Introduction : La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique qui atteint plusieurs organes dont le pancréas, le foie et les poumons. Elle s’exprime par une accumulation de mucus visqueux qui va entraîner une altération des fonctions de ces organes. Les progrès scientifiques ont permis d’améliorer la condition de vie et d’augmenter considérablement l’espérance de vie des patients atteints de FK. L’amélioration de l’espérance de vie des patients FK est associée à l’apparition d’anomalies de la tolérance au glucose précédant l’apparition du diabète associé à la FK (DAFK). Le DAFK présente des similitudes avec le diabète de type 1 [DT1] (faible poids, faible sécrétion d’insuline) et le diabète de type 2 [DT2] (intolérance au glucose, anomalies de la sensibilité à l’insuline), mais il est spécifique pour ses causes et ses conséquences. Le DAFK est associé à un risque accru de perte de poids, de réduction de la fonction pulmonaire et de mortalité précoce et touche 50 % des patients adultes. La principale cause de ce diabète est décrite par une sécrétion d'insuline réduite et retardée. Les facteurs de risque, menant au développement du DAFK et les conséquences de son apparition ne sont pas encore bien comprises. La diète (riche en lipides et en énergie) recommandée en FK visant à maintenir un poids adéquat pourrait être responsable de l’accumulation de graisse ectopique, de résistance à l’insuline, de stéatose hépatique et d’anomalies du bilan lipidique rapportés en FK. Pour les patients sans FK, ces anomalies sont associées au développement du DT2. Objectif : Le but de ce travail de thèse visait à l’identification de nouveaux facteurs de risque d’anomalies de la tolérance au glucose dans une population d’adultes atteints de FK. Méthode : Pour cela nous avons i) observé l’évolution de la sécrétion d’insuline chez les patients FK âgés ; ii) identifié l’association entre les enzymes hépatiques et la prévalence du DAFK ; iii) identifié la prévalence de dyslipidémie chez les patients FK adultes et l’association avec le risque de développement du DAFK. Résultats : Nos résultats ont montré que les patients FK adultes présentent une sécrétion d’insuline altérée, mais qu’elle ne se dégrade pas davantage sur une décennie. Par contre, sur la même période, les patients deviennent plus résistants à l’insuline. Nous avons mis en évidence l’existence d’une relation entre le niveau d’enzymes alanine aminotransférase (ALT) élevé et la prévalence de DAFK. Enfin, nous avons montré l’existence d’une forte prévalence de dyslipidémie en FK, mais ces anomalies ne sont pas associées à la survenue du DAFK. Conclusion : Ces travaux ont permis de mieux comprendre l’association entre différents facteurs de risque en lien avec les anomalies de la tolérance au glucose chez des patients adultes FK. Nous avons identifié un mécanisme et un possible biomarqueur du DAFK, les enzymes hépatiques ALT, chez les patients FK adultes. Ces données peuvent fournir un rationnel pertinent pour la poursuite d’autres études cliniques dans le but d’améliorer la qualité de vie des patients atteints de FK. / Introduction: Cystic fibrosis (CF) is a genetic disorder that affects several organs including the pancreas, liver, and lungs. It is expressed by an accumulation of viscous mucus which will cause an impairment of the functions of these organs. Scientific advances have improved the condition of life and significantly increased the life expectancy of patients with CF. This improved life expectancy of CF patients is associated with the onset of glucose tolerance abnormalities before the onset of CF-associated diabetes (CFRD). CFRD has similarities with type 1 diabetes [T1D] (low body weight, low insulin secretion) and type 2 diabetes [T2D] (glucose intolerance, abnormal insulin sensitivity), but it is specific for its causes and consequences. CFRD is associated with an increased risk of weight loss, reduced lung function and early mortality and affects 50% of adult patients. The main cause of this diabetes is described as a reduced and delayed insulin secretion. The risk factors leading to the development of CFRD and the consequences of its appearance are not well understood. The diet (rich in lipids and energy) recommended in CF, that aims at maintaining an adequate body weight, could be responsible for the accumulation of ectopic fat, insulin resistance, fatty liver and abnormalities of the lipid balance reported in FK. For patients without CF these anomalies are associated with the development of T2D. Objective: The aim of this thesis work was to identify new risk factors for abnormal glucose tolerance in a population of adults with CF. Method: For this we have i) observed the evolution of insulin secretion in elderly CF patients; ii) identified the association between liver enzymes and the prevalence of CFRD; iii) studied the prevalence of dyslipidemia in adult CF patients and the association with the risk of developing CFRD. Results: Our results have shown that adult CF patients have impaired insulin secretion, but it has not degraded further over a decade. However, over the same period, patients become more resistant to insulin. We have highlighted a relationship between the high alanine aminotransferase (ALT) enzyme level and the prevalence of CFRD. Finally, we have shown the existence of a high prevalence of dyslipidemia in CF but these anomalies are not associated with the occurrence of CFRD. Conclusion: This work has made possible to better understand the association between different risk factors linked to glucose tolerance abnormalities in adult CF patients. We have identified a mechanism and a possible biomarker, ALT hepatic enzyme, of CFRD in adult CF patients. These data may provide a relevant rationale for the pursuit of other clinical studies in order to improve the quality of life of patients with CF.

Die Erkrankung Diabetes mellitus stellt eine wesentliche medizinische und ökonomische Her-ausforderung für das deutsche Gesundheitssystem dar. Weitgehend ungeklärt sind jedoch die Kostenunterschiede alternativer Behandlungsstrategien. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirtschaftlichkeit von Insulin glargin gegenüber relevanten Therapiealternativen bei Patien¬ten mit insulinbehandeltem Typ-2-Diabetes aus der Perspektive der deutschen GKV unter-sucht. Dazu wurden vier pharmakoökonomische Evaluationen mittels Kosten-Minimierungs-Ansatz auf der Basis von Studien- und Routinedaten durchgeführt. Die therapeutische Äqui-valenz der verglichenen Behandlungsverfahren wurde als gesichert vorausgesetzt. In allen vier Wirtschaftlichkeitsanalysen konnte die Kosteneffektivität von Insulin glargin ge-genüber relevanten Komparatoren gezeigt werden. Beim Vergleich der basalunterstützten ora-len Therapie (BOT) mit der prandialen Insulintherapie (SIT) ergaben sich auf Basis der APOLLO-Studie jährliche Pro-Kopf-Einsparungen in Höhe von 722 € zugunsten von Insulin glargin. Geringere Behandlungskosten zeigten sich auch gegenüber Insulin detemir in der BOT auf Basis der Rosenstock-RCT sowie in der Basal-Bolus-Therapie (ICT) auf Basis der Hollander-RCT. Die jährlichen Pro-Kopf-Einsparungen zugunsten von Insulin glargin betru-gen 486 € in der BOT und 684 € in der ICT. Schließlich ergab auch der Behandlungs¬kosten¬vergleich von Insulin glargin mit dem langwirksamen NPH-Insulin auf der Basis ambulanter Routinedaten niedrigere jährliche Behandlungskosten zugunsten von Insulin glargin. Die Ein-sparungen pro Patient und Jahr betrugen 198 € und waren unabhängig vom Behandlungsre-gime (BOT oder ICT). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstreichen den Stellenwert qualitätsgesicherter Wirtschaftlichkeitsanalysen zur rationalen Ressourcenallokation im Rahmen der Insulin¬therapie des Typ-2-Diabetes mellitus.:Inhaltsverzeichnis 1 Einführung 1 1.1 Kosten des Diabetes mellitus 1 1.2 Epidemiologie des Diabetes mellitus 3 1.3 Behandlung des Diabetes mellitus 4 1.4 Wirtschaftlichkeit in der Diabetestherapie 7 2 Zielsetzung 9 3 Pharmakoökonomische Evaluationen 9 3.1 APOLLO-Studie 9 3.1.1 Design und Ergebnisse der klinischen Studie 9 3.1.2 Zielsetzung der pharmakoökonomischen Analyse 10 3.1.3 Material und Methoden 11 3.1.3.1 Mengenerfassung 11 3.1.3.2 Kostenermittlung 15 3.1.3.3 Sensitivitätsanalysen 18 3.1.4 Ergebnisse 20 3.1.5 Diskussion 24 3.2 Rosenstock-Studie 30 3.2.1 Design und Ergebnisse der klinischen Studie 30 3.2.2 Zielsetzung der pharmakoökonomischen Analyse 31 3.2.3 Material und Methoden 31 3.2.4 Ergebnisse 34 3.2.5 Diskussion 36 3.3 Hollander-Studie 39 3.3.1 Design und Ergebnisse der klinischen Studie 39 3.3.2 Zielsetzung der pharmakoökonomischen Analyse 40 3.3.3 Material und Methoden 40 3.3.4 Ergebnisse 42 3.3.5 Diskussion 44 3.4 LIVE-SPP-Studie 47 3.4.1 Design der Beobachtungsstudie 47 3.4.2 Zielsetzung der pharmakoökonomischen Analyse 48 3.4.3 Patienten und Methoden 48 3.4.3.1 Ein- und Ausschlusskriterien 48 3.4.3.2 Datenerfassung 48 3.4.3.3 Kostenermittlung 49 3.4.3.4 Statistische Auswertung 51 3.4.3.5 Sensitivitätsanalysen 51 3.4.4 Ergebnisse 52 3.4.5 Diskussion 54 4 Bewertung der Ergebnisse im Kontext der aktuellen pharmakoökonomischen Datenlage 58 4.1 Literaturrecherche 59 4.2 Insulin glargin in der BOT im Vergleich zu anderen Behandlungsregimen (SIT und CT) 62 4.2.1 4T-Studie 62 4.2.2 HEART2D-Studie 63 4.2.3 PHAZIT-Studie 64 4.2.4 LAPTOP-Studie (Deutschland) 65 4.2.5 Diabetes-Mellitus-Modell (1) 66 4.2.6 LAPTOP-Studie (Kanada, Österreich) 67 4.2.7 Zusammenfassung (Regimevergleiche) 67 4.3 Insulin glargin in der BOT versus Insulin detemir in der BOT 68 4.3.1 L2T3-Studie 69 4.3.2 Persistenzanalyse (1) 71 4.3.3 Zusammenfassung 72 (Insulin glargin versus Insulin detemir in der BOT) 4.4 Insulin glargin in der ICT versus Insulin detemir in der ICT 72 4.4.1 LIVE-COM-Studie 73 4.4.2 Wiesner-Studie (Typ-1-Diabetes) 76 4.4.3 IMS-Datenbankanalyse-1 (Typ-1-Diabetes) 80 4.4.4 Indirekter Vergleich (Typ-1-Diabetes) 82 4.4.5 Zusammenfassung 84 (Insulin glargin versus Insulin detemir in der ICT) 4.5 Weitere Studien zum Vergleich von Insulin glargin und Insulin detemir 84 4.5.1 LIVE-KK-2-Studie 84 4.5.2 InsightHealth-Datenbankanalyse-1 86 4.5.3 Zusammenfassung 89 (Insulin glargin versus Insulin detemir) 4.6 Insulin glargin versus NPH-Insulin in der BOT und ICT 91 4.6.1 LIVE-SPP-Studie 92 4.6.2 Persistenzanalyse (2) 94 4.6.3 Diabetes-Mellitus-Modell (2) 95 4.6.4 Endpunkstudien 96 4.6.5 LIVE-DE-Studie 97 4.6.6 LIVE-KK-1-Studie 102 4.6.7 InsightHealth-Datenbankanalyse-2 103 4.6.8 IMS-Datenbankanalyse-2 (Typ-1-Diabetes) 104 4.6.9 Discrete Event Simulation-D (Typ-1-Diabetes) 106 4.6.10 Discrete Event Simulation-CH (Typ-1-Diabetes) 108 4.6.11 LIVE-GERI-Studie 109 4.6.12 Zusammenfassung 110 (Insulin glargin versus NPH-Insulin) 5 Zusammenfassung 111 6 Literaturverzeichnis 118 7 Publikationen 134 7.1 Comparison of treatment costs in inadequately controlled type 2 135 diabetes in Germany based on the APOLLO trial with insulin glargine. Journal of Medical Economics 2009; 12(2): 87-97 7.2 Comparison of one-year costs of type 2 diabetes treatment with 146 insulin glargine or insulin detemir in a basal supported oral therapy (BOT) in Germany. International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics 2010; 2: 129-137 7.3 Cost comparison of insulin glargine with insulin detemir in a 155 basal-bolus regime with mealtime insulin aspart in type 2 diabetes in Germany. German Medical Science 2010; 8: Doc 17 doi: 10.3205/000106 7.4 Resource utilisation and costs in patients with type 2 diabetes 164 treated with insulin glargine or conventional basal insulin under real-world conditions in Germany: LIVE-SPP study. Journal of Medical Economics 2008; 11: 695-712 8 Anlagen 182 8.1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 182 8.2 Lebenslauf 183 8.3 Danksagung 185 8.4 Veröffentlichungen 186 188

Le déclin développemental de la sensibilité musculaire à 1'insuline est associé à une réduction de l'anabolisme protéique durant la période néonatale. Certaines études montrent que la sensibilité musculaire à l'insuline du métabolisme du glucose est améliorée par l'incorporation d'acides gras n-3 à longue chaîne (20 carbones et plus) dans les membranes musculaires. Le présent mémoire montre qu'un enrichissement des phospholipides membranaires des muscles de 31 % à 186 % en acides gras n-3 à longue chaîne chez les bouvillons en croissance améliore la sensibilité musculaire à l'insuline du métabolisme des acides aminés (+108 %) et du glucose (+37 %). Ceci est accompagné par une activation de la voie de signalisation insulinique initiant la synthèse protéique musculaire concomitante à une réduction des voies oxydatives corporelles (-82 %).

L'obésité est une épidémie mondiale qui augmente le risque de développer un diabète de type 2 ainsi que ses complications. Chez les individus obèses, le tissu adipeux sécrète de grandes quantités d'hormones et de cytokines qui affectent négativement le métabolisme du glucose et des lipides, ce qui provoque l'inflammation et la résistance à l'insuline. L'obésité augmente également l'activité du système rénine-angiotensine (RAS) localement au niveau de différents tissus et de façon systémique dans la circulation. L’angiotensinogène est convertie en angiotensine I par la rénine, ainsi que par la prorénine uniquement quand la prorénine est liée au récepteur de la rénine et prorénine [(P)RR] 1 . Ceci est la voie angiotensine-dépendante (Ang-D) du (P)RR. La liaison de la rénine et de la prorénine avec le (P)RR active également une voie angiotensine-indépendante (Ang-ND), ce qui produit une signalisation intracellulaire comportant la mitogen activated protein kinase (MAPK), la extracellular regulatory kinase 1/2 (ERK1/2), la promyelocytic leukemia zinc finger protein (PLZF) et le tumor necrosis factor alpha (TNF-a). Ceux-ci peuvent provoquer la croissance et la prolifération cellulaire, l'apoptose et la fibrose et pourraient donc être reliés aux dommages tissulaires et aux complications associées à l'obésité 1, 2. Plusieurs effets bénéfiques d’un blocage pharmacologique du (P)RR ont été rapportés tels la prévention du développement d'une fibrose cardiaque et rénale ainsi que la prévention de la néphropathie et de la rétinopathie diabétique. Cependant, les effets du (P)RR dans le tissu adipeux ont été peu étudiés. Par conséquent, notre objectif était d'étudier le rôle du (P)RR dans le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline par : 1) l'administration de HRP (un peptide bloquant l’effet du (P)RR) chez un modèle de souris obèse par l’administration d’une diète riche en gras (HFD), et 2) l’évaluation de souris ayant une délétion (KO) du gène (P)RR spécifiquement dans le tissu adipeux, qui a été généré dans notre laboratoire par la technologie Cre-LoxP. L'expression du gène et de la protéine du (P)RR dans les tissus adipeux était augmentée chez les souris nourries avec une HFD indépendamment du traitement au HRP. Le traitement par le HRP a réduit le poids corporel et la masse adipeuse chez les souris nourries avec une HFD alors qu’une tendance pouvait être observée chez les souris sur diète normale (ND). De façon similaire, les souris (P)RR KO spécifiquement dans le tissu adipeux avaient une réduction du poids corporel et de la masse adipeuse, même sur ND, ce qui suggère fortement l'implication du (P)RR dans le tissu adipeux dans le développement de l'obésité. Le phénotype des souris KO incluait une augmentation de l'activité horizontale uniquement dans leur période active, ce qui pourrait contribuer à augmenter leur métabolisme énergétique et ainsi réduire leur poids corporel et leur masse adipeuse. De plus, les souris KO homozygotes mâles avaient un métabolisme de base plus élevé car nous avons observé une augmentation de la consommation d'oxygène et de la production de dioxyde de carbone pendant leur période active et de sommeil. Cette augmentation du métabolisme pourrait résulter, en partie, d'une augmentation de la thermogenèse comme en témoigne l’expression accrue du gène de brunissement, PRDM16, dans le tissu adipeux péri-rénale de souris mâles KO. Conformément à cela, des résultats récents provenant de notre laboratoire ont également démontré que le HRP pouvait induire du brunissement au niveau du tissu adipeux sous-cutanée 3. Chez les souris traitées avec le HRP, bien que la glycémie eût été similaire aux souris recevant le placebo, l'insuline plasmatique et le rapport insuline/glucose était plus faible indépendamment de la diète. De façon similaire, les souris (P)RR KO avaient une insulinémie et un taux de peptide C plus faibles par rapport aux souris contrôles, sans aucune différence dans les courbes de la glycémie au cours d'un test de tolérance au glucose par voie orale. Les niveaux d'insuline dans l’état basal et stimulé étaient significativement plus faibles chez les souris KO, sans aucune modification du contenu pancréatique en insuline et du ratio insuline/peptide-C, ceci indique donc qu’il n’y a pas eu d’altération du niveau du métabolisme pancréatique de l'insuline. L’augmentation de l'adiponectine plasmatique chez les souris KO pourrait, entre autres, contribuer à une meilleure sensibilité à l'insuline observée. De plus, dans les groupes traités aux HRP, nous avons observé une amélioration du profil d'expression des gènes des transporteurs de glucose GLUT1 et GLUT4, du TNF-alpha, MCP-1, F4/80 et de la leptine dans le tissu adipeux ce qui pourrait contribuer à la meilleure sensibilité à l'insuline. Comme une meilleure sensibilité à l'insuline a été observée chez la souris suite au blocage pharmacologique et à la suppression génétique du (P)RR, ceci suggère que le (P)RR est impliqué dans la régulation de l’homéostasie du glucose. De plus, un taux circulant réduit des triglycérides (TG) a été observé chez les souris traitées au HRP, alors que des niveaux inférieurs de TG ont été trouvés seulement dans les muscles squelettiques chez les souris KO. Ces modifications du métabolisme des lipides et des taux circulants d'adiponectine résultent probablement d'un tissu adipeux plus sain tel que révélé par nos analyses histologiques démontrant une réduction de la taille des adipocytes chez les souris KO et traitées au HRP 3. Nos résultats démontrent que le (P)RR, en particulier dans le tissu adipeux, est impliqué dans la régulation du poids corporel et de l'homéostasie du glucose probablement par la modulation de la morphologie et de la fonction des adipocytes. Le développement d'une nouvelle stratégie clinique axée sur le blocage du (P)RR pourrait aider à traiter l'obésité et ses pathologies associées telles la résistance à l'insuline et le diabète de type 2. / Obesity is a worldwide epidemic and increases the risk of developing type 2 diabetes and its complications. In obesity, adipose tissue secretes large amounts of hormones and cytokines that negatively regulate glucose and lipid metabolism, causing inflammation and insulin resistance. Obesity also increases the activity of both local (tissue-specific) and circulating renin-angiotensin system (RAS). Angiotensinogen is converted to angiotensin I by renin, whereas prorenin may only do so upon binding to the (pro)renin receptor [(P)RR] 1. This is thus the angiotensin-dependent (Ang-D) pathway of the (P)RR. The binding of renin and prorenin with the (P)RR also activates an angiotensin-independent pathway (Ang-ND), leading to intracellular signaling involving, for instance, the mitogen activated protein kinase (MAPK), the extracellular regulatory kinase ½ (Erk1/2), the promyelocytic leukemia zinc finger protein (PLZF) and tumor necrosis factor alpha (TNF-a) 1, 2. These can produce cell growth and proliferation, apoptosis and fibrosis 1, 2, and as such may contribute to tissue damage and complications associated with obesity. The beneficial effects of pharmacological blockade of the (P)RR include prevention of the development of cardiac and renal fibrosis, as well as of diabetes-associated nephropathy and retinopathy. However, effects of the (P)RR in adipose tissue have been poorly investigated. Hence, our objective was to study the role of the (P)RR in the development of obesity and insulin resistance by: 1) administering HRP (a (P)RR blocker peptide) to mice fed a high-fat diet (HFD), and 2) in knock-out (KO) mice with adipose tissue-specific (P)RR gene deletion, which were generated in our laboratory by cre-loxp technology. (P)RR gene and protein expression in adipose tissue were increased in mice fed a HFD independently of HRP treatment. HRP treatment also reduced mice body weight and fat masses in HFD-fed mice while they only tended to be lower in mice on normal diet (ND). Similarly, the adipose tissue specific (P)RR KO mice had reduced body weight and fat masses, even on ND, and as such confirmed the involvement of adipose tissue (P)RR in the development of obesity. The KO phenotype included increased horizontal activity, only in the dark cycle (active period), which would increase energy expenditure and could contribute to their lower body weight and fat mass. Male hemizygous KO mice had higher basal metabolic rate as they had increased oxygen consumption and carbon dioxide production during both their active and inactive period. This increased basal metabolism may result in part from an increase in thermogenesis as increased “beiging” gene expression, PRDM16, was observed in peri-renal fat of male KO mice. In line with this, recent results from our laboratory have also shown that HRP may induce “beiging” in subcutaneous fat 3. In mice treated with the HRP, although glycemia was similar to placebo treated mice, plasma insulin and the insulin to glucose ratio were lower compared to untreated groups on both HFD or ND. Similarly, (P)RR KO mice had lower plasma insulin and C-peptide levels compared to controls, without any differences in the glycemia curves during an oral glucose tolerance test. Given that the basal and stimulated insulin levels were significantly lower in KO mice, without any changes in total pancreatic insulin content and with similar insulin to C-peptide ratio, this suggests that pancreatic insulin metabolism was not modified. The increased circulating adiponectin levels observed in KO mice may have contributed to the better insulin sensitivity present in the mice. In the HRP treated mice, we observed an improved gene expression profile of glucose transporters GLUT1 and GLUT4, TNF-alpha, MCP-1, F4/80 and leptin in adipose tissue, which may also contribute to the increased insulin sensitivity. Given that better insulin sensitivity was observed in mice with both (P)RR pharmacological blockade and genetic suppression, this suggests that the (P)RR is involved in the regulation of glucose homeostasis. In addition, lower circulating triglycerides (TG) levels were found in mice treated with HRP, whereas lower TG levels were observed only in skeletal muscles in (P)RR KO mice. Put altogether, the lower lipid content and higher plasma adiponectin levels likely result from a healthier fat tissue as revealed by histological analysis which showed a reduction in adipocytes size in KO mice and was recently revealed in HRP treated HFD fed mice 3. Our results demonstrate that the (P)RR, particularly in adipose tissue, is implicated in the regulation of body weight and glucose homeostasis via modulation of adipocytes morphology and function. The development of a new clinical strategy focused on blockade of the (P)RR specifically in adipose tissue could help to treat obesity and its associated pathologies such as insulin resistance and type 2 diabetes.

Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par une résistance à l’insuline des tissus périphériques et par une incapacité des cellules β pancréatiques à sécréter les niveaux d’insuline appropriés afin de compenser pour cette résistance. Pour mieux comprendre les mécanismes déficients dans les cellules β des patients diabétiques, il est nécessaire de comprendre et de définir les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Dans les cellules β pancréatiques, le métabolisme du glucose conduit à la production de facteurs de couplage métabolique, comme l’ATP, nécessaires à la régulation de l’exocytose des vésicules d’insuline. Le mécanisme par lequel la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose déclenche l’exocytose des vésicules d’insuline est bien décrit dans la littérature. Cependant, il ne peut à lui seul réguler adéquatement la sécrétion d’insuline. Le malonyl-CoA et le NADPH sont deux autres facteurs de couplage métaboliques qui ont été suggérés afin de relier le métabolisme du glucose à la régulation de la sécrétion d’insuline. Les mécanismes impliqués demeurent cependant à être caractérisés. Le but de la présente thèse était de déterminer l’implication des navettes du pyruvate, découlant du métabolisme mitochondrial du glucose, dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans les cellules β, les navettes du pyruvate découlent de la combinaison des processus d’anaplérose et de cataplérose et permettent la transduction des signaux métaboliques provenant du métabolisme du glucose. Dans une première étude, nous nous sommes intéressés au rôle de la navette pyruvate/citrate dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose, puisque cette navette conduit à la production dans le cytoplasme de deux facteurs de couplage métabolique, soit le malonyl-CoA et le NADPH. De plus, la navette pyruvate/citrate favorise le flux métabolique à travers la glycolyse en réoxydation le NADH. Une étude effectuée précédemment dans notre laboratoire avait suggéré la présence de cette navette dans les cellules β pancréatique. Afin de tester notre hypothèse, nous avons ciblé trois étapes de cette navette dans la lignée cellulaire β pancréatique INS 832/13, soit la sortie du citrate de la mitochondrie et l’activité de l’ATP-citrate lyase (ACL) et l’enzyme malique (MEc), deux enzymes clés de la navette pyruvate/citrate. L’inhibition de chacune de ces étapes par l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique ou de la technologie des ARN interférant a corrélé avec une réduction significative de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Les résultats obtenus suggèrent que la navette pyruvate/citrate joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Parallèlement à notre étude, deux autres groupes de recherche ont suggéré que les navettes pyruvate/malate et pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate étaient aussi importantes pour la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ainsi, trois navettes découlant du métabolisme mitochondrial du glucose pourraient être impliquées dans le contrôle de la sécrétion d’insuline. Le point commun de ces trois navettes est la production dans le cytoplasme du NADPH, un facteur de couplage métabolique possiblement très important pour la sécrétion d’insuline. Dans les navettes pyruvate/malate et pyruvate/citrate, le NADPH est formé par MEc, alors que l’isocitrate déshydrogénase (IDHc) est responsable de la production du NADPH dans la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate. Dans notre première étude, nous avions démontré l’importance de l’expression de ME pour la sécrétion adéquate d’insuline en réponse au glucose. Dans notre deuxième étude, nous avons testé l’implication de IDHc dans les mécanismes de régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. La diminution de l’expression de IDHc dans les INS 832/13 a stimulé la sécrétion d’insuline en réponse au glucose par un mécanisme indépendant de la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose. Ce résultat a ensuite été confirmé dans les cellules dispersées des îlots pancréatiques de rat. Nous avons aussi observé dans notre modèle que l’incorporation du glucose en acides gras était augmentée, suggérant que la diminution de l’activité de IDHc favorise la redirection du métabolisme de l’isocitrate à travers la navette pyruvate/citrate. Un mécanisme de compensation à travers la navette pyruvate/citrate pourrait ainsi expliquer la stimulation de la sécrétion d’insuline observée en réponse à la diminution de l’expression de IDHc. Les travaux effectués dans cette deuxième étude remettent en question l’implication de l’activité de IDHc, et de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate, dans la transduction des signaux métaboliques reliant le métabolisme du glucose à la sécrétion d’insuline. La navette pyruvate/citrate est la seule des navettes du pyruvate à conduire à la production du malonyl-CoA dans le cytoplasme des cellules β. Le malonyl-CoA régule le métabolisme des acides gras en inhibant la carnitine palmitoyl transférase 1, l’enzyme limitante dans l’oxydation des acides gras. Ainsi, l’élévation des niveaux de malonyl-CoA en réponse au glucose entraîne une redirection du métabolisme des acides gras vers les processus d’estérification puis de lipolyse. Plus précisément, les acides gras sont métabolisés à travers le cycle des triglycérides/acides gras libres (qui combinent les voies métaboliques d’estérification et de lipolyse), afin de produire des molécules lipidiques signalétiques nécessaires à la modulation de la sécrétion d’insuline. Des études effectuées précédemment dans notre laboratoire ont démontré que l’activité lipolytique de HSL (de l’anglais hormone-sensitive lipase) était importante, mais non suffisante, pour la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans une étude complémentaire, nous nous sommes intéressés au rôle d’une autre lipase, soit ATGL (de l’anglais adipose triglyceride lipase), dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose et aux acides gras. Nous avons démontré que ATGL est exprimé dans les cellules β pancréatiques et que son activité contribue significativement à la lipolyse. Une réduction de son expression dans les cellules INS 832/13 par RNA interférant ou son absence dans les îlots pancréatiques de souris déficientes en ATGL a conduit à une réduction de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose en présence ou en absence d’acides gras. Ces résultats appuient l’hypothèse que la lipolyse est une composante importante de la régulation de la sécrétion d’insuline dans les cellules β pancréatiques. En conclusion, les résultats obtenus dans cette thèse suggèrent que la navette pyruvate/citrate est importante pour la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ce mécanisme impliquerait la production du NADPH et du malonyl-CoA dans le cytoplasme en fonction du métabolisme du glucose. Cependant, nos travaux remettent en question l’implication de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Le rôle exact de IDHc dans ce processus demeure cependant à être déterminé. Finalement, nos travaux ont aussi démontré un rôle pour ATGL et la lipolyse dans les mécanismes de couplage métabolique régulant la sécrétion d’insuline. / Diabetes is a metabolic disorder characterized by a combination of insulin resistance in peripheral tissues with an inappropriate amount of insulin secreted by the pancreatic β-cells to overcome this insulin resistance. In order to help find a cure for diabetic patients, we need to elucidate the mechanisms underlying the proper control of insulin secretion in response to glucose. In pancreatic β-cells, glucose metabolism leads to the production of metabolic coupling factors, like ATP, implicated in the regulation of insulin vesicle exocytosis. The mechanism linking ATP production by the oxidative metabolism of glucose to the triggering of insulin release that involves Ca2+ and metabolically sensitive K+ channels is relatively well known. Other mechanisms are also involved in the regulation of insulin secretion in response to glucose and other nutrients, such as fatty acids and some amino acids. Malonyl-CoA and NADPH are two metabolic coupling factors that have been suggested to be implicated in the transduction of metabolic signaling coming from glucose metabolism to control the release of insulin granules. However, the mechanisms implicated remained to be defined. The goal of the present thesis was to further our understanding of the role of the pyruvate shuttles, derived from mitochondrial glucose metabolism, in the regulation of insulin secretion. In pancreatic β-cells, pyruvate shuttles are produced by the combination of anaplerosis and cataplerosis processes and are thought to link glucose metabolism to the regulation of insulin secretion by the production metabolic coupling factors. In our first study, we wished to determine the role of the pyruvate/citrate shuttle in the regulation of glucose-induced insulin secretion. The pyruvate/citrate shuttle leads to the production in the cytoplasm of both malonyl-CoA and NADPH and also stimulates the metabolic flux through the glycolysis by re-oxidating NADH. A previous study done in the group of Dr Prentki has suggested the feasibility of the pyruvate/citrate shuttle in pancreatic β-cells. To investigate our hypothesis, we inhibited three different steps of this shuttle in INS 832/13 cells, a pancreatic β-cell line. Specifically, we repressed, using pharmacological inhibitors or RNA interference technology, the mitochondrial citrate export to the cytoplasm and the expression of malic enzyme (MEc) and ATP-citrate lyase (ACL), two key enzymes implicated in the pyruvate/citrate shuttle. The inhibition of each of those steps resulted in a reduction of glucose-induced insulin secretion. Our results underscore the importance of the pyruvate/citrate shuttle in the pancreatic β-cell signaling and the regulation of insulin secretion in response to glucose. Other research groups are also interested in studying the implication of pyruvate cycling processes in the regulation of insulin exocytosis. They suggested a role for the pyruvate/malate and the pyruvate/isocitrate/α-ketoglutarate shuttles. Therefore, three different shuttles derived from the mitochondrial glucose metabolism could be implicated in the regulation of glucose-induced insulin release. All those three shuttles can produce NADPH in the cytoplasm. In the pyruvate/malate and the pyruvate/citrate shuttles, the NADPH is formed by cytosolic malic enzyme (MEc), whereas in the pyruvate/isocitrate/α-ketoglutarate, NADPH is produced by cytosolic isocitrate dehydrogenease (IDHc). In our first study, we established the importance of MEc expression in the regulation of insulin secretion. In our second study, we wanted to investigate the importance of IDHc expression in glucose-induced insulin secretion. The reduction of IDHc expression in INS 832/13 cells stimulated insulin release in response to glucose by a mechanism independent of ATP production coming from glucose oxidative metabolism. This stimulation was also observed in isolated rat pancreatic cells. IDHc knockdown cells showed elevated glucose incorporation into fatty acids, suggesting that isocitrate metabolism could be redirected into the pyruvate/citrate shuttle in these cells. Taken together, these results suggest that IDHc is not essential for glucose-induced insulin secretion and that a compensatory mechanism, probably involving the pyruvate/citrate shuttle, explains the enhanced insulin secretion in IDHc knockdown cells . The pyruvate/citrate shuttle is the only pyruvate shuttle that is linked to the production of malonyl-CoA. Malonyl-CoA is a known inhibitor of carnitine palmitoyl transferase 1, the rate-limiting step in fatty acid oxidation. Therefore, the raising level of malonyl-CoA in response to glucose redirects the metabolism of fatty acids into the triglycerides/free fatty acids cycle which combine esterification and lipolysis processes. Previous studies done in the laboratory of Dr Prentki supported the concept that lipolysis of endogenous lipid stores is an important process for the appropriate regulation of insulin secretion. A first lipase, hormone-sensitive lipase (HSL), has been identified in pancreatic β-cells. HSL expression is important, but not sufficient, for the β-cell lipolysis activity. In a complementary study, we have investigated the role of another lipase, adipose triglyceride lipase (ATGL), in the regulation of insulin secretion in response to glucose and to fatty acids. We first demonstrated the expression and the activity of ATGL in pancreatic β-cells. Reducing ATGL expression using shRNA in INS 832/13 cells caused a reduction in insulin secretion in response to glucose and to fatty acids. Pancreatic islets from ATGL null mice also showed defect in insulin release in response to glucose and to fatty acids. The results demonstrate the importance of ATGL and intracellular lipid signaling in the regulation of insulin secretion. In conclusion, the work presented in this thesis suggests a role for the pyruvate/citrate shuttle in the regulation of insulin secretion in response to glucose. This mechanism possibly implicates the production of NADPH and malonyl-CoA in the cytoplasm. The results also points to a re-evaluation of the role of IDHc in glucose-induced insulin secretion. The precise role of IDHc in pancreatic β-cells needs to be determined. Finally, the data have also documented a role of lipolysis and ATGL in the coupling mechanisms of insulin secretion in response to both fuel and non-fuel stimuli.

Parmi les cancers cutanés, le mélanome métastatique est le moins fréquent (5 à 7%) mais le plus meurtrier par sa forte résistante aux thérapies conventionnelles. Bien qu'immunogène, aucun traitement efficace n'existe actuellement pour traiter ce cancer, ce qui fait qu'il est urgent de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, nous avons évalué si l'Insulin-Like Growth Factor-1 (IGF-1) pouvait représenter une cible d'intérêt thérapeutique dans le mélanome en inhibant l'expression du facteur IGF-1, à l'aide d'un épisome antisens, dans deux modèles cellulaires : des cellules de mélanome primaire B16-F0 et métastatique B16-F10 (cellules appelées B16-F0mod et B16-F10mod lorsque l'expression d’IGF-1 est inhibée).Dans des modèles expérimentaux in vivo, nos résultats montrent que la réduction d'expression d'IGF-1 induit une diminution de la tumorigénicité des cellules de mélanome, en générant des tumeurs sous-cutanées plus petites (B16-F0 et B16-F10 dans les souris C57BL/6) et en inhibant totalement (souris C57BL/6) ou fortement (souris NSG) la capacité des B16-F10 à former des métastases pulmonaires. Nous avons cherché à comprendre si cette perte de tumorigénicité, suite à l'inhibition du facteur IGF-1, était due à une modification de l'immunogénicité/antigénicité des cellules tumorales et/ou à une modification du potentiel tumorigène intrinsèque des cellules tumorales métastatiques.1/ L’immunisation de souris C57BL/6 à l'aide de cellules B16-F0mod induit la formation d’effecteurs humoraux lytiques en présence de complément dirigés contre la lignée parentale, mais également d’effecteurs cellulaires CD8+ capables d’induire la lyse des cellules tumorales in vitro et d’inhiber la croissance tumorale in vivo. Bien que l'analyse des voies humorale et cellulaire n'ait pas permis de démontrer les mécanismes IGF-1-dépendants mis en jeu avec les cellules B16-F10, l'immunisation des souris C57BL/6 à l'aide de cellules B16- F0mod conduit à une inhibition de la croissance des tumeurs sous-cutanées et du nombre de métastases pulmonaires, confirmant l'implication du facteur IGF-1 dans des mécanismes d'échappement tumoral au système immunitaire.2/ Nos résultats montrent par ailleurs que le facteur IGF-1 joue un rôle direct sur le potentiel tumorigène intrinsèque des cellules tumorales. Outre son action sur la prolifération des cellules tumorales, IGF-1 est impliqué dans le processus de transition épithélio-mésenchymateuse (augmentation des marqueurs N-cadhérine, vimentine, CD44 et CD29), favorisant le maintien de populations tumorales présentant un caractère souche (Sox2, Oct3/4, CD44, CD24, activité ALDH, side population, capacité à former des sphéroïdes). Par ce mécanisme, IGF-1 favorise à la fois les propriétés migratoires et d'efflux de drogues, comme la mitoxantrone, par les transporteurs ABC, qui explique en partie la forte résistance des mélanomes aux thérapies conventionnelles.Ces travaux montrent que l’inhibition de la voie IGF1/IGF1-R pourrait être une bonne stratégie pour le développement de traitements anti-tumoraux contre le mélanome. Outre le développement de stratégies d'immunothérapie, le blocage de la voie IGF-1 permettrait également de sensibiliser les cellules de mélanome aux traitements conventionnels et de diminuer le potentiel métastatique des cellules tumorales. / Metastatic melanoma is the least common (5-7 %), but is responsible for most skin cancer deaths by its strong resistance to conventional anti-cancer treatments. Although immunogen, no effective treatment currently exists against this aggressive form, making urgent to find new therapeutic targets. In this context, we assessed whether the Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) could represent a target of therapeutic interest in melanoma inhibiting the expression of IGF-1 by means of an episome-based vector encoding antisense IGF-1, in two cellular models: primary melanoma cells B16-F0 and metastatic B16-F10 (designated B16-F0mod and B16-F10mod when IGF-1 expression is inhibited).In experimental models in vivo, our results show that the reduction of IGF-1 expression induced a decrease of the melanoma cells tumorigenicity, generating smaller tumors under the skin (B16-F0 and B16-F10 in the C57BL/6 mice) and inhibiting totally (C57BL/6) or strongly (NSG mice) the developpment of B16-F10 lung metastases. We sought to understand whether this loss of tumorigenicity, following IGF-1 inhibition, was due to a change of immunogenicity/antigenicity of tumor cells and/or to intrinsic tumorigenic potential modification of metastatic tumor cells.1 / Immunization of mice C57BL/6 mice with B16-F0mod cells induces the formation of humoral lytic effectors in the presence of complement against the parental line, but also CD8+ effector cells capable of inducing tumor cells lysis in vitro and inhibiting tumor growth in vivo. Although the analysis of humoral and cellular pathways did not demonstrate IGF-1- dependent mechanisms involved in B16-F10 cells, immunization of C57BL/6 mice with B16 cells F0mod leads to skin tumor growth inhibition and a reduction in pulmonary metastases number, confirming the involvement of IGF-1 factor in tumor escape mechanisms of the immune system.2 / Our results also show that IGF-1 plays a direct role in the intrinsic tumorigenic potential of tumor cells. In addition to its effect on tumor cells proliferation, IGF-1 is involved in epithelial-mesenchymal transition (increased N-cadherin, vimentin, CD44 and CD29 markers), promoting the maintenance of tumor populations with stemness properties (Sox2, Oct3/4, CD44, CD24, ALDH activity side-population and ability to form spheroids). By this mechanism, IGF-1 promotes both migration properties and drugs efflux such as mitoxantrone, via ABC transporters, which partly explains the strong resistance of melanoma to conventional therapies.This work shows that the inhibition of IGF1/IGF1-R pathway might be a good strategy for the development of anti-tumor treatments against melanoma. In addition to developing immunotherapy strategies, blocking the IGF-1 pathway would also sensitize melanoma cells to conventional therapy and decrease the metastatic potential of tumor cells.

Ce travail porte sur des approches translationnelles dans les synucléinopathies notamment l’atrophie multisystématisée (AMS). Au-delà de leur rôle dans la régulation du glucose, l’insulin et l’insulin like growth factor-1 (IGF-1) ont des propriétés neurotrophiques. Des études ont montrées que la signalisation de l’insuline/IGF-1 est altérée dans la maladie d'Alzheimer et des données suggèrent l’altération de l’insuline/IGF-1 dans la maladie de Parkinson (MP) et l’AMS. Nous avons mis en évidence une résistance à l’insuline dans les neurones des patients MP et AMS ainsi que dans les oligodendrocytes chez les patients AMS.Mon travail a également consisté à cibler la troncation de l’α-synuclein (α-syn) comme cible thérapeutique. Nous avons démontré dans un modèle murin d’AMS que la diminution de l’α-syn tronquée permettait de réduire l’agrégation d’α-syn et la dégénérescence des neurones dopaminergiques.Enfin, nous avons étudié l’implication dans l’AMS des métalloprotéinases matricielles (MMP), des enzymes impliquées dans remodelage de la matrice, la démyélinisation, la troncation de l’α-syn et la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. Ce travail nous a permis de montrer une augmentation de l’expression et de l’activité de MMPs chez les patients AMS. Nous avons également montré que les cellules gliales sont la source de cette augmentation et que la MMP-2 est retrouvée dans les agrégats des patients AMS.Nous montrons ici de caractéristiques distinctes de l’AMS comme des altérations qui se produisent dans les oligodendrocytes. Nous présentons aussi VX-765 comme un candidat prometteur pour ralentir la progression de la pathologie dans un contexte de synucléinopathie. / This work focused on translational approaches in synucleinopathies and more specifically in multiple system atrophy (MSA). Beyond their role in glucose homeostasis, insulin/IGF-1 are neurotrophic factors in the brain. Studies have shown altered insulin/IGF-1 signalling in Alzheimer’s disease and data suggest impaired insulin signaling/IGF-1 in Parkinson's disease (PD) and MSA. The aim of my work was to characterize insulin/IGF-1 signalling in MSA and PD brain tissue. Both groups showed neuronal insulin resistance. Oligodendrocytes in MSA patients were also insulin resistant.In line with the translational approach, we also targeted α-synuclein (α-syn) truncation pharmacologically in MSA transgenic mice, which led to reduced α-syn aggregation and the protection of dopaminergic neurons.We also assessed the activity and distribution of matrix metalloproteinases (MMPs) in the brain of MSA patients compared to healthy controls. MMPs are involved in the remodelling of the extracellular matrix, demyelination, α-syn truncation and blood brain barrier permeability. We showed altered expression and activity of MMPs in two distinct structures in MSA brains. We were also able to show that glial cells were the source of increased MMPs and show a unique expression of MMPs in α-syn aggregates of MSA patients compared to PD, evidence that might hint at a mechanism that is differently altered between PD and MSA.We here show distinct pathological features of MSA such as key alterations occurring in oligodendrocytes, further supporting MSA as a primary oligodendrogliopathy. We also present VX-765 as a candidate drug for disease modification in synucleinopathies.

Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par une résistance à l’insuline des tissus périphériques et par une incapacité des cellules β pancréatiques à sécréter les niveaux d’insuline appropriés afin de compenser pour cette résistance. Pour mieux comprendre les mécanismes déficients dans les cellules β des patients diabétiques, il est nécessaire de comprendre et de définir les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Dans les cellules β pancréatiques, le métabolisme du glucose conduit à la production de facteurs de couplage métabolique, comme l’ATP, nécessaires à la régulation de l’exocytose des vésicules d’insuline. Le mécanisme par lequel la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose déclenche l’exocytose des vésicules d’insuline est bien décrit dans la littérature. Cependant, il ne peut à lui seul réguler adéquatement la sécrétion d’insuline. Le malonyl-CoA et le NADPH sont deux autres facteurs de couplage métaboliques qui ont été suggérés afin de relier le métabolisme du glucose à la régulation de la sécrétion d’insuline. Les mécanismes impliqués demeurent cependant à être caractérisés. Le but de la présente thèse était de déterminer l’implication des navettes du pyruvate, découlant du métabolisme mitochondrial du glucose, dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans les cellules β, les navettes du pyruvate découlent de la combinaison des processus d’anaplérose et de cataplérose et permettent la transduction des signaux métaboliques provenant du métabolisme du glucose. Dans une première étude, nous nous sommes intéressés au rôle de la navette pyruvate/citrate dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose, puisque cette navette conduit à la production dans le cytoplasme de deux facteurs de couplage métabolique, soit le malonyl-CoA et le NADPH. De plus, la navette pyruvate/citrate favorise le flux métabolique à travers la glycolyse en réoxydation le NADH. Une étude effectuée précédemment dans notre laboratoire avait suggéré la présence de cette navette dans les cellules β pancréatique. Afin de tester notre hypothèse, nous avons ciblé trois étapes de cette navette dans la lignée cellulaire β pancréatique INS 832/13, soit la sortie du citrate de la mitochondrie et l’activité de l’ATP-citrate lyase (ACL) et l’enzyme malique (MEc), deux enzymes clés de la navette pyruvate/citrate. L’inhibition de chacune de ces étapes par l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique ou de la technologie des ARN interférant a corrélé avec une réduction significative de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Les résultats obtenus suggèrent que la navette pyruvate/citrate joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Parallèlement à notre étude, deux autres groupes de recherche ont suggéré que les navettes pyruvate/malate et pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate étaient aussi importantes pour la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ainsi, trois navettes découlant du métabolisme mitochondrial du glucose pourraient être impliquées dans le contrôle de la sécrétion d’insuline. Le point commun de ces trois navettes est la production dans le cytoplasme du NADPH, un facteur de couplage métabolique possiblement très important pour la sécrétion d’insuline. Dans les navettes pyruvate/malate et pyruvate/citrate, le NADPH est formé par MEc, alors que l’isocitrate déshydrogénase (IDHc) est responsable de la production du NADPH dans la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate. Dans notre première étude, nous avions démontré l’importance de l’expression de ME pour la sécrétion adéquate d’insuline en réponse au glucose. Dans notre deuxième étude, nous avons testé l’implication de IDHc dans les mécanismes de régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. La diminution de l’expression de IDHc dans les INS 832/13 a stimulé la sécrétion d’insuline en réponse au glucose par un mécanisme indépendant de la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose. Ce résultat a ensuite été confirmé dans les cellules dispersées des îlots pancréatiques de rat. Nous avons aussi observé dans notre modèle que l’incorporation du glucose en acides gras était augmentée, suggérant que la diminution de l’activité de IDHc favorise la redirection du métabolisme de l’isocitrate à travers la navette pyruvate/citrate. Un mécanisme de compensation à travers la navette pyruvate/citrate pourrait ainsi expliquer la stimulation de la sécrétion d’insuline observée en réponse à la diminution de l’expression de IDHc. Les travaux effectués dans cette deuxième étude remettent en question l’implication de l’activité de IDHc, et de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate, dans la transduction des signaux métaboliques reliant le métabolisme du glucose à la sécrétion d’insuline. La navette pyruvate/citrate est la seule des navettes du pyruvate à conduire à la production du malonyl-CoA dans le cytoplasme des cellules β. Le malonyl-CoA régule le métabolisme des acides gras en inhibant la carnitine palmitoyl transférase 1, l’enzyme limitante dans l’oxydation des acides gras. Ainsi, l’élévation des niveaux de malonyl-CoA en réponse au glucose entraîne une redirection du métabolisme des acides gras vers les processus d’estérification puis de lipolyse. Plus précisément, les acides gras sont métabolisés à travers le cycle des triglycérides/acides gras libres (qui combinent les voies métaboliques d’estérification et de lipolyse), afin de produire des molécules lipidiques signalétiques nécessaires à la modulation de la sécrétion d’insuline. Des études effectuées précédemment dans notre laboratoire ont démontré que l’activité lipolytique de HSL (de l’anglais hormone-sensitive lipase) était importante, mais non suffisante, pour la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans une étude complémentaire, nous nous sommes intéressés au rôle d’une autre lipase, soit ATGL (de l’anglais adipose triglyceride lipase), dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose et aux acides gras. Nous avons démontré que ATGL est exprimé dans les cellules β pancréatiques et que son activité contribue significativement à la lipolyse. Une réduction de son expression dans les cellules INS 832/13 par RNA interférant ou son absence dans les îlots pancréatiques de souris déficientes en ATGL a conduit à une réduction de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose en présence ou en absence d’acides gras. Ces résultats appuient l’hypothèse que la lipolyse est une composante importante de la régulation de la sécrétion d’insuline dans les cellules β pancréatiques. En conclusion, les résultats obtenus dans cette thèse suggèrent que la navette pyruvate/citrate est importante pour la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ce mécanisme impliquerait la production du NADPH et du malonyl-CoA dans le cytoplasme en fonction du métabolisme du glucose. Cependant, nos travaux remettent en question l’implication de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Le rôle exact de IDHc dans ce processus demeure cependant à être déterminé. Finalement, nos travaux ont aussi démontré un rôle pour ATGL et la lipolyse dans les mécanismes de couplage métabolique régulant la sécrétion d’insuline. / Diabetes is a metabolic disorder characterized by a combination of insulin resistance in peripheral tissues with an inappropriate amount of insulin secreted by the pancreatic β-cells to overcome this insulin resistance. In order to help find a cure for diabetic patients, we need to elucidate the mechanisms underlying the proper control of insulin secretion in response to glucose. In pancreatic β-cells, glucose metabolism leads to the production of metabolic coupling factors, like ATP, implicated in the regulation of insulin vesicle exocytosis. The mechanism linking ATP production by the oxidative metabolism of glucose to the triggering of insulin release that involves Ca2+ and metabolically sensitive K+ channels is relatively well known. Other mechanisms are also involved in the regulation of insulin secretion in response to glucose and other nutrients, such as fatty acids and some amino acids. Malonyl-CoA and NADPH are two metabolic coupling factors that have been suggested to be implicated in the transduction of metabolic signaling coming from glucose metabolism to control the release of insulin granules. However, the mechanisms implicated remained to be defined. The goal of the present thesis was to further our understanding of the role of the pyruvate shuttles, derived from mitochondrial glucose metabolism, in the regulation of insulin secretion. In pancreatic β-cells, pyruvate shuttles are produced by the combination of anaplerosis and cataplerosis processes and are thought to link glucose metabolism to the regulation of insulin secretion by the production metabolic coupling factors. In our first study, we wished to determine the role of the pyruvate/citrate shuttle in the regulation of glucose-induced insulin secretion. The pyruvate/citrate shuttle leads to the production in the cytoplasm of both malonyl-CoA and NADPH and also stimulates the metabolic flux through the glycolysis by re-oxidating NADH. A previous study done in the group of Dr Prentki has suggested the feasibility of the pyruvate/citrate shuttle in pancreatic β-cells. To investigate our hypothesis, we inhibited three different steps of this shuttle in INS 832/13 cells, a pancreatic β-cell line. Specifically, we repressed, using pharmacological inhibitors or RNA interference technology, the mitochondrial citrate export to the cytoplasm and the expression of malic enzyme (MEc) and ATP-citrate lyase (ACL), two key enzymes implicated in the pyruvate/citrate shuttle. The inhibition of each of those steps resulted in a reduction of glucose-induced insulin secretion. Our results underscore the importance of the pyruvate/citrate shuttle in the pancreatic β-cell signaling and the regulation of insulin secretion in response to glucose. Other research groups are also interested in studying the implication of pyruvate cycling processes in the regulation of insulin exocytosis. They suggested a role for the pyruvate/malate and the pyruvate/isocitrate/α-ketoglutarate shuttles. Therefore, three different shuttles derived from the mitochondrial glucose metabolism could be implicated in the regulation of glucose-induced insulin release. All those three shuttles can produce NADPH in the cytoplasm. In the pyruvate/malate and the pyruvate/citrate shuttles, the NADPH is formed by cytosolic malic enzyme (MEc), whereas in the pyruvate/isocitrate/α-ketoglutarate, NADPH is produced by cytosolic isocitrate dehydrogenease (IDHc). In our first study, we established the importance of MEc expression in the regulation of insulin secretion. In our second study, we wanted to investigate the importance of IDHc expression in glucose-induced insulin secretion. The reduction of IDHc expression in INS 832/13 cells stimulated insulin release in response to glucose by a mechanism independent of ATP production coming from glucose oxidative metabolism. This stimulation was also observed in isolated rat pancreatic cells. IDHc knockdown cells showed elevated glucose incorporation into fatty acids, suggesting that isocitrate metabolism could be redirected into the pyruvate/citrate shuttle in these cells. Taken together, these results suggest that IDHc is not essential for glucose-induced insulin secretion and that a compensatory mechanism, probably involving the pyruvate/citrate shuttle, explains the enhanced insulin secretion in IDHc knockdown cells . The pyruvate/citrate shuttle is the only pyruvate shuttle that is linked to the production of malonyl-CoA. Malonyl-CoA is a known inhibitor of carnitine palmitoyl transferase 1, the rate-limiting step in fatty acid oxidation. Therefore, the raising level of malonyl-CoA in response to glucose redirects the metabolism of fatty acids into the triglycerides/free fatty acids cycle which combine esterification and lipolysis processes. Previous studies done in the laboratory of Dr Prentki supported the concept that lipolysis of endogenous lipid stores is an important process for the appropriate regulation of insulin secretion. A first lipase, hormone-sensitive lipase (HSL), has been identified in pancreatic β-cells. HSL expression is important, but not sufficient, for the β-cell lipolysis activity. In a complementary study, we have investigated the role of another lipase, adipose triglyceride lipase (ATGL), in the regulation of insulin secretion in response to glucose and to fatty acids. We first demonstrated the expression and the activity of ATGL in pancreatic β-cells. Reducing ATGL expression using shRNA in INS 832/13 cells caused a reduction in insulin secretion in response to glucose and to fatty acids. Pancreatic islets from ATGL null mice also showed defect in insulin release in response to glucose and to fatty acids. The results demonstrate the importance of ATGL and intracellular lipid signaling in the regulation of insulin secretion. In conclusion, the work presented in this thesis suggests a role for the pyruvate/citrate shuttle in the regulation of insulin secretion in response to glucose. This mechanism possibly implicates the production of NADPH and malonyl-CoA in the cytoplasm. The results also points to a re-evaluation of the role of IDHc in glucose-induced insulin secretion. The precise role of IDHc in pancreatic β-cells needs to be determined. Finally, the data have also documented a role of lipolysis and ATGL in the coupling mechanisms of insulin secretion in response to both fuel and non-fuel stimuli.

La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués. Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991. / Peptide mapping is a routine method for identifying post-translational modifications of proteins. It involves three steps: 1) enzymatic proteolysis, 2) separation of the peptide fragments by capillary electrophoresis (CE) or high performance liquid chromatography (HPLC), 3) identification of the peptide fragments by photometric methods or mass spectrometry (MS). During the past decade, immobilized enzymes for proteolysis have been gaining in popularity because they can be reused and they provide fast protein digestion due to the high ratio of enzyme-to-substrate. In order to study new immobilization techniques developed in the Waldron laboratory, peptide mapping by CE is frequently used, where the total number of peptides detected and their abundance are related to enzymatic activity. CE allows very high resolution separations and, when coupled to laser-induced fluorescence (LIF), provides excellent detection limits that are 1000 times lower than with UV-Vis absorbance. In the typical method, the peptides produced in step 1) above are derivatized with a fluorophore before separation by CE-LIF. Although the detection sensitivity of LIF can approach 10 12 M for a highly efficient fluorophore, a major disadvantage is that the derivatization reaction requires analyte concentrations to be approx. 10 7 M or higher. Therefore, it is not feasible to study enzymes using CE-LIF of the peptides derivatized after proteolysis if the initial protein substrate concentration is <10-7 M because additional dilution occurs during proteolysis. Instead, to take advantage of CE-LIF to evaluate the efficiency of immobilized enzyme digestion of low concentrations of substrate, we propose using fluorescently derivatized protein substrates that can be purified then diluted. Three methods for conjugating fluorophore to protein were investigated in this work as a means to study both soluble and immobilized enzymes. The fluorophores studied for derivatization of protein standards included naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA), fluoresceine-5-isothiocyanate (FITC) and 6-carboxyfluorescein N-succinimide ester (FAMSE). The FAMSE was found to be an excellent reagent that conjugates quickly with primary amines and the derivatized substrate was stable over time. The studied substrates were -lactalbumin (LACT), carbonic anhydrase (CA) and insulin chain-B (INB). The CE-LIF peptide maps were generated from digestion of the fluorescently derivatized substrates by trypsin (T), chymotrypsin (CT) or pepsin (PEP), either in soluble or insoluble forms. The soluble form of an enzyme is more active than the immobilized form and this allowed us to verify that the conjugated proteins were still recognized as substrates by each enzyme. The digestion of the derivatized substrates with different types of chymotrypsin (CT) was compared: free (i.e., soluble) chymotrypsin, chymotrypsin cross-linked with glutaraldehyde (GACT) and chymotrypsin immobilized on agarose gel particles (GELCT), which was available commercially. The study showed that, according to the chymotrypsin used, the peptide map would vary in the number of peaks and their intensities. It also showed that the digestion by immobilized enzymes was quite reproducible. Several quantitative parameters were studied to evaluate the efficacy of the methods. The detection limit of the overall method (CE-LIF peptide mapping of FAM-derivatized protein digested by chymotrypsin) was 3.010-10 M (S/N = 2.7) carbonic anhydrase using insoluble GACT and 2.010-10 M (S/N = 4.3) CA using free chymotrypsin. Our studies also showed that the standard curve was linear in the working region (1.0×10-9-1.0×10-6 M) with a correlation coefficient (R2) of 0.9991.

No description available.