Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T12:21:27Z No. of bitstreams: 1 Dissertação final PDF.pdf: 2801952 bytes, checksum: 7ee702b1583d5a7e8912bdabb9228b92 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T12:21:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação final PDF.pdf: 2801952 bytes, checksum: 7ee702b1583d5a7e8912bdabb9228b92 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T12:21:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação final PDF.pdf: 2801952 bytes, checksum: 7ee702b1583d5a7e8912bdabb9228b92 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-10T12:21:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação final PDF.pdf: 2801952 bytes, checksum: 7ee702b1583d5a7e8912bdabb9228b92 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Alterações imunofenotípicas qualitativas e quantitativas na expressão da proteína RAP1, uma pequena GTPase da superfamília RAS, estão presentes em diversos tipos de cânceres, tais como carcinomas de células escamosas de orofaringe, câncer papilar da tireóide, câncer de mama, carcinoma de células renais, leucemia, melanoma, neoplasias intraepiteliais e câncer cervical. Entretanto, para a utilização de RAP1 como biomarcador para auxiliar no diagnóstico imuno-histoquímico de tumores, especialmente do câncer cervical, são necessários anticorpos anti-RAP1 a baixo custo, uma vez que, atualmente, os anticorpos disponíveis no Brasil são importados e de custo elevado, tornando inviável sua utilização no diagnóstico de rotina. Assim, este trabalho tem como objetivos a expressão de proteínas RAP1 recombinantes (rRAP1) em sistema bacteriano, e a produção de anticorpos monoclonais e policlonais anti-rRAP1, visando a sua aplicação no diagnóstico de diversos tumores por imuno-histoquímica. Dois genes RAP1 sintéticos codificantes para as proteínas rRAP1A e rRAP1AB foram desenhados, sintetizados e subclonados no plasmídeo de expressão bacteriano pQE9 e sua expressões obtidas na linhagem hospedeira E.coli M15. Após indução com IPTG, as proteínas rRAP1 foram purificadas por cromatografia líquida em coluna de afinidade de quelato de níquel, obtendo-se o rendimento, por litro de cultura bacteriana, de 185,6 mg/L de rRAP1A e 103,9 mg/L de rRAP1AB. As proteínas rRAP1 purificadas foram inoculadas em animais para a produção de anticorpos monoclonais e policlonais anti-rRAP1A e antirRAP1AB. Ensaios imuno-histoquímicos foram realizados em tecidos de pacientes com neoplasia cervical para a avaliação da reatividade dos anticorpos anti-rRAP1 com a proteína RAP1 humana. Uma intensa imunorreatividade foi verificada com o anticorpo anti-rRAP1A (policlonal produzido em coelhos) considerado, até o momento, o melhor candidato para uso na detecção da expressão de RAP1 em ensaios imuno-histoquímicos, o que pode auxiliar no diagnóstico de várias neoplasias, especialmente, do câncer do colo uterino. / Qualitative and quantitative immunophenotypical changes in the expression of RAP1 protein, a small GTPase of the RAS superfamily, have been detected in many types of cancers such as oropharyngeal squamous cell carcinomas, papillary thyroid cancer, breast cancer, renal cell carcinoma, leukemia, melanoma, intraepithelial neoplasia and cervical cancer. However, to use RAP1 as a putative biomarker for immunohistochemical assays to support tumor diagnosis, especially cervical cancer, anti-RAP1 antibodies at low cost are essential, since here in Brazil the anti-RAP antibodies available are imported and expensive making them impractical to use in routine diagnostics. This work aims to express recombinant proteins RAP1 (rRAP1) in bacterial system for the production of monoclonal and polyclonal anti-rRAP1 to be used for diagnosis of various tumors by immunohistochemistry. Two synthetic RAP1 genes coding for rRAP1A and rRAP1AB proteins were designed, synthesized, and subcloned into the pQE9 vector for recombinant protein production in E. coli (strain M15). After IPTG induction, both rRAP1 proteins were purified by nickel chelate affinity chromatography yielding, per liter of bacterial culture, 185,6 mg/L of rRAP1A and 103,9 mg/L of rRAP1AB protein. The purified rRAP1 proteins were used to generate polyclonal and monoclonal antibodies against rRAP1A and against rRAP1AB. Immunohistochemistry experiments were performed on tissues samples from patients with cervical neoplasia to evaluate the reactivity of the anti-rRAP1 antibodies to the human RAP1. An intense immunoreactivity was observed for a rabbit polyclonal anti-rRAP1A antibody, considered so far, the best candidate to be used for RAP1 immunohistochemical testing to support tumor diagnosis, especially cervical cancer.