<p>Liposarcoma (LPS) arises from adipocytes and is a rare malignancy among all cancer types, but represents the most common form of soft tissue sarcoma, with approximately 2,000 new cases reported annually. Clinically, liposarcomas are classified into four subtypes based on histological analysis: well-differentiated liposarcoma (WDLPS), dedifferentiated liposarcoma (DDLPS), myxoid/round cell liposarcoma, and pleomorphic liposarcoma. Although histological analysis provides useful information for identifying various liposarcoma subtypes, treatment options rely on a fundamental understanding of driver mutations and molecular mechanisms underlying tumorigenesis. This thesis focuses on elucidating important driver mutations and therapeutic targets to eradicate DDLPS. Notch signaling is an evolutionarily conserved signaling pathway essential for organ development and stem cell function. Aberrant Notch signaling underlies the tumorigenesis of many cancers including LPS. However, the specific role of Notch signaling in development of LPS remains elusive. In Chapter 2, I provide evidence demonstrating that Notch signaling plays a key role in cancer stem cells (CSCs), also referred to as tumor-initiating cells (TICs), that drive aggressive DDLPS. I used serial transplantation to enrich and generate a murine DDLPS cell line with constitutively activated Notch signaling (NICDOE). My analyses revealed that NICDOE DDLPS cells are heterogeneous and contain TICs that express cancer stem cell markers. Chapter 3 elucidates how Notch signaling regulates CSCs of LPS. I analyzed human LPS samples to establish a strong correlation between Notch signaling activation and tumor marker expression and prognosis. I further performed gene expression and metabolic analyses of NICDOE DDLPS cells. These assays revealed that NICDOE reduced mitochondrial respiration in DDLPS cells, which was associated with diminished expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α (PGC-1α), a master regulator of mitochondrial biogenesis. CRISPR/CAS9-mediated deletion of the NICDOE cassette rescued the expression of PGC-1α and mitochondrial respiration in DDLPS cells. Similarly, overexpression of PGC-1α was sufficient to rescue mitochondrial biogenesis in DDLPS cells. Together, these data demonstrate that Notch signaling regulates CSCs, at least partially by controlling PGC-1α mediated mitochondria biogenesis.</p>

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distribution, and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle, HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in humans and animal models is closely linked to the function of an accessory protein Nef. Among several actions of Nef, one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response, such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome, but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein 2 (AP-2) in clathrin-coated vesicles, inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of this receptor to multivesicular bodies (MVBs) pathway by an atypical mechanism because, although not need charging ubiquitination, depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT machinery. It has been reported that Nef interacts with subunits of AP- 1, AP-2, AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However, the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore, AP-1, AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However, there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This study aim to identify and characterize cellular factors involved on CD4 down-modulation induced by Nef from HIV-1. More specifically, this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two isoforms of ?-adaptins, AP-1 subunits. By pull-down technique, we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition, our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin, not ?1-adaptin, is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. Furthermore, by flow cytometry assay, ?2 depletion, but not ?1 depletion, compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the redistribution of CD4 by Nef to juxtanuclear region, resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A, another subunit of AP-1, resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and, compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover, upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes, via overexpression of HRS, internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes, where co-localize with ?2. Together, the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway, being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore, the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions, but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions, and only the AP-1 variant comprising ?2, but not ?1, acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activities, which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition, this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distribution, and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle, HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in humans and animal models is closely linked to the function of an accessory protein Nef. Among several actions of Nef, one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response, such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome, but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein 2 (AP-2) in clathrin-coated vesicles, inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of this receptor to multivesicular bodies (MVBs) pathway by an atypical mechanism because, although not need charging ubiquitination, depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT machinery. It has been reported that Nef interacts with subunits of AP- 1, AP-2, AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However, the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore, AP-1, AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However, there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This study aim to identify and characterize cellular factors involved on CD4 down-modulation induced by Nef from HIV-1. More specifically, this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two isoforms of ?-adaptins, AP-1 subunits. By pull-down technique, we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition, our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin, not ?1-adaptin, is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. Furthermore, by flow cytometry assay, ?2 depletion, but not ?1 depletion, compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the redistribution of CD4 by Nef to juxtanuclear region, resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A, another subunit of AP-1, resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and, compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover, upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes, via overexpression of HRS, internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes, where co-localize with ?2. Together, the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway, being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore, the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions, but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions, and only the AP-1 variant comprising ?2, but not ?1, acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activities, which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition, this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.

A comercialização de produtos florestais não madeireiros (PFNMs) popularizou-se como atividade promotora do desenvolvimento socioeconômico de comunidades florestais com baixo impacto ambiental. Há evidências, contudo, de que a exploração possa produzir efeitos ecológicos e socioeconômicos negativos, sugerindo que é necessário monitorar tais iniciativas. A comercialização frequentemente ocorre em áreas remotas e em contextos de pobreza, como é o caso de muitas daquelas da Amazônia brasileira. Desta forma, é necessário que o monitoramento restrinja-se a avaliar os efeitos evidenciados como mais comuns em estudos anteriores. Este estudo revisa e sintetiza as evidências científicas dos efeitos da exploração de PFNMs sobre parâmetros ecológicos e socioeconômicos e, a partir daí, indica aqueles mais relevantes ao monitoramento. O estudo também levanta até que ponto o monitoramento é implementado no contexto da Amazônia brasileira e avalia quais os parâmetros importantes e viáveis de monitoramento neste caso específico. Para isso, foram realizadas revisões sistemáticas da literatura e a consulta a profissionais da área através do método Delphi. Os resultados indicam que efeitos ecológicos negativos são frequentes, principalmente quando se coletam folhas ou cascas. Alterações em órgãos ou processos fisiológicos e a taxa de sobrevivência dos espécimes explorados são parâmetros que devem ser monitorados, em particular quando se coletam frutos e partes vegetativas. Para todos os tipos de PFNMs, o tamanho e a estrutura populacional são parâmetros prioritários ao monitoramento. A riqueza de espécies da comunidade explorada merece atenção, principalmente quando se coletam frutos. Para os aspectos socioeconômicos, efeitos positivos foram mais frequentes que negativos. A contribuição da renda monetária obtida com o comércio na renda total, a regularidade de ingresso desta renda e o papel dos PFNMs como recursos de salvaguarda são parâmetros do capital financeiro prioritários ao monitoramento. Para o capital social, o empoderamento feminino, a coesão de grupo e o acesso aos benefícios gerados pela comercialização devem ser monitorados. Na Amazônia brasileira são poucas as iniciativas de implementação do monitoramento da comercialização de PFNMs. Embora este seja considerado importante, existem dificuldades que derivam principalmente da falta de apoio institucional, políticas de incentivo e de recursos financeiros. Os profissionais participantes do Delphi consideram que os parâmetros ecológicos mais importantes a monitorar neste contexto são o tamanho e a estrutura populacional do recurso explorado, o aumento da taxa de mortalidade, a quantidade total de recurso extraída e a técnica de coleta utilizada. Para os parâmetros econômicos, aspectos do mercado, como o preço pago ao coletor, a demanda e a qualidade do produto, bem como a renda monetária obtida pelos indivíduos são os parâmetros considerados mais importantes. Por fim, para os aspectos sociais, os efeitos na cultura, na qualidade de vida e na organização interna da comunidade foram priorizados. Os profissionais indicam que é viável estabelecer o monitoramento dos parâmetros levantados. / Amazon, non-timber forest products, ecological effects, socioeconomic effects, monitoring.

A comercialização de produtos florestais não madeireiros (PFNMs) popularizou-se como atividade promotora do desenvolvimento socioeconômico de comunidades florestais com baixo impacto ambiental. Há evidências, contudo, de que a exploração possa produzir efeitos ecológicos e socioeconômicos negativos, sugerindo que é necessário monitorar tais iniciativas. A comercialização frequentemente ocorre em áreas remotas e em contextos de pobreza, como é o caso de muitas daquelas da Amazônia brasileira. Desta forma, é necessário que o monitoramento restrinja-se a avaliar os efeitos evidenciados como mais comuns em estudos anteriores. Este estudo revisa e sintetiza as evidências científicas dos efeitos da exploração de PFNMs sobre parâmetros ecológicos e socioeconômicos e, a partir daí, indica aqueles mais relevantes ao monitoramento. O estudo também levanta até que ponto o monitoramento é implementado no contexto da Amazônia brasileira e avalia quais os parâmetros importantes e viáveis de monitoramento neste caso específico. Para isso, foram realizadas revisões sistemáticas da literatura e a consulta a profissionais da área através do método Delphi. Os resultados indicam que efeitos ecológicos negativos são frequentes, principalmente quando se coletam folhas ou cascas. Alterações em órgãos ou processos fisiológicos e a taxa de sobrevivência dos espécimes explorados são parâmetros que devem ser monitorados, em particular quando se coletam frutos e partes vegetativas. Para todos os tipos de PFNMs, o tamanho e a estrutura populacional são parâmetros prioritários ao monitoramento. A riqueza de espécies da comunidade explorada merece atenção, principalmente quando se coletam frutos. Para os aspectos socioeconômicos, efeitos positivos foram mais frequentes que negativos. A contribuição da renda monetária obtida com o comércio na renda total, a regularidade de ingresso desta renda e o papel dos PFNMs como recursos de salvaguarda são parâmetros do capital financeiro prioritários ao monitoramento. Para o capital social, o empoderamento feminino, a coesão de grupo e o acesso aos benefícios gerados pela comercialização devem ser monitorados. Na Amazônia brasileira são poucas as iniciativas de implementação do monitoramento da comercialização de PFNMs. Embora este seja considerado importante, existem dificuldades que derivam principalmente da falta de apoio institucional, políticas de incentivo e de recursos financeiros. Os profissionais participantes do Delphi consideram que os parâmetros ecológicos mais importantes a monitorar neste contexto são o tamanho e a estrutura populacional do recurso explorado, o aumento da taxa de mortalidade, a quantidade total de recurso extraída e a técnica de coleta utilizada. Para os parâmetros econômicos, aspectos do mercado, como o preço pago ao coletor, a demanda e a qualidade do produto, bem como a renda monetária obtida pelos indivíduos são os parâmetros considerados mais importantes. Por fim, para os aspectos sociais, os efeitos na cultura, na qualidade de vida e na organização interna da comunidade foram priorizados. Os profissionais indicam que é viável estabelecer o monitoramento dos parâmetros levantados. / Amazon, non-timber forest products, ecological effects, socioeconomic effects, monitoring.