A criptococose é uma micose profunda causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans, um basidiomiceto que geralmente acomete pacientes imunocomprometidos. A infecção primária é pulmonar, ocorrendo posteriormente sua disseminação para outros sítios anatômicos, sendo a meningoencefalite a forma clínica mais comum e também a maior causa de morte por esta infecção. A grande proporção de humanos infectados ocorre em pacientes imunocomprometidos embora também possa causar infecção em indivíduos hígidos. Este estudo teve como objetivo geral a avaliação da prevalência de anticorpos de classe IgG frente a dois extratos protéicos da levedura C. neoformans: uma amostra ATCC sorotipo A e um isolado clínico recente da levedura C. neoformans var. grubii. Foram analisadas 26 amostras de soro de pacientes com criptococose, provenientes da soroteca do Laboratório de Micologia do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). Também fazem parte desta investigação de soroprevalência, 24 amostras de soro de trabalhadores em laboratório de pesquisa, que manipulam a levedura C. neoformans e 48 pacientes pediátricos atendidos no ambulatório do Hospital Trombudo, no município de Vale do Sol. A resposta imune humoral de anticorpos de classe IgG contra antígenos protéicos de C. neoformans apresentou um grande número de proteínas reconhecidas pelos soros de pacientes com criptococose e dos trabalhadores em laboratório onde a levedura é manipulada. A massa molecular dos principais antígenos imunodominantes reconhecidos foi de aproximadamente 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 e 110 kDa. Estes principais antígenos identificados podem tornar-se de grande relevância para a elaboração de testes diagnósticos, identificação de possíveis alvos, elaboração de vacinas e para avaliação do estado imunitário em relação ao desenvolvimento da criptococose. / Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that causes life-threatening meningoencephalitis in HIV positive patients, and in patients subjected to immunosuppressive therapies. The objective of this study was to investigate the profile of immune humoral responses to C. neoformans proteins by means of the analysis of sera from three groups consisting of 48 children, 24 laboratory workers, and 26 patients with acute cryptococcal meningitis. The results of latex polysaccharide antigen detection were positive and similar to the ones from the culture of cerebrospinal fluid (CSF) for fungal infection in all 26 patients. Analysis of the IgG antibody response to protein antigens by ELISA revealed different levels of recognition when comparing protein extracts originated from American Type Culture Collection (ATCC), and a Brazilian strain recently isolated in a clinical sample of CSF (P<0,05). Reactivity to C. neoformans proteins analysed by Western blot showed ten antigens which were more frequently recognized with a relative molecular mass of approximately 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 and 110 kDa. The differences in sera antigen recognition were minimal when comparing different protein extracts. The identification of these antigens decreased by absorbing the sera with C. neoformans extracts. Periodate treatment reduced the intensity of antigen recognition, but did not eliminate reactivity to any individual antigen. Strain and host factors were important when studying the immune response to C. neoformans infection. Our findings support clinical and epidemiological data showing differences in the susceptibility to cryptococcosis, and the use of these techniques may be a powerful tool to evaluate the human population in serological studies.

Orientador: Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T17:56:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Farias_AlessandrodosSantos_M.pdf: 12791699 bytes, checksum: d944ad5362f5af1484e5d9a39b4c8a00 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A Esclerose múltipla (EM) é doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC) que mais acomete adultos jovens. Baseado principalmente nas similaridades clínicas e histopatológicas a Encefalomielite experimental auto-imune (EAE) tem sido usada extensivamente como modelo de estudo da EM. A EAE é uma doença auto-imune, que pode ser induzida em animais suscetíveis, pela imunização com mielina ou alguns componentes da mielina ou ainda por transferência adotiva de linfócitos T CD4 do tipo Th1. Os linfócitos Thl produzem preferencialmente citocinas pró-inflamatórias como LFNy, TNFa e linfotoxina (TNFP). Assim, a EAE é caracterizada histologicamente pela presença de células mononucleares no SNC, dano na bainha de mielina e dos oligodendrócitos. Embora as principais células envolvidas EAE sejam linfócitos T, células mononucleares como os macrófagos que migram dos órgãos linfóides periféricos para o SNC, assim como as células da glia, participam ativamente da reação inflamatória, que resulta no dano à bainha de mielina. Vários relatos sugerem a participação dos metabólitos do oxigênio, principalmente o óxido nítrico nos processos desmielinizantes. Há evidências mostrando o aumento na produção do NO via óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nas lesões desmielinizantes. No entanto, a participação do NO gera polêmica; por um lado as evidências apontam para o efeito neuroprotetor, enquanto outras mostram a atuação desse mediador na patogênese da EAE. O presente estudo, visa investigar o papel do NO, produzido via iNOS, na regulação da EAE, para isso utilizamos camundongos deficientes de iNOS ("knockout") e comparamos a evolução clínica e a presença de mediadores inflamatórios, com os animais correspondentes não modificados geneticamente. O animal "knockout" (iNOS-/-) apresentou significativa diminuição na evolução clínica, acompanhada da diminuição de células positivas para TNFa na lesão inflamatória, na fase aguda da doença. Trata-se de observação relevante pois o TNFa é citocina com comprovado efeito mielinotóxico. Esses resultados demonstram a fundamental contribuição do NO em associação com TNFa, no controle da EAE na fase aguda, também confirmam a importante participação dos macrófagos na patogênese EAE, nessa fase da doença, ainda que a EAE seja desencadeada por linfócitos TCD4. / Abstract: Multiple sclerosis (MS) is the most common human demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Based on the fact that it shares similarities in relation to course of the disease and histology, Experimental auto-immune encephalomyelitis (EAE) has been used extensively as an animal model for MS. EAE is a Thl cell-mediated autoimmune disease induced by immumzation with myelin components or by adoptive transfer of autoreactive T cells. This leads to a characteristic relapsing and remitting paralytic disease in mice model of EAE. The Thl cells, characteristically produce IL2, IFNy, TNFa and lymphotoxin (TNFp), which participate in the inflammatory reactions. Histological examination of the CNS generally reveals the presence of both a rich inflammatory mononuclear cell infiltrate and demyelination resulting from bystander activation of resident microglia and recruited, infiltrating monocytes. Antigen-presenting cells generate the reactive oxygen and nitrogen species that may damage different cell types. Despite knowledge about the induction and regulation of NO production, the role of NO in tissue in demyelination is highly controversial. While many investigators have concluded that NO is involved in the pathogenesis of EAE, others have reported quite oppositing protective effects. The present study was conducted to investigate the specific role of NO induced by iNOS in the regulation of EAE in iNOS knockout C57BL/6 and wild-type mice. A less severe form of the disease than did the wild type control mice was observed in the iNOS -/- mice. Although the levels of TNFa diminished in the periphery for both groups, an increase in the number of TNFa positive cells was detected in the central nervous system during the acute phase of EAE induced in the WT mice, whereas no production of TNFa was detected in the KO mice. These findings suggest that NO and TNFa contribute to the pathogenesis during acute EAE. / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientadores : Maria Heloisa Souza Lima Blotta, Albina Altemani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T16:56:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Neworal_ErikaPereiradeMoraes_M.pdf: 1962612 bytes, checksum: ae2a009b97927af866827de2f509b22b (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. Apresenta duas formas clínicas principais: a forma Adulta (FA) e a forma Juvenil (FJ). Com o objetivo de caracterizar a resposta inflamatória local na PCM, analisamos por imunoistoquímica, a população celular (CD4, CD8, CD15 e CD68), a expressão das citocinas TNF-a(fator de necrose tumoral alfa), TGF-b? (transforming growth factor beta), IL-10 (interleucina 10) e da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), em biópsias de mucosa oral de pacientes com a FA e linfonodos de pacientes com a FJ da PCM. De modo geral, as lesões caracterizaram-se pela presença de granulomas formados por células epitelióides e células gigantes (CD68+) circundados e permeados por linfócitos TCD4+ e TCD8+. Enquanto que em lesões de pacientes com a FJ da PCM havia predominância de células CD68+ (macrófagos, células epitelióides e gigantes), em pacientes com a FA foi observado infiltrado misto, composto por macrófagos, plasmócitos e neutrófilos. O número de células fúngicas encontradas nas lesões de linfonodos de pacientes com a FJ foi mais elevado do que em mucosa oral de pacientes com a FA da PCM. O número de células expressando TNF-a (macrófagos, neutrófilos e células gigantes) e iNOS (macrófagos) foi semelhante tanto em linfonodos, como em mucosa oral. Por outro lado, em linfonodos o número de células positivas para TGF-b e IL-10 foi acentuadamente maior. Em biópsias de pacientes com FA a expressão de iNOS foi observada em um número pequeno de macrófagos, distribuídos na periferia dos granulomas, e em pacientes com a FJ a expressão desta enzima foi observada em células gigantes e em macrófagos esparsos e em contato com as células do fungo. Os resultados obtidos sugerem que a produção aumentada de citocinas supressoras da ativação de macrófagos em lesões de pacientes com FJ da PCM pode estar contribuindo para a forma mais grave e disseminada da doença / Abstract: Paracoccidiodomycosis (PCM) is a deep mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, with high incidence in Brazil. In order to examine the immune response in lesional tissue of patients with PCM, we analyzed cytokines as well as the phenotype of cellular infiltrate. Paraffin-embedded tissue from oral mucosa of 8 patients with the localized adult form (AF) of PCM and lymph nodes of 10 patients with the juvenile form (JF) of PCM was analyzed by immunohistochemistry to detect tumor necrosis factor-a (TNF-a), inducible nitric oxide synthase (iNOS), transforming growth factor-b (TGF-b, and interleukin-10 (IL-10). In the lymph nodes the majority of inflammatory cells was CD68+ (macrophages, epithelioid and giant cells) while in the oral mucosa a mixed infiltrate with macrophages, plasma cells and neutrophils was detected. TNF-a as well as iNOS expression was similar in lymph nodes and oral mucosa, whereas TGF-b and IL-10 were observed in a higher number of macrophages, epithelioid and giant cells in the lymph nodes, where numerous yeast cells were visualized. The higher expression of anti-inflammatory cytokines (IL-10 and TGF-b) in lesions of patients with the JF of PCM (lymph nodes) may represent a mechanism by which the fungus evade the host immune response, contributing for a more severe and disseminated form of the disease / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Laura M. M. Ottoboni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T20:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SouzaFilho_GoncaloApolinariode_M.pdf: 4023775 bytes, checksum: e56b411d7a4dbe56f49298bfbd3061f5 (MD5) Previous issue date: 1994 / Mestrado / Genetica de Plantas / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Hélio José Montassier / Coorientador: Renata Fonseca Vianna Lopez / Banca: Cintia Hiromi Okino / Banca:Rafael Antonio Casarin Penha Filho / Banca: Edison Luiz Durigon / Banca: Rosangela Zacarias Machado / Resumo: Vacinação é a forma mais eficiente para prevenir e controlar a infecção pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI). Vacinas formuladas com nanopartículas de quitosana têm sido utilizadas como sistema de entrega de antígenos pela via mucosa e imunopotenciador. O objetivo do presente estudo foi desenvolver e avaliar a eficácia de uma vacina inativada formulada com o genótipo BR-I do VBI encapsulado em nanopartículas de quitosana (VBI-CS) administrada por via mucosa em aves. Além disso, objetivou-se comparar a eficácia da vacina desenvolvida com a de uma vacina inativada convencional do mesmo vírus incorporada a um adjuvante oleoso (Montanide ISA 71) (VBI-O), administrada por via intramuscular. Foram avaliadas as respostas imunes humoral e celular (RIC) nos compartimentos de mucosa e sistêmico induzidas pelas vacinas VBI-CS e VBI-O quando associadas ou não a uma vacina viva atenuada da estirpe H120 do VBI. A proteção induzida pelos diferentes protocolos vacinais foi avaliada após o desafio com a estirpe homóloga virulenta do genótipo BR-I. A vacina VBI-CS usada sozinha induziu altos níveis de anticorpos IgA anti-VBI na mucosa e também a expressão dos genes de RIC (CD8β, Granzima A e IFNγ) na traqueia, enquanto que associada a uma vacina viva atenuada heteróloga, induziu maiores níveis de anticorpos IgG anti-VBI (mucosa e sistêmico) e RIC caracterizada pelo aumento da expressão dos genes CD8β, Granzima A e IFNγ, principalmente na traqueia. Além disso, foi observado que os protocolo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Vaccination is the most efficient way to prevent and control infection caused by the infectious bronchitis virus (IBV). Vaccines formulated with chitosan nanoparticles have been used as an antigen delivery system in mucosal and immunopotentiator. The aim of this study was to develop and evaluate the efficacy of an inactivated vaccine formulated with IBV BR-I genotype encapsulated in chitosan nanoparticles (IBV-CS) administered by the mucosal route in chickens. In addition, this study aimed to compare the efficacy of the developed vaccine with a conventional inactivated vaccine of the same virus incorporated into oily adjuvant (Montanide ISA 71) (IBV-O) administered intramuscularly. The humoral and cellular (CMI) mediated immune responses in the mucosal and systemic compartments induced by IBV-CS and IBV-O vaccines were evaluated, when these vaccines were associated or not with a live attenuated H120 serotype vaccine. The protection induced by the different vaccine protocols was evaluated after the challenge with the virulent homologous strain of BR-I genotype. The IBV-CS vaccine used alone induced high levels of IgA anti-IBV antibodies in mucosal and also the expression of CMI genes (CD8β, Granzyme A and IFNγ genes) in the trachea, while associated with a live attenuated vaccine, it induced higher levels of IgG anti-IBV antibodies (mucosal and systemic compartments) and the expression of CMI genes, mainly in trachea. In addition, the vaccine protocols using the IBV-CS vaccine... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Geórgia Modé Magalhães / Banca: Claudia Momo / Banca: Pamela Rodrigues Reina Moreira / Banca: Daniela Bernadete Rozza / Resumo: No sistema nervoso central (SNC) a homeostase é mantida pelo contato célula a célula e por meio da expressão de receptores de membrana em neurônios, que se ligam a microglia para mantê-la em estado quiescente. Os astrócitos também contribuem com este processo, além disso, eles exercem inúmeras funções para a manutenção da imunotolerância local. Em situação de injúria, os astrócitos podem apresentar um efeito deletério, pois ativam a resposta imune e os efeitos da neuroinflamação e podem contribuir para o agravamento dos sinais clínicos neurológicos. Na cinomose canina, enfermidade infecciosa que pode cursar com desmielinização e inflamação no SNC, acredita-se que além do vírus, o processo inflamatório contribua com as lesões na substância branca. Portanto, os objetivos do presente estudo foram avaliar o papel dos astrócitos na encefalite causada pelo vírus da cinomose, por meio da imunodetecção de MHC-II, linfócitos T CD3, MMP9, MIF e GFAP nas áreas de desmielinização do encéfalo, a fim de verificar se estes achados podem estar relacionados à extensão ou gravidade das lesões encefálicas. Para isso realizou-se um estudo retrospectivo do arquivo de blocos de parafina, onde utilizouse 21 blocos de encéfalos (cerebelo) de cães naturalmente infectados com o vírus da cinomose (grupo infectado), bem como, encéfalos de cinco animais livres de doenças sistêmicas ou que afetem o SNC (grupo controle). Na análise imunohistoquímica das amostras verificou-se marcação aumentada de GFAP, MHC... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the central nervous system (CNS) homeostasis is maintained by cellto-cell contact and by the expression of membrane receptors on neurons, which bind to microglia to keep it in a quiescent state. Astrocytes also contribute to this process, in addition, they exert numerous functions for the maintenance of local immunotolerance. In a situation of injury, astrocytes may have a deleterious effect, since they activate the immune response and the effects of neuroinflammation and may contribute to the worsening of clinical neurological signs. In canine distemper, an infectious disease that can occur with demyelination and inflammation in the CNS, it is believed that in addition to the virus, the inflammatory process contributes to lesions in the white matter. Therefore, the objectives of the present study were to evaluate the role of astrocytes in encephalitis caused by the distemper virus, by immunodetection of MHC-II, CD3, MMP9, MIF and GFAP T lymphocytes in the areas of brain demyelination, in order to verify whether these findings may be related to the extent or severity of brain lesions. For this, a retrospective study of the paraffin block file was carried out, using 21 blocks of cerebellum from dogs naturally infected with the distemper virus (infected group), as well as the brains of five disease-free animals systemic or affecting the CNS (control group). In the immunohistochemical analysis of the samples, there was an increased marking of GFAP, MHC-II, MMP9 and MIF in the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Ureases são enzimas que catalisam a hidrólise de ureia para formar amônia e dióxido carbono, sendo produzidas por plantas, fungos e bactérias. A toxina de estudo, Jaburetox, é um peptídeo recombinante derivado de uma das isoformas de urease presentes em Canavalia ensiformis. Esta molécula mostrou toxicidade a insetos de diferentes ordens quando administrada oralmente ou por injeção e, além disso, apresenta atividades antifúngica e bacteriostática, não exibindo efeitos tóxicos para mamíferos, demonstrando um enorme potencial biotecnológico. Em estudos realizados com Rhodnius prolixus, um dos principais vetores da Doença de Chagas na América Latina, observamos que o Jaburetox é capaz de interagir com hemócitos, células do sistema imune. Concomitante a esta interação, também demonstramos que o peptídeo é capaz de induzir a agregação de hemócitos, característica da resposta celular, e também é capaz de aumentar a atividade da fenoloxidase (PO), enzima envolvida na resposta humoral dos insetos. Estes efeitos sugerem que o peptídeo é capaz de ativar o sistema imune dos insetos. Os insetos apresentam somente imunidade inata, sendo esta subdividida em resposta celular e humoral. A resposta celular, mediada por hemócitos, é caracterizada pela fagocitose, agregação e encapsulação de patógenos. Em contraste, a resposta humoral é representada pela produção de peptídeos antimicrobianos, melanização desencadeada pela enzima PO e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS). Recentemente, outro mecanismo de resposta imune inata tem sido estudado: as armadilhas extracelulares - Extracellular Traps (ETs), sendo bem caracterizadas em mamíferos, porém pouco estudadas em insetos. As ETs são armadilhas de ácidos nucleicos extracelulares associados a proteínas citoplasmáticas, que podem auxiliar na captura e na morte de patógenos. Essa resposta é desencadeada por receptores extracelulares de células granulares que induzem o aumento de Ca2+ intracelular, levando à produção de ROS, que parece ser parte fundamental para liberação dos ácidos nucleicos, permitindo com que estes passem para o citoplasma e associem-se com as proteínas. O presente estudo tem como objetivo avaliar o papel de ácidos nucleicos extracelulares na resposta imune e na proteção contra o peptídeo entomotóxico Jaburetox. As respostas imunológicas foram avaliadas por meio da contagem de agregados, através de hemocitômetro, e por ensaio colorimétrico para dosar alterações da resposta humoral, 6 e 18 h após injeção de Jaburetox e/ou RNA extracelular (RNAet). A liberação de RNA e DNA foi avaliada 6 h pós injeção de tratamentos para ensaios in vivo e 1 h pós incubação para ensaios in vitro, através do kit Qubit RNA HS e Qubit dsDNA HS. Para avaliar a liberação de ROS e viabilidade celular, realizamos culturas de hemócitos, que foram tratados por 24 h com Jaburetox. Por fim, avaliamos a imunocompetência dos insetos após tratamentos com Jaburetox, RNAet ou Jaburetox + RNAet e desafiamos o inseto contra uma bactéria patogênica. A hemolinfa dos insetos foi coletada e unidades formadoras de colônia foram mensuradas pelo método de drop-plate. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o RNAet é capaz de ativar as defesas do organismo, tanto celular quanto humoral e, quando associado à toxina, apresentam um efeito protetor. Jaburetox não foi capaz de induzir alterações na liberação de ácidos nucleicos em nenhuma das abordagens, mas modificou a liberação de ROS na dose de 6 M. A viabilidade celular não foi alterada em nenhuma das condições testadas. Nos ensaios de imunocompetência, observamos que o peptídeo modula a resposta do organismo, deixando-o mais susceptível a infecções. Os tratamentos com RNAet desencadeiam uma resposta protetora. Nossos dados sugerem que o RNAet modula as defesas do organismo de forma benéfica para combater patógenos, enquanto que o Jaburetox, nas condições testadas, não induz resposta imune através de ETs, mas torna o inseto mais susceptível a infecções por patógenos. Os presentes achados enfatizam a importância dos ácidos nucleicos extracelulares para as defesas imunológicas em insetos. Também elucidamos os efeitos desencadeados pelo peptídeo, aprimorando os conhecimentos referentes a esta toxina, enfatizando o potencial uso deste composto como um bioinseticida. / Ureases are enzymes that catalyze the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide, being produced by plants, fungi and bacteria. The studied toxin, Jaburetox, is a recombinant peptide derived from one of the urease isoforms present in Canavalia ensiformis. This molecule showed toxicity to insects of different orders when administered orally or by injection and, in addition, presents antifungal and bacteriostatic activities, not exhibiting toxic effects to mammals, demonstrating an enormous biotechnological potential. Studies with Rhodnius prolixus, one of the main vectors of Chagas' disease in Latin America, have shown that Jaburetox is capable of interacting with hemocytes, the cells of the immune system. Concomitant with this interaction, we also demonstrated that the peptide induces hemocyte aggregation, a characteristic of the cellular response, and is also capable of increasing the activity of phenoloxidase (PO), an enzyme involved in the humoral response in insects. These effects suggest that the peptide is able of activating the insect immune system. Insects present only innate immunity, which is subdivided into cellular and humoral responses. The cellular response, mediated by hemocytes, is characterized by phagocytosis, aggregation and encapsulation of pathogens. In contrast, the humoral response is represented by the production of antimicrobial peptides, melanization triggered by the PO enzyme and the production of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS). Recently, another mechanism of innate immune response has been studied: the Extracellular Traps (ETs), being well characterized in mammals, but little studied in insects. ETs consist of extracellular nucleic acids associated with cytoplasmic proteins that may aid in the capture and killing of pathogens. This response is triggered by extracellular granular cell receptors that induce the increase of intracellular Ca2+, leading to the production of ROS, which appear to play a key role in the release of nucleic acids, allowing them to pass into the cytoplasm and associate with proteins. The present study aims to evaluate the role of extracellular nucleic acids in the immune response and protection against the entomotoxic peptide Jaburetox. Immunological responses were evaluated by means of hemocytometer counting and by colorimetric assays to measure changes in the humoral response, 6 and 18 h after injection of Jaburetox and/or extracellular RNA (RNAet). The release of RNA and DNA was evaluated 6 h post injection of treatments for in vivo assays and 1 h post incubation for in vitro assays, using the Qubit RNA HS and Qubit dsDNA HS kits. In order to evaluate the release of ROS and 14 the cell viability, hemocyte cultures were treated for 24 h with Jaburetox. Finally, the immunocompetence was evaluated after treatment with Jaburetox, RNAet or Jaburetox + RNAet and challenging the insects with a pathogenic bacterium. Hemolymph of the insects was collected and colony forming units were measured by the drop-plate method. The results obtained in this work indicated that RNAet is able to activate the organism defenses, both cellular and humoral, and displays a protective effect when associated with the toxin. Jaburetox was not able to induce changes in the release of nucleic acids in any of the approaches, but modified the release of ROS at the dose of 6 μM. Cell viability was not altered in any of the conditions tested. In the immunocompetence assays, we observed that the peptide modulates response of the organism, making it more susceptible to infections. RNAet treatments elicit a protective response. Our data suggest that RNAet modulates the insect defenses in a beneficial way to fight pathogens, while Jaburetox, in the conditions tested, does not induce an immune response through ETs, but makes the insect more susceptible to pathogen infections. The present findings emphasize the importance of extracellular nucleic acids for immune defenses in insects. We also elucidate the effects triggered by the peptide, improving the knowledge regarding this toxin, reinforcing its potential use as a bioinsecticide.

Jaburetox é um peptídeo recombinante (~11 kDa) derivado de uma das isoformas de ureases da planta Canavalia ensiformis, popularmente conhecida como feijão-de-porco. O peptídeo induz efeitos variados em diferentes ordens de insetos, incluindo interferência na contração muscular em baratas da espécie Nauphoeta cinerea, ativação do sistema imunitário do vetor da doença de Chagas, Rhodnius prolixus e também, modula a atividade da enzima UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase (UAP) e da óxido nítrico sintase (NOS) no sistema nervoso central de R. prolixus e Triatoma infestans. Além disso, quando injetado, o Jaburetox é letal para ninfas de R. prolixus e insetos adultos de T. infestans. No presente trabalho foi avaliado o efeito inseticida do Jaburetox em baratas adultas da espécie N. cinerea, assim como, exploramos os efeitos induzidos pelo peptídeo no sistema nervoso central, focando na atividade enzimática das enzimas UAP, NOS, fosfatases ácidas (ACP) e acetilcolinesterase (AChE). Os ensaios enzimáticos foram realizados após tratamentos in vivo e in vitro com o Jaburetox, utilizando homogenatos de sistema nervoso central. Técnicas espectrofotométricas foram utilizadas para mensurar a atividade enzimática e a expressão proteica foi avaliada através de Western blot. Para o ensaio inseticida, Jaburetox foi administrado via oral e via injeção no inseto, utilizando uma dose de 50 μg de Jaburetox por g de inseto, ou o mesmo volume de tampão como controle. Em N. cinerea, ambos os tratamentos, in vivo e in vitro, inibiram parcialmente a atividade da NOS, sem modificar os níveis proteicos da mesma. Nenhuma alteração foi observada nos níveis da ACP após tratamentos com Jaburetox. A enzima UAP apresentou diminuição da atividade após 18 h de tratamento in vivo com o Jaburetox. Além disso, em todos os tratamentos in vivo com o peptídeo foi observado um aumento da atividade da AChE, sugerindo um possível mecanismo de resposta aos inseticidas. Contudo, mesmo após injeção e ingestão de Jaburetox as baratas adultas não tiveram taxas de mortalidade significativas, indicando resistência ao efeito inseticida do peptídeo. Em suma nossos resultados sugerem que o Jaburetox afeta as vias nitrinérgica, assim com a atividade da UAP e da AChE na barata. O fato do peptídeo afetar diferentemente as atividades enzimáticas dos R. prolixus e da N. cinerea podem explicar o porquê as baratas não são susceptíveis ao Jaburetox. / Jaburetox is a recombinant peptide (~11 kDa) derived from one of the Canavalia ensiformis (Jack bean) urease isoforms. The peptide induces several effects on insects of different orders, including the interference on muscle twitch tension in the cockroach Nauphoeta cinerea, the activation of the immune system in the Chagas’ disease vector Rhodnius prolixus, and the modulation of the enzyme activities of the UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase (UAP) and nitric oxide synthase (NOS) in the central nervous system of R. prolixus and the related triatomine Triatoma infestans. Moreover, when injected, the peptide is lethal for R. prolixus nymphs and T. infestans adults. Here, we evaluated the insecticidal effect of Jaburetox on N. cinerea adult cockroaches and explored the effects induced by Jaburetox on the central nervous system, focusing on the enzymatic activities of UAP, NOS, acid phosphatases (ACP), and acetylcholinesterase (AChE). The enzymatic experiments were performed after in vitro and in vivo treatments with Jaburetox using central nervous system homogenates from adult cockroaches. Spectrophotometric assays were employed to measure the enzyme activities and the protein expression of UAP and NOS was evaluated by Western blot. The insecticidal assay was conducted by injection and ingestion of 50 μg of Jaburetox per g of insect or the same volume of buffer for the controls. In N. cinerea, both in vivo and in vitro treatments with the peptide partially inhibited the activity of NOS, without modifying the protein levels. No alterations on ACP activity were observed upon Jaburetox treatment. In addition, the enzyme activity of UAP only had its activity affected at 18 h after injection. The peptide increased the AChE activity, suggesting a possible mechanism involved in overcoming the toxic effects of the insecticide. Moreover, the cockroaches did not die after Jaburetox injection and ingestion, indicating resistance to the toxic action of the peptide. Taken together, our findings indicate that Jaburetox alters the nitrinergic signaling as well as the AChE and UAP activities. The fact that Jaburetox affects differently the enzyme activities in R. prolixus and N. cinerea may explain why the cockroach is not susceptible to the lethal effect of the peptide.

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Metodologia: A amostra foi composta por 707 indivíduos adultos submetidos ao exame de cateterismo cardíaco no Hospital Bruno Born, de Lajeado, RS. Todos os indivíduos assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido e responderam a um questionário semiestruturado. Os indivíduos foram classificados entre casos e controles, por um médico cardiologista, com base no seguinte critério: presença de estenose, com comprometimento maior do que 50%, em pelo menos uma das artérias coronárias. Foram também coletadas amostras de sangue periférico para análises bioquímicas e moleculares. A extração de DNA foi realizada pelo método de salting out. Os polimorfismos dos genes CD14, TLR4 e TNFα foram genotipados pelo sistema de discriminação alélica TaqMan, em equipamento de reação em cadeia da polimerase (PCR) em Tempo Real (StepOnePlus®). O polimorfismo rs28362491, no gene NFKB1, foi amplificado através da técnica convencional de PCR. Resultados: Identificamos uma associação dos polimorfismos rs2569190, localizado no gene CD14, e rs28362491, no gene NFKB1, com a DAC. Além disso, foram detectados efeitos dos polimorfismos dos genes TLR4 e TNFα nos níveis glicêmicos e dos polimorfismos nos genes TLR4, NFKB1 e TNFα no perfil lipídico. Conclusão: Nossos achados sugerem a participação de polimorfismos nos genes CD14 e NFKB1 no desenvolvimento da DAC na nossa amostra, corroborando evidências prévias do envolvimento de genes do processo inflamatório nessa patologia. / Introduction: Coronary artery disease (CAD) is the main cause of morbidity and mortality in the world, being characterized as a chronic, multifactorial inflammatory disease, whose pathophysiology is atherosclerosis. Considering the high heritability of the disease, several genetic polymorphisms have been investigated and associated with CAD and, among them, there are variants in the CD14, TLR4, NFKB1 and TNFα genes, which regulate cell signaling pathways of the innate immune system and inflammatory process in CAD. Objective: The main objective of this study is to verify the association beteween polymorphisms in the CD14 (rs2569190), TLR4 (rs4986790 and rs4986791), NFKB1 (rs28362491) and TNFα (rs1800629 and rs361525) genes and CAD. Methods: The sample group was composed of 707 adult individuals, recruited at the time when they were bought in for coronary angiography procedures at the Hemodynamic Center of the Hospital Bruno Born, City of Lajeado, Rio Grande do Sul. The individuals were classified between cases and controls by a cardiologist, based on the following criteria: presence of stenosis, greater than 50% of the luminal diameter, in at least one of the coronary arteries. Peripheral blood samples were also collected for biochemical and molecular analyzes. DNA extraction was performed using the salting out method. The polymorphisms in the CD14, TLR4 e TNFα genes were genotyped by Taqman® allelic discrimination assays. The rs28362491 polymorphism in the NFKB1 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Results: We identified an association between the polymorphisms rs2569190, located in the CD14 gene, and rs28362491, located in the NFKB1 gene, and CAD. In addition, there were detected significant effects of TLR4 and TNFα gene polymorphisms on glycemic levels and TLR4, NFKB1 and TNFα gene polymorphisms on the lipid profile. Conclusion: Our findings suggest a role for the polymorphisms in CD14 and NFKB1 genes in CAD susceptibility in our sample, corroborating previous evidence of the envolviment of inflamotory process genes in this patology.

Fatores genéticos e imunológicos influenciam as diferentes respostas observadas entre indivíduos, desde a exposição ao HIV até o desenvolvimento da aids. As quimiocinas e seus receptores atuam na comunicação entre o sistema imune inato e adaptativo após o estabelecimento da infecção. A variabilidade genética dessas moléculas pode ser essencial para a resposta imune, principalmente se essas moléculas agem na fase inicial da infecção, fase esta que definirá o transcurso da doença. Além disso, a investigação da expressão de quimiocinas nos diferentes estágios clínicos da infecção e sua modulação após iniciado o tratamento com ARVs (antirretrovirais) é importante na busca de biomarcadores. Neste estudo, exploramos o papel de quinze polimorfismos candidatos em genes de receptores de quimiocinas e seus ligantes na susceptibilidade e na progressão à aids. Além disso, foram quantificados os níveis plasmáticos de seis quimiocinas em progressores extremos nos diferentes estágios clínicos da infecção e avaliamos o impacto da terapia como moduladora da resposta imune. Os resultados nos mostram que os polimorfismos rs56061981 no CXCL10 (CT/TT, OR: 1,819, IC 95% 1,074-3,081, P=0,026) e rs3091250 no CCR3 (TT, OR: 2,147, IC 95% 1,076-4,287, P=0,030) influenciam na susceptibilidade à infecção pelo HIV. Nas análises de interação gene-gene realizadas por redução multifatorial de dimensionalidade (MDR), observou-se que o rs56061981 no CXCL10 e rs4359426 no CCL22, juntos predizem 57% da susceptibilidade à infecção pelo HIV (P=0,008). Ademais, observou-se que os polimorfismos rs13034664 no CCL20 (CC, OR: 0,214, IC 95% 0,063-0,730, P=0,014) e rs4359426 no CCL22 (CA/AA, OR: 2,685, IC 95% 1,128-6,392, P=0,026) foram associados com a progressão rápida à aids. Com relação aos níveis plasmáticos, o CXCL10 estava significativamente aumentado nos progressores rápidos (Pcorrigido(c)=0,003) e lentos (Pc≤0,0001) pré-aids quando comparado com os controles saudáveis. Neste contexto, sugere-se o CXCL10 como biomarcador em indivíduos crônicos HIV+. Quando avaliadas as subpopulações celulares T auxiliares em HIV+ sob ARV, se observou uma frequência aumentada de linfócitos TCD4+ ativados nos progressores rápidos (1,3% vs. 13,6%, Pc=0,008) e nos progressores lentos (1,3% vs. 5,4%, Pc=0,044) quando comparados com os controles saudáveis. Já a frequência de linfócitos T CD8+ ativados foi mais alta nos progressores rápidos quando comparados com os controles saudáveis (0,32% vs. 8,7%; Pc=0,001). A frequência de células Th2 estava diminuída nos progressores rápidos (Pc=0,027) e, nos progressores lentos, as células Th1 estavam com frequência diminuída, enquanto que a frequência das Th17 estava aumentada quando comparados com os controles saudáveis (Pc=0,007 e Pc=0,042, respectivamente), se observando um desequilíbrio de subconjuntos celulares T CD4+ nos progressores extremos sob ARV. / From HIV exposition to AIDS disease different responses against HIV infection are influenced by immunological and genetic host factors. Chemokines and their receptors link the innate and adaptive system after the establishment of HIV infection. Genetic diversity of these molecules is crucial to the immune response, since they have a pivotal role in the early infection, clinical stage which predicts the disease progression. Furthermore, to investigate the expression of chemokines in different clinical stages of HIV infection and their modulation before and after initiated ART (antiretroviral therapy) is important to identify biomarkers of progression. In this study, we explored the role of 15 candidate polymorphisms in chemokine receptor and chemokine genes on susceptibility to HIV infection and progression to AIDS. Also, plasma levels of six chemokines were quantified in extreme progressors in different clinical stages of infection and the impact of ART, as a modulator of the immune response, was evaluated. The CXCL10 rs56061981 (CT/TT, OR: 1.819, CI 95% 1.074-3.081, P=0.026) and CCR3 rs3091250 (TT, OR: 2.147, CI 95% 1.076-4.287, P=0.030) variants were associated with susceptibility to HIV infection. Also, in the MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) analyses, the best model to predict the susceptibility to HIV infection was composed by CXCL10 rs56061981 and CCL22 rs4359426 with 57% of accuracy (P=0.008). In analysis of disease progression, CCL20 rs13034664 (CC, OR: 0.214, CI 95% 0.063-0.730, P=0.014) and CCL22 rs4359426 (CA/AA, OR: 2.685, CI 95% 1.128-6.392, P=0.026) variants were associated with rapid progression to AIDS. Regarding plasma levels, CXCL10 levels were higher in rapid progressors (RPs) (Pcorrected(c)=0.003) and slow progressors (SPs) (Pc≤0.0001) in pre-AIDS when compared to healthy controls and this molecule was suggested as a potential biomarker of disease progression. Furthermore, frequencies of activated CD4+ T-cell were higher in SPs (1.3% vs. 5.4%, Pc=0.044) and RPs (1.3% vs. 13.6%, Pc=0.008) under ART when compared with healthy controls. On the other hand, frequencies of activated CD8+ T cell were elevated in RPs (0.32% vs. 8.7%, Pc=0.001) under ART when compared with controls. Th2 cell frequency was lower in RPs under ART (Pc=0.027) when compared with controls, and Th1 cell frequency was lower (Pc=0.007) and Th17 cells were higher (Pc=0.042) in SPs under ART when compared with healthy controls.