Leptin is the prototypical adipokine that circulates in direct proportion to whole body adiposity. As such, serum leptin levels decrease when white adipose tissue depletes by calorie restriction whereas they increase as white adipose tissue expands by overnutri-tion. At both sides of the spectrum, i.e. too little and too much leptin, the adipokine con-tributes to vascular complications such as atherosclerosis and reproductive dysfunction. Mice that lack both leptin and the low density lipoprotein receptor (LDLR−/−;ob/ob) are an ideal model to study atherosclerosis as they present with atherosclerotic plaques in the aortic root and brachiocephalic artery. In this thesis, dose-dependent effects of re-combinant leptin administration from the subphysiological to physiological range on atherosclerotic plaque formation and fertility was studied in LDLR−/−;ob/ob mice. Lep-tin dose-dependently reduced plaque lesions and improved Leydig cell function and spermatogenesis. The effect of leptin treatment on atherosclerotic plaques was inde-pendently and significantly associated with improvements in lipid homeostasis and liver steatosis, as well as increased adiponectin. The beneficial effects of leptin treatment on several measures of fertility such as intratesticular testosterone, circulating follicle stim-ulating hormone, and seminiferous tubule morphology appeared to be direct and body weight-independent. Besides genetic leptin-deficiency, lipodystrophy (LD) patients and lipodystrophic mice were studied. LD is a leptin-deficient condition caused by the lack of subcutaneous white adipocytes leading to several metabolic complications including severe insulin resistance and hypertriglyceridemia. The effects of adipose tissue loss in LD on the adipokines chemerin, progranulin, and fibroblast growth factor 21 have not been investigated so far. Circulating levels of these three adipokines were all increased in LD patients as compared to weight- and age-matched controls. Furthermore, none of these adipokines was significantly regulated in 10 LD patients by leptin treatment over 6 months. In a mouse model of generalized LD, increased expression of these adipokines was found in various adipose tissue depots at the mRNA level providing first preliminary evidence as to the source of higher circulating levels in LD patients. Collec-tively, the findings of this thesis show for the first time dose-dependent beneficial ef-fects of leptin on atherosclerosis and reproductive function and provide new information about the association of LD with changes in various adipokines that have an established impact on metabolic function.

The introduction of new genetic information into microbial production organisms is one of the keystones of modern biotechnology, this can be achieved i.a. by the introduction of plasmids. Extrachromosomal plasmids replicate autonomously and show a plasmid-specific plasmid copy number (PCN) per cell. In growing cells, a fine-tuned copy number regulation is achieved by a tightly controlled balance of the initiator of replication and the repressor. In theory, the plasmid copy number can be influenced at will by a targeted manipulation of this balance. In order to allow transient PCN changes in growing cells, an inducible, precisely adjustable strategy is needed. In this thesis, cop, the repressor of plasmid replication of pE194, was over-expressed independently from the native regulatory system. The developed overexpression system was used to force a severe imbalance in favor of the repressor, therefore intentionally driving the loss of replicating plasmid from the population. As a consequence, cells that previously incorporated the plasmid into their genome gain a selective advantage as they stably inherit an antibiotic resistance encoded on the now non-replicative plasmid. In established genomic modification strategies, a forced imbalance is dependent on elevated temperatures. However, the established protocols for genomic modifications are time-consuming and require extensive screening for clones with the desired genotype. The aim of this thesis was to conceive and establish a novel vector for a reliable, faster and more efficient protocol with a minimal screening requirement. The promotor controlling the repF-cop operon was characterized by supplying the repressor Cop in trans, revealing a complete repression at high Cop concentrations. Furthermore, the gradual dose-dependency of this repression could be shown. Over several intermediate steps, the novel All-in-one vector pBAio was designed. With this vector, the PCN in growing cells can be controlled and even fine-tuned. Forcing a complete stop of plasmid replication, resulted in a 100% plasmid integration rate that eliminated the need for integrand screening and increased the efficiency (i.e. mutant to wild type ratio). The new, pBAio-based protocol allows for fast and efficient markerless genomic modification in different, industrially relevant Bacillus sp..

Die Arbeit beschreibt die Auffindung und Charakterisierung einer FDH aus Rhodococcus jostii. Das Enzym konnte erfolgreich als Cofaktor-Regenerierungssystem eingesetzt werden. Darüber hinaus sind verschiedene Mutagenese-Experimente beschrieben, welche eine Optimierung des Enzyms für die industrielle Anwendung ermöglichten.:1. Einleitung 1 1.1. Allgemeine Einführung 1 1.1.1. Eigenschaften von Enzymen 1 1.1.2. Veränderungen von Enzymeigenschaften durch Mutagenese 3 1.1.3. Einsatz von Enzymen 4 1.2. Cofaktor-Regenerierung 5 1.2.1. Cofaktoren 5 1.2.2. Prinzip und Bedeutung der Cofaktor-Regenerierung 7 1.2.3. Enzymatische Cofaktor-Regenerierung 8 1.3. Formiatdehydrogenasen 11 1.3.1. Metallabhängige Formiatdehydrogenasen 12 1.3.2. NAD-abhängige Formiatdehydrogenasen 15 1.4. Anwendung von NAD-abhängigen FDH 27 1.5. Motivation und Zielsetzung 30 2. Material und Methoden 32 2.1. Materialien und Geräte 32 2.1.1. Geräte 32 2.1.2. Spezialchemikalien 33 2.1.3. Enzyme 33 2.1.4. Kitsysteme 33 2.1.5. Chromatographiesäulen 34 2.1.6. Weitere Verbrauchsmaterialien 34 2.2. Nukleinsäuren und Bakterienstämme 34 2.2.1. Bakterienstämme 34 2.2.2. Spenderorganismen 34 2.2.3. Plasmide 35 2.2.4. Oligonukleotide 35 2.3. Kultivierung von Mikroorganismen 36 2.3.1. Medien 36 2.3.2. Kultivierung von E. coli-Stämmen 37 2.3.3. Kultivierung von E. coli-Stämmen in Mikrotestplatten 37 2.3.4. Rekombinante Genexpression im 250 mL-Maßstab 37 2.3.5. Rekombinante Genexpression in Mikrotestplatten 38 2.3.6. Stammhaltung 38 2.4. Molekularbiologische Methoden 38 2.4.1. Isolation genomischer DNA aus Bakterien 38 2.4.2. Plasmidisolation 38 2.4.3. Agarose-Gelelektrophorese 38 2.4.4. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 39 2.4.5. Gibson-Assembly 41 2.4.6. Restriktionsansätze 42 2.4.7. Isolation und Reinigung von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel 42 2.4.8. Transformationstechniken 43 2.4.9. Mutagenesetechniken 44 2.4.10. Sequenzierung von DNA-Fragmenten 44 2.4.11. Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 45 2.5. Biochemische Methoden 46 2.5.1. Einstellung der pH-Werte von Puffersubstanzen 46 2.5.2. Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 46 2.5.3. Proteinquantifizierung 47 2.5.4. Zellaufschluss 48 2.5.5. Proteinreinigung 49 2.5.6. Größenausschlusschromatographie (SEC) 50 2.6. Enzymatische Testverfahren 51 2.6.1. Berechnung der Enzymaktivität 51 2.6.2. Bestimmung der Enzymaktivität im 1 mL-Maßstab 51 2.6.3. Bestimmung der Enzymaktivität in Mikrotestplatten 52 2.6.4. Bestimmung der Enzymstabilität bei unterschiedlichen Temperaturen 52 2.6.5. Bestimmung der Enzymstabilität in Anwesenheit von org. Lösungsmitteln 53 2.6.6. Enzymstabilitätseffekte von Schwermetallen 53 2.6.7. Cofaktor-Regenerierungssysteme 53 2.6.8. Enzymatische Reduktion von Kohlenstoffdioxid 55 2.7. Analysemethoden 55 2.7.1. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 55 2.7.2. Gaschromatographie (GC) 56 2.8. Bioinformatische Methoden 57 2.8.1. In silico-Arbeiten mit DNA-Sequenzen 57 2.8.2. In silico-Arbeiten mit Proteinen 57 2.8.3. In silico-Analyse von Proteineigenschaften 57 2.8.4. Erstellung von Homologiemodellen 58 3. Ergebnisse und Diskussion 59 3.1. Identifizierung hochaktiver NAD-abhängiger Formiatdehydrogenasen 59 3.1.1. Bioinformatische Auswahl von FDH-Sequenzen 59 3.1.2. Vorauswahl potentiell hochaktiver FDH-Varianten 64 3.1.3. Bereitstellung potentiell hochaktiver FDH-Varianten und Bestimmung der kinetischen Parameter 71 3.1.4. Fazit 75 3.2. Proteinbiochemische Charakterisierung der RjFDH 77 3.2.1. Allgemeine Charakteristika 77 3.2.2. Substratspektrum und Inhibition der RJFDH 83 3.2.3. Beeinflussung der Enzymaktivität der RjFDH durch Metallionen 84 3.2.4. Cofaktor-Nutzung der RjFDH 86 3.2.5. Reduktion von CO2 91 3.2.6. Temperaturabhängigkeit und Thermostabilität der RjFDH 97 3.2.7. Einfluss des pH-Werts auf die RjFDH 101 3.2.8. Einfluss von Lösungsmitteln auf die Enzymaktivität 104 3.2.9. Fazit 108 3.3. Leistung der RjFDH als Cofaktor-Regenerierungssystem 111 3.3.1. Cofaktor-Regenerierung in Kombination mit der Alkoholdehydrogenase A 111 3.3.1. Cofaktor-Regenerierung in Kombination mit der Leucin-Dehydrogenase aus Lysinibacillus sphaericus 113 3.3.2. Fazit 115 3.4. Veränderung der Enzymeigenschaften der RjFDH 116 3.4.1. Einfluss von Einzelmutationen auf die thermostabilität der RjFDH 116 3.4.2. Einfluss von Cystein-Resten auf die Enzymstabilität 127 3.4.3. Einfluss des C-terminalen Bereichs der RjFDH auf die Enzymaktivität 141 3.4.4. Veränderung der Cofaktorspezifität der RjFDH 150 Anhang 167 Literaturverzeichnis 174 Eidesstattliche Erklärung 191

Die Selbstmedikation mit rezeptfreien Arzneimitteln birgt potenzielle Risiken für die Patientensicherheit. Diese Risiken können durch einen ausreichenden Informationsaustausch von therapeutisch relevanten Informationen während einer pharmazeutischen Beratung minimiert werden (u.a. für welchen Patient ist die Selbstmedikation bestimmt, welche Symptome bestehen, Begleitmedikation, Informationen zur Anwendung und Dosierung). Als oft erster und auch einziger Ansprechpartner der Patienten hat das pharmazeutische Personal bei der Selbstmedikation daher eine wichtige Verantwortung für die Patientensicherheit. Durch einen relevanten Informationsaustausch können Grenzen für eine Selbstmedikation aufgedeckt und gemeinsam mit dem Patienten eine Entscheidung für eine geeignete Therapie getroffen werden. Leitlinien definieren, welche Informationen zur Patientensituation und zum Arzneimittel für eine adäquate Beratung ausgetauscht werden sollten. Der derzeitige Status quo des Informationsaustausches in der Beratungspraxis deutscher Apotheken wurde bis dato noch nicht strukturiert untersucht. Um zukünftige Strategien für eine Optimierung der Beratung aufzeigen zu können, war das Ziel dieser Dissertation, den Status quo des Informationsaustausches zu ermitteln und mögliche negative Einflussfaktoren einer leitliniengerechten Beratung zur Selbstmedikation aufzudecken. Hierfür sollte der Informationsaustausch während der Beratung zur Selbstmedikation aus verschiedenen Perspektiven – pharmazeutisches Personal, Patienten und unbeteiligte Beobachter – betrachtet werden. Das erste Teilprojekt beinhaltete eine Selbsteinschätzung von 1068 Personen des pharmazeutischen Personals zur Umsetzung des Informationsaustausches sowie einer Beobachtung von 108 Beratungsgesprächen durch einen nichtbeteiligten Beobachter in fünf Apotheken. Hier zeigte sich, dass trotz Kenntnis und Akzeptanz der Beratungsleitlinien ein leitliniengerechter Informationsaustausch noch nicht vollständig in die tägliche Beratungspraxis zur Selbstmedikation integriert wurde. Insbesondere das Erfragen der „Begleitmedikation“ der Patienten sowie das Informieren zu möglichen „Nebenwirkungen“ von rezeptfreien Arzneimitteln wurde vom pharmazeutischen Personal als schwierig bewertet. Als größte Barriere für eine adäquate Selbstmedikationsberatung benannte das pharmazeutische Personal ein vermeintliches 'Desinteresse der Patienten'. Demgegenüber zeigen die Ergebnisse aus Interviews mit 963 Passanten in der Leipziger Innenstadt (zweites Teilprojekt), dass die Patienten bei einem Apothekenbesuch an einer Beratung zur Selbstmedikation interessiert sind und diese auch erwarten. Als weniger wichtig wird die pharmazeutische Beratung von Seiten der Patienten eingeschätzt, wenn ein „direkter Präparatewunsch“ geäußert wird oder das Arzneimittel zuvor schon einmal eingenommen wurde. Gerade in diesen Situationen muss das pharmazeutische Personal daher einen Informationsaustausch mit dem Patienten besonders anregen und das Bewusstsein für die Relevanz einer individuellen pharmazeutischen Beratung bei den Patienten fördern. Zur Ableitung potenzieller Optimierungsstrategien des Informationsaustausches wurden im dritten Teilprojekt 379 reale Beratungsgespräche aus zehn Apotheken auf mögliche Einflussfaktoren untersucht. Die durchgeführte Regressionsanalyse bestätigte quantitativ, dass ein „direkter Präparatewunsch“ (p < 0,001) sowie ein vermutetes „Desinteresse der Patienten“ (p < 0,001) einen negativen Einfluss auf das Ausmaß des Informationsaustausches haben. In der hier vorgestellten kumulativen Arbeit wurde erstmalig eine umfassende Status-quo- Analyse des Informationsaustausches während der Beratung zur Selbstmedikation in deutschen Apotheken durchgeführt. Die drei Publikationen zeigen mögliche Ansatzpunkte für die Optimierung des Informationsaustausches zwischen pharmazeutischem Personal und Patienten bei der Beratung zur Selbstmedikation. Zur Verbesserung der Beratung sollten zukünftige Schulungsmaßnahmen für das pharmazeutische Personal angeboten werden, die insbesondere das Bewusstsein für das Thematisieren der Parameter des Informationsaustausches schärfen und Strategien zur Einbindung von Patienten mit einem „direkten Präparatewunsch“ vermitteln. Ebenfalls sollten Patienten durch Öffentlichkeitsarbeit über die Relevanz einer pharmazeutischen Beratung für ihre Arzneimitteltherapiesicherheit aufgeklärt werden, um dadurch deren Interesse an einer Beratung zu fördern.:1 Zusammenfassung 1 2 Abstract 7 3 Einleitendes Kapitel 12 3.1 Selbstmedikation in der öffentlichen Apotheke 12 3.2 Aufbau eines Beratungsgespräches nach den Leitlinienempfehlungen 14 3.2.1 Deutsche Leitlinie zur Selbstmedikationsberatung 15 3.2.2 Leitlinie aus den Vereinigten Staaten 17 3.2.3 Leitlinien aus Australien 18 3.2.4 WWHAM-Fragen aus Großbritannien zu Informationsgewinnung 19 3.2.5 Weitere Empfehlungen für die Informationsgewinnung 20 3.2.6 Weitere Empfehlungen für die Informationsvermittlung 22 3.3 Mögliche Einflussfaktoren eines Beratungsgespräches zur Selbstmedikation 23 3.3.1 Mögliche Einflussfaktoren durch den organisatorischen Kontext 23 3.3.2 Mögliche Einflussfaktoren bei der Interaktion zwischen pharmazeutischem Personal und Patient 24 3.3.3 Möglicher Einfluss externer Faktoren 25 3.4 Rahmen des Projektes 26 3.5 Motivation der zugrundeliegenden Originalarbeit 28 3.5.1 Der Informationsaustausch als Basis einer Selbstmedikationsberatung 28 3.5.2 Die Haltung des pharmazeutischen Personals zum Informationsaustausch 30 3.5.3 Die Haltung der Patienten zum Informationsaustausch 30 3.5.4 Relevanz von Einflussfaktoren für nachhaltige Optimierungsstrategien 31 3.6 Ziele der Arbeit 32 4 Originalarbeit I 35 5 Originalarbeit II 58 6 Originalarbeit III 73 7 Zusammenfassung der Ergebnisse und Diskussion 89 7.1 (A) Status quo des Informationsaustausches 92 7.1.1 Status quo des Prozessschrittes „Informationsgewinnung“ 92 7.1.2 Status quo des Prozessschrittes „Informationsvermittlung“ 97 7.2 (B) Barrieren und Erwartungen des pharmazeutischen Personals 101 7.3 (C) Barrieren und Erwartungen der Patienten 103 7.4 (D) Einflussfaktoren des Informationsaustausches 105 7.5 (E) Ausblick: abzuleitende Optimierungsstrategien 109 8 Fazit 114 9 Literaturverzeichnis 118 10 Abbildungsverzeichnis 135 11 Tabellenverzeichnis 136 12 Abkürzungsverzeichnis 137 13 Wissenschaftlicher Werdegang 138 14 Publikationsverzeichnis 142 15 Anhang 145 16 Danksagung 159 17 Selbstständigkeitserklärung 161

Genomes of higher plants comprise a large proportion of repetitive DNAs, where one major class is satellite DNA. Satellite DNA is organized in tandem arrays of basic repeating units, which often occurs in heterochromatin of centromeric/pericentromeric and intercalary as well as subtelomeric regions. Besides these typical satellite repeats, there are also non-typical satellite DNAs, which are organized in short tandem arrays and integrated into a transposable element. The chromosomal localization of non-typical satellites is not in large regions of heterochromatin, but tend to be dispersed along chromosomes. This thesis describes the identification of the major repeat classes including major satellite content in six beet and related species. The focus was on identification and characterization of new satellite families in the beet genomes. In this study, the information regarding repetitive DNA as well as satellite families fraction in six beet and related species was gained based on graph-based clustering of next generation sequenced short sequence reads. The repeat proportion of the six analyzed species ranges from 34.4% in C. quinoa to 65.6% in B. lomatogona, in which the portion of nearly 50% belongs to B. vulgaris, B. nana, P. procumbens, and P. patellaris. Among all classes of repetitive DNAs, LTR retrotransposons are the most abundant repeat type in all analyzed genomes, which is a common feature of higher plant genomes. The other repeat sequences are DNA transposons, rDNA, and satellite DNA with variable portions in different species. A set of satellite families in each species was analyzed in detail and reflects the relationship between six species. The closely related relationship between B. lomatogona and B. nana as well as between P. procumbens and P. patellaris is affirmed by seven and 13 satellite families shared between two species, respectively. Similarly, the closer relationship between B. vulgaris and two species B. lomatogona and B. nana than between B. vulgaris and two species P. procumbens and P. patellaris from the sister-genus Patellifolia is also confirmed. C. quinoa is a distantly related species and this is reflected by vastly different satellite content. Therefore, satellite DNA analysis might be a useful tool to trace species evolution. In the B. lomatogona genome, by the application of RepeatExplorer tool, six novel tandemly repeated DNA sequences were identified and designated BlSat1-BlSat6. The three typical satellite families BlSat1, BlSat5, and BlSat6 are organized in tandem arrays in large heterochromatic blocks. BlSat1 is mainly localized in the pericentric region of the chromosome 3, 5, 6, and 9, while BlSat5 is amplified in the pericentromeric region of the chromosome 3, 5, and 7. BlSat6 is a chromosome-specific satellite and is located in the subtelomeric region on the south arm of the chromosome 8. The other three satellite families BlSat2, BlSat3, and BlSat4 are characterized as non-typical satellite DNA because of their dispersed distribution along chromosomes. BlSat2 and BlSat3 are identified as a tandem repeat domain in Ogre/Tat retrotransposons. The occurrence of one or several short tandem arrays in a transposable element is a common phenomenon in both animals and plants. These short repeats are considered to be continuously evolving and eventually amplifying to new satellite families. Furthermore, the distribution of the six new satellite families in beet and related species was confirmed by comparative PCR, comparative Southern hybridization, and mapping of sequence reads from referent species against each satellite sequence. The BlSat1 and BlSat6 satellite families are specific for the genus Beta, while BlSat5 is only amplified in two sections Corollinae and Nanae of the genus Beta. BlSat4 is an ancient satellite family which exists in all tested species belonging to the genera Beta, Patellifolia, Chenopodium, and Spinacia, whereas BlSat2 and BlSat3 might have evolved before the separation of the genus Beta and Patellifolia but their sequences have been lost or heavily diverged during the species radiation. Comparison of two wild beet genomes P. procumbens and P. patellaris was performed aiming to address the open question whether P. patellaris is auto- or allotetraploid. The high similarity between these two genomes indicates their close relationship. However, the genetic difference between two genomes, in particular the molecular characteristics as well as the chromosomal localization of two satellite families PproSat1 and PpatSat1, might support a hypothesis that P. patellaris is allotetraploid species with a half of its chromosome set derived from P. procumbens. The results obtained in this work might provide comprehensive information of the repetitive classes as well as satellite families in the genomes of beets and related species. The results can be used as the species-specific and chromosome-specific markers in beet genome studies.

Gene trapping has emerged as a valuable tool to create conditional alleles in various model organisms. Here we report the FLEx‐based gene trap vector SAGFLEx that allows the generation of conditional mutations in zebrafish by gene‐trap mutagenesis. The SAGFLEx gene‐trap cassette comprises the rabbit β‐globin splice acceptor and the coding sequence of GFP, flanked by pairs of inversely oriented heterotypic target sites for the site‐specific recombinases Cre and Flp. Insertion of the gene‐trap cassette into endogenous genes can result in conditional mutations that are stably inverted by Cre and Flp, respectively. To test the functionality of this system we performed a pilot screen and analyzed the insertion of the gene‐trap cassette into the lima1a gene locus. In this lima1a allele, GFP expression faithfully recapitulated the endogenous lima1a expression and resulted in a complete knockout of the gene in homozygosity. Application of either Cre or Flp was able to mediate the stable inversion of the gene trap cassette and showed the ability to conditionally rescue or reintroduce the gene inactivation. Combined with pharmacologically inducible site specific recombinases the SAGFLEx vector insertions will enable precise conditional knockout studies in a spatial‐ and temporal‐controlled manner.

Im Bereich der Biosensorik nehmen Sensoren auf der Grundlage lebender Zellen eine besondere Rolle ein: Mit ihrer Hilfe ist es möglich ohne großen technischen Aufwand die Bioverfügbarkeit eines spezifischen Analyten zu detektieren. Aufgrund ihrer Robustheit und der Einfachheit der Kultivierung eignet sich die Hefe S. cerevisiae in besonderem Maß zur Generierung von Ganzzellsensoren. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes dieses eukaryotischen Mikroorganismus ist die Möglichkeit der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf höhere Organismen. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung hefebasierter Ganzzellsensoren für die Detektion von Essigsäure. Als Referenzanwendung diente der Biogasprozess, denn dort ist die Essigsäure sowohl ein Zwischenprodukt als auch ein Indikator für Prozessstörungen. Zur Optimierung der Produktion und einer besseren Steuerung von Biogasanlagen ist daher eine kontinuierliche Überwachung der Essigsäurekonzentration im Prozess sinnvoll. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit 5`-YGP1, 5`-TPO2 und 5`-YRO2 drei Essigsäure-spezifische Promotoren identifiziert werden. Durch Kopplung mit einem rot-fluoreszierenden Protein entstanden Reportergenkonstrukte, die in Hefezellen verbracht wurden. Entsprechende Transformanden wurden initital charakterisiert. Das Reportergenkonstrukt 5`-YGP1-tRFP erwies sich aufgrund der Stärke und des Verlaufs des Fluoreszenzsignals für die Generierung eines Ganzzellsensors als besonders geeignet. Die erzeugten rekombinanten Hefen fluoreszierten in Anwesenheit von Essigsäure abhängig von der eingesetzten Konzentration der Säure in einem Bereich von 1,5 bis 35 mM. Beispielsweise konnte bei Zugabe von 30 mM Essigsäure eine bis zu 20-fache Induktion der Fluoreszenzsignale beobachtet werden. Im weiteren Verlauf erfolgten unter anderem Analysen zur Regeneration des entwickelten hefebasierten Sensors. Die Regenerationszeit betrug ca. 8 h. Die erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Möglichkeit einer Mehrfachanwendung besteht. Zur Optimierung des Sensors wurde der Einsatz von Stämmen, bspw. mit der Deletion spezifischer Transporter zum Import von Essigsäure bzw. dem Export von Acetationen, untersucht. Hinsichtlich einer erhöhten Signalstärke oder kürzeren Reaktionszeit war jedoch kein Einfluss einer Deletion nachweisbar. Zur Untersuchung der Querempfindlichkeit wurden andere, ebenfalls im Biogasprozess vorkommende, flüchtige Fettsäuren getestet. Dabei konnte die Spezifität des entsprechenden Ganzzellsensors für die Essigsäure gezeigt werden. Testungen von Realproben aus dem Biogasprozess, die vom Projektpartner bereitgestellt worden waren, verliefen vielversprechend. Für den Einsatz von Ganzzellsensoren in der Praxis ist eine lange Standzeit von Vorteil. Aus diesem Grund wurde im weiteren Verlauf der Arbeit dazu übergegangen, Reportergenkonstrukte stabil im Genom der Hefe zu integrieren um die Langzeitstabilität dieser generierten Ganzzellsensoren zu untersuchen. Durch Paarung und Sporulation wurden Sporen erzeugt, aus denen nach der Lagerung über einen Zeitraum von bis zu sechs Monaten vegetative Hefezellen erfolgreich reaktiviert werden konnten. Dabei fluoreszierten die Ganzzellsensoren in Anwesenheit von Essigsäure mit der gleichen Stärke und Konzentrationsabhängigkeit wie zu Beginn der Lagerung. Durch den Einsatz des auf dem Hefe-Pheromonsystem basierenden Verstärkersystems für zelluläre Signale, welches bereits in der Arbeitsgruppe etabliert ist, konnte das nach der Integration abgeschwächte Fluoreszenzsignal erfolgreich 30 bis 40-fach amplifiziert werden.

Designer nucleases have greatly simplified small genome modifications in many genomes. They can precisely target a specific DNA sequence within a genome and make a double stranded break (DSB). DNA repair mechanisms of the DSB lead to gene mutations or gene modification by homologous directed repair (HDR) if a repair template is exogenously supplied. Thus, small, site directed mutations are easily and quickly achieved. However, strategies that utilize designer nucleases for more complex tasks are emerging and require optimization. To optimize CRISPR/Cas9 assisted targeting, an HPRT rescue assay was utilized to measure the relationship between targeting frequency and homology arm length in targeting constructs in mouse embryonic stem cells. The results show that different gene engineering exercises had different homology requirements.

Ziel der Arbeit ist die Analyse des Phyto- und Bakterioplanktons in der Talsperre Saidenbach sowie die Identifizierung von Einflussfaktoren auf deren Zusammensetzung. Dazu wurde die mikrobielle Gemeinschaft im Freiwasser von 2013 bis 2015 monatlich in einer Vorsperre sowie an drei Probenahmestellen im Hauptbecken der Talsperre untersucht. Zur Quantifizierung und Differenzierung des Bakterioplanktons wurden Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie, CARD-FISH, denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese, Klonierung und 16S-Amplikonsequenzierung eingesetzt. Die Auswertung der Daten erfolgte durch Korrelations- und Clusteranalysen sowie NMDS unter Einbeziehung hydrophysikalischer und hydrochemischer Parameter, meteorologischer Daten sowie der Daten zur Phytoplanktongemeinschaft. Darüber hinaus wurden Verfahren zum Monitoring typischer Organismengruppen im Pelagial etabliert bzw. auf ihre Eignung hin untersucht: Die spektrofluorometrische Erfassung von Phytoplanktongruppen mit Hilfe einer Tauchsonde wurde anhand mikroskopischer Analysen des Phytoplanktons validiert. Für die Quantifizierung und Differenzierung des autotrophen Picoplanktons (APP) wurde eine durchflusszytometrische Methodik entwickelt und die Resultate ebenfalls anhand mikroskopischer Zählungen überprüft. Die mit der FluoroProbe Sonde (bbe Moldaenke GmbH) ermittelten Chlorophyll-Konzentrationen für vier Algengruppen zeigten im Vergleich zu den mikroskopischen Analysen gute Übereinstimmung für die spektrale Gruppe der Diatomeen (incl. Haptophyceen, Dinophyceen, Chrysophyceen), während für die spektralen Gruppen der Grünalgen (incl. Desmidiaceen), Cyanobakterien und Cryptophyta z.T. deutliche Abweichungen auftraten. Die relative Zusammensetzung des Phytoplanktons wies ebenfalls deutliche Unterschiede zwischen FluoroProbe-Messungen und Mikroskopie auf, die vor allem in einer Überschätzung des Anteils von Grünalgen und einer generellen Unterschätzung von Cyanobakterien anhand der Sondenmessungen bestanden. Ein wesentlicher Vorteil der Sondenmessungen besteht jedoch in der Möglichkeit zur in-situ Aufnahme von Tiefenprofilen. Die Abschätzung der Zusammensetzung und Abundanz des Phytoplanktons in der Wassersäule vor Ort kann zur gezielten Probenahme genutzt werden und ergänzend Informationen zu nicht mikroskopisch analysierten Horizonten liefern. Die Sondenmessungen eignen sich jedoch nicht als Ersatz für mikroskopische Analysen und sollten nicht unabhängig von diesen betrachtet werden. Für die Quantifizierung des APP wurde eine durchflusszytometrische Methodik entwickelt, die im Vergleich zur Mikroskopie präzise Zellzahlen ergab und auch die Anteile phycocyanin- und phycoerythrinhaltiger Picoplankter zutreffend widerspiegelte. Der geringe Zeitaufwand für die durchflusszytometrischen Messungen ermöglicht es, das APP in einer höheren räumlichen und zeitlichen Auflösung zu untersuchen. Die statistische Auswertung in Hinblick auf die erhobenen Umweltparameter zeigte für die Abundanz der Picoplankter in den oberflächennahen Wasserschichten signifikante Zusammenhänge zur Wassertemperatur und dem pH-Wert. Unter den untersuchten Nährstoffen spielte nur die Nitratkonzentration in der Vorsperre und im Unterwasservorbecken eine Rolle. In der bakteriellen Gemeinschaft der Talsperre Saidenbach und der Vorsperre Forchheim wurden als dominante Taxa anhand von Klonierung und 16S-Amplikonsequenzierung typische Süßwasservertreter der jeweiligen Phyla nachgewiesen, z.B. hgcI-clade (Actinobacteria), Limnohabitans (Betaproteobacteria) und C. Pelagibacter (Alphaproteobacteria). Clusteranalysen für DGGE-Profile und 16S-Amplikonsequenzierungsdaten zeigten häufig Ähnlichkeiten der mikrobiellen Gemeinschaft in Vorsperre und Unterwasservorbecken sowie teilweise mit Proben späterer Zeitpunkte aus den weiter stromabwärtsgelegenen Probenahmestellen (S, E). Dies spiegelt möglicherweise einen Längstransport der Arten in der Talsperre wider und bedeutet für die Bewirtschaftung, dass in Vorsperren nicht nur Nährstoffelimination durch gezieltes Phytoplanktonwachstum und –sedimentation stattfindet, sondern sich auch Bakteriengruppen etablieren, die sich bei geeigneten ökologischen Bedingungen auf stromabwärts gelegene Kompartimente der Talsperre ausbreiten können. Die Zusammensetzung des Bakterioplanktons zeigte für einen Teil der Proben jahresübergreifend wiederkehrende saisonale Muster. Vor allem Proben des Jahres 2013 unterschieden sich jedoch deutlich von den entsprechenden Zeiträumen der anderen Jahre, worin sich meteorologische Besonderheiten (verkürzte Frühjahrszirkulation, sommerliches Starkregenereignis) widerspiegeln. Für die untersuchten Umweltparameter wurden in den aufeinanderfolgenden Jahren jeweils verschiedene Zusammenhänge zur Zusammensetzung des Bakterioplanktons festgestellt. Sowohl anhand der 16S-Amplikonsequenzierungsdaten als auch der DGGE-Profile konnten keine jahresübergreifend wirksamen Umweltfaktoren ermittelt werden, was auch auf den kurzen Untersuchungszeitraum von drei Jahren zurückzuführen ist. Vor allem ist aber davon auszugehen, dass im Gewässerökosystem stets mehrere Faktoren zusammenwirken und mehrstufige, z.T. zeitlich verzögerte Beziehungen zwischen den abiotischen und biotischen Komponenten bestehen. Für die Entwicklung der Ökosystemkomponenten spielen vor allem in den meso- und oligotrophen Standgewässern auch durch die Zirkulations- und Schichtungsverhältnisse eine entscheidende Rolle, die derzeit durch klimatische Veränderungen einem starken Wandel unterworfen sind. Die entsprechenden Veränderungen der mikrobiellen Gemeinschaft sind nicht absehbar und sollten in Anbetracht ihrer Stoffwechselleistungen im Gewässer ein wesentliches Element langfristiger Untersuchungen sein. Effiziente Verfahren zur Untersuchung verschiedener Komponenten des Phyto- und Bakterioplanktons können dazu einen wichtigen Beitrag leisten.

The overall architecture and cell types are highly conserved from mammals to teleost fish. The rapid transparent ex utero development in zebrafish allows direct access and precise visualization of all the major events in cerebellar development. The superficial position of the cerebellar primoridum and cerebellum further facilitates in vivo imaging of cerebellar structures and developmental events at cell resolution. Furthermore, zebrafish model have a comprehensive genetic toolbox that allow forward and reverse genetic approaches to study and manipulate gene function. Consequently, zebrafish is emerging as an excellent vertebrate model for studies of molecular, cellular and physiological mechanisms involved in cerebellar development and function at gene, cell and circuit level.