglec-6-specific CAR with an antigen-binding domain derived from the human monoclonal antibody JML-1. Our studies revealed that Siglec-6 is detectable on AML cell lines as well as primary AML blasts and leukemic stem cells (LSCs). Siglec-6 CAR T-cell treatment conferred anti-leukemic reactivity that correlated with Siglec-6 expression levels in preclinical models. Thus, Siglec-6 CAR T-cells induced complete remission in a xenograft AML model with immunodeficient mice and engrafted tumor cells with high Siglec-6 expression (NSG/U937). Furthermore, we observed that Siglec-6 is not expressed on healthy hematopoietic stem/precursor cells (HSC/Ps). Our data suggest that Siglec-6 CAR T-cell therapy can be effectively used for AML treatment without the need for subsequent hematopoietic stem cell transplantation. In healthy blood cells, we detected Siglec-6 on a fraction of naïve and memory B cells as well as on basophilic granulocytes, therefore overall on-target off-tumor reactivity may be expected to be limited. The lack of Siglec-6 expression on healthy HSC/Ps is a significant distinctive feature from the expression of other previously studied AML CAR antigens e.g. CD33 or CD123. Also, CD70 is not expressed by HSC/Ps and was evaluated in this study as potential combination partner for dual targeting in AML. We found that the majority of AML cell lines and primary AML cells are expressing at least one of the two antigens, either Siglec-6 or CD70. We also confirmed that Siglec-6 CAR T-cells with JML-1-single chain variable fragment (scFv) and two optimized CAR spacer sequences did not show significant differences in function. Pretreatment of AML cells with histone deacetylase (HDAC) inhibitors could augment cytolytic activity of Siglec-6 CAR T-cells by increasing Siglec-6 surface expression on AML target cells. Both, Siglec-6 and CD70 CAR T-cells were successfully manufactured via non-viral gene transfer, whereby tested CD70 CAR constructs induced fratricide due to CD70 expression of activated T-cells resulting in limited CAR antigen-dependent as well as antigen-independent proliferation of CD70 CAR T-cells. In summary, this study suggests that Siglec-6 as well as CD70 may be useful target antigens for CAR T-cell treatment of AML and warrants clinical investigation of Siglec-6 CAR T-cells in particular.

Humane oder humanisierte monoklonale Antikörper haben sich in den letzten zehn Jahren als Arzneimittel etabliert. Sie sind hochspezifisch und zeigen in ihrer Anwendung im Vergleich zu konventionellen Therapeutika viel weniger Nebenwirkungen. In den 80er Jahren gelang es am Pathologischen Institut der Universität Würzburg eine Reihe von humanen Antikörpern aus Patienten zu isolieren, die hochspezifisch mit malignen Zellen reagieren und diese sowohl in vitro als auch im experimentellen Tiermodel selektiv durch Induktion von Apoptose töten. Um die Wirkungsweise von monoklonalen Antikörpern in der Krebstherapie zu erhöhen, werden die meisten in Kombination mit herkömmlichen Methoden, wie Chemotherapie, eingesetzt. Die ideale Therapieform sind hinsichtlich der Nebenwirkungen sog. Cocktails aus verschiedenen monoklonalen Antikörpern. Allerdings sind die Studien hierzu noch wenig fortgeschritten. Das Ziel dieser Arbeit war es, in präklinischen Versuchsreihen den Einsatz verschiedener tumorspezifischer humaner monoklonaler Antikörper als Cocktail und in Kombination mit Chemotherapie zu evaluieren. Hierzu wurden neun Antikörper in 32 verschiedenen Antikörperkombinationen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die in vitro Proliferation einer Pankreaskarzinom-Zellinie untersucht. In Immunfluoreszenz-Aufnahmen ließ sich zeigen, dass kombinierte Antikörper an unterschiedlichen Stellen an der Zelle binden, was eindeutig auf verschiedene Zielstrukturen hinweist. Einige werden dabei endozytiert, während andere auf der Zellmembran bleiben. Interessanterweise ließen sich Kombinationen identifizieren, deren antiproliferative Wirkung sowohl additiv als auch synergistisch ist, das heißt größer als die Summe ihrer Einzelaktivitäten. Wurden Antikörper mit Zytostatika (5-Flurouracil) kombiniert, so ließen sich ebenfalls synergistische Effekte beobachten. In FACS-Analysen zeigt sich ein gesteigertes Bindungsverhalten der Antikörper, wenn die Zellen mit 5-FU vorinkubiert wurden. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die Beobachtung, dass die Wirkung humaner monoklonaler Antikörper in Kombination mit Chemotherapie erhöht werden kann. Für die Zukunft humaner Antikörper als Therapiemittel gegen maligne Erkrankungen mag allerdings noch wichtiger sein, dass Antiköper in Cocktails tatsächlich synergistische Wirkung zeigen können. / Cancer patients receiving antibodies as mono-therapy have benefited from these treatments. However, significant improvements could be made if the antibodies were used in combination with conventional chemotherapy. Having learned from the natural oligoclonal antibody response that cancer patients mount to their own tumours, we suppose that cocktails of monoclonal antibodies could be even more active in treating cancer. We have isolated a series of human monoclonal IgM antibodies from cancer patients, which bind to different tumor-specific surface receptors and induce apoptosis in vitro and in vivo. To study the antibody-mediated effects in cocktails, the antibodies were applied in different combinations to pancreas carcinoma cells and analyzed in cytotoxic assays. Depending on their target, it was found that some combinations showed a significant additive or synergistic killing effect, when compared to mono-therapy. We also investigated a combinatorial treatment with chemotherapy on pancreas and colon cancer cells and found that a pretreatment with 5-FU sensitizes the cancer cells to antibody treatment. Based on our own results and data from other laboratories, it is likely that the next phase of antibody immunotherapy will include cocktails of monoclonal antibodies.

Das Neuroblastom ist ein vom sympathischen Nervensystem ausgehender neuroektodermaler maligner Tumor des Kleinkindesalters. Bei über 50% der Neuroblastom-Ersterkrankungen liegt bereits das disseminierte Stadium 4 vor, das eine infauste Prognose hat. Eine wirksame Behandlung des Stadium 4 Neuroblastoms stellt deshalb nach wie vor eine der größten Herausforderungen der pädiatrischen Onkologie dar: Die Gesamtüberlebensrate von 20-25% der Kinder, die an dieser bösartigen Krankheit leiden, konnte während der letzten zwei Jahrzehnte trotz neuer Chemotherapie-Protokolle nicht wesentlich verbessert werden. Aus diesem Grund gibt es zunehmend Bestrebungen sich um Therapiealternativen zu bemühen. In dieser Arbeit werden die derzeit möglichen immunologischen Strategien zur Behandlung des Neuroblastoms abgehandelt. / Neuroblastoma is a neuroectodermal malignancy of early childhood derived from sympathetic nervous tissue. At initial diagnosis over 50% of patients present with disseminated stage 4 disease which has a dismal prognosis. Effective treatment of patients with stage 4 neuroblastoma remains a major challenge in pediatric oncology. Despite novel therapeutic approaches including chemotherapy and autologous stem cell transplantation the overall survival rate of only 20-25% did not improve over the last two decades. Therefore, a lot of effort has been made to develop novel alternative therapies. This thesis summarizes possible immunotherapeutic strategies for the treatment of neuroblastoma.

Die Studie auf die diese Arbeit aufbaut untersuchte die Immunogenität einer Wilms-Tumorgenprodukt-1-(WT1)-Peptid-Vakzinierung bei Patienten mit einer WT1-exprimierenden akuten myeloischen Leukämie (AML) ohne weitere Behandlungsoption. Trotz dem initalen immunologischen, molekularen und vorläufigen Nachweis einer möglichen klinischen Effektivität bei AML-Patienten, konnte nur in wenigen Fällen eine längerfristige Wirksamkeit dokumentiert werden. Es ist bekannt, dass eine Krebs-Immuntherapie durch Immunevasions-Mechanismen des Tumors beeinträchtigt werden kann. Da Analysen zu Mutationen oder Verlust des WT1-Epitops oder Epitop-flankierender Sequenzen keine Auffälligkeiten zeigten, konnte eine reduzierte Präsentation oder Erkennung des Epitops ausgeschlossen werden. Aus diesem Grunde sollte diese Arbeit weitere mögliche Immunevasions-Mechanismen identifizieren. Als Grundlage wurden Tumor-assoziierte Effekte, immunmodulatorische Faktoren und funktionelle Einschränkungen der Immunzellen in den Mittelpunkt der Untersuchungen gestellt. Die ermittelten Daten zeigen, dass in unserem spezifischen Therapieansatz, der wiederholten Vakzinierung von AML-Patienten mit einem HLA-A201-restringierten WT1126–134 -Epitop in Kombination mit GM-CSF und KLH, eine eingeschränkte T-Zell-Funktionalität einen wesentlichen Grund für die beobachtete verminderte Therapieeffizienz darstellt. Immunresistenzmechanismen leukämischer Blasten spielen hierbei keine übergeordnete Rolle, individuelle Effekte können aber nicht ausgeschlossen werden. Ebenso scheint es, dass auch die Präsenz von immunregulatorischen Zellen wie Tregs oder MDSCs nicht durch die Vakzinierung manipuliert wird und dass diese keinen generellen Einfluss auf die Therapieeffizienz ausüben. / The foregoing study investigated the immunogenicity of Wilms’ tumor gene product 1 (WT1)-peptide vaccination in WT1-expressing acute myeloid leukemia (AML) patients without curative treatment option. Despite the first immunologic, molecular, and preliminary evidence of potential clinical efficacy in AML patients, only in a few cases long-lasting responses could be documented. It is known that enduring efficacy of cancer vaccines may be limited due to immune escape mechanisms. On this account, we chose to work on three front lines: Investigations of immune modulatory counter-attack-mechanisms of the tumor, functional deficiencies of the T cell compartment and the presence of immune regulatory cells. The generated data demonstrates that in our specific setting, in which AML patients received consecutive vaccinations with HLA-A201-restricted WT1126–134 epitope together with GM-CSF and KLH, impaired vaccine efficacy is mainly attributed to restricted T cell functionality. Immune resistance mechanism exerted by leukemic blasts do not generally influence clinical outcome in our setting, neither do inert immunoregulative mechanisms like Treg or MDSC, respectively.

Die allogene Stammzelltransplantation ist das Therapieverfahren der Wahl für eine Reihe von malignen und nicht-malignen Erkrankungen des hämatopoetischen Systems. Dies ist darin begründet, daß dieses Verfahren nicht nur die Applikation einer myeloablativen und somit maximalen zytostatischen Therapie erlaubt (oder daß sie verbunden ist dem kompletten Ersatz der Empfängerhämatopoese durch den Spender), sondern vor allem dadurch, daß sie mit einem immunologisch vermittelten Anti-Tumor-Effekt, der Graft-versus-Leukämie-Reaktion (GVL) verbunden ist. In der Klinik ist die Anwendung der allogenen Stammzelltransplantation durch die assoziierten schwerwiegenden Komplikationen, zur Zeit noch erheblich eingeschränkt. Ziel dieser Arbeit war es die Mechanismen dieser T-zellvermittelten anti-Leukämie-Reaktion näher zu untersuchen. Im Mausmodell nach nicht-myeloablativer Konditionierung und alloegenr Kncohenmarktransplantation konnte gezeigt werden, dass die GVL-Reaktion welche durch die Spenderlympozyten vermittelt wird Alloantigen-abhänig ist, da sie in gemischten Chimären wesentlich stärker ausgeprägt ist als in vollen Chimären und ohne dass es zur entwicklung einer GVHD kommt..Weiterhin konnte gezeigt werden, dass diese Alloantigen-abhängige GVL-Reaktion nur kurzlebig ist, keine andauernde Immunität hinterlässt und dieser Verlust an GVL-reaktivität assoziiert ist mit dem verschwinden dieser alloreaktiven T-Zellpopulation. / Allogeneic stem cell transplantation is the treatment of choice for a number of malignant and benign hematological diseases. This is due to the fact that this procedure not only allows the administration of a myeloablative and thus maximal cytoreductive therapy, but leads also to the substitution of the recipient hematopoiesis with the donor hematopoeisis. More important however, is the fact that this type of therapy is associated with a significant immunologically-mediated T-cell-dependent anti-tumor response the so called graft-versus - leukemia-reaction (GVL). However, the extensive use of allogeneic stem cell transplantation has been prevented by the considerable treatment-elated morbidity and mortality associated with allogeneic transplantation and the development of Graft-versus-Host-disease (GVHD). Using mouse models it could be observed that in mice following conditioning and allogeneic bone marrow transplantation donor lymphocyte-mediated GVL responses are primarily driven by direct immune recognition of host alloantigen. Furthermore, it could be shown that this GVL response is only transient and that the loss of this GVL effect occurs concomitantly with the contraction of the alloantigen-reactive T cell population.