La glucotoxicité, ou exposition prolongée à de hautes teneurs en glucose, altère la fonction des cellules ß-pancréatiques et participe au développement du diabète. Il a été démontré que dans les cellules ß, la glucotoxicité engendre des modifications de l’expression génique, des altérations des voies de signalisation Ca2+-dépendantes et de l’exocytose ainsi qu’une augmentation de l’apoptose. Les mécanismes moléculaires responsables de ces altérations sont encore peu connus, mais ces observations suggèrent que des changements du profil d’expression génique des cellules ß-pancréatiques en sont à l’origine. Afin de mieux comprendre les conséquences de la glucotoxicité, une étude génomique a été menée dans la lignée de cellules ß-pancréatiques INS-1E. Cette étude a révélé l’existence de variations significatives des taux d’expression de plusieurs gènes importants pour la fonction des cellules ß, codant pour des protéines impliquées notamment dans le métabolisme glucidique et les différentes étapes de la voie de sécrétion d’insuline. D’autre part, cette approche a également révélé de profonds changements dans les voies de signalisation dépendantes de l’AMPc. Si le rôle prédominant du Ca2+ dans la régulation de la voie de sécrétion de l’insuline a été mis en évidence et bien caractérisé, l’implication et l’importance de l’AMPc dans ce processus restent mal définies. L’AMPc, au même titre que le Ca2+, module l’activité de nombreuses protéines de signalisation, régule l’expression génique et intervient également dans le trafic vésiculaire et la sécrétion d’insuline. De manière intéressante, l’expression de l’adénylate cyclase 8 (ADCY8) est fortement diminuée en condition de glucotoxicité. Ceci suggère qu’un défaut de synthèse d’AMPc pourrait être à l’origine du remaniement des voies de signalisation impliquées dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Nous avons donc décidé d’étudier, plus en profondeur, les conséquences fonctionnelles de la diminution de l’expression de l’ADCY8 sur ces voies. Nos résultats suggèrent que l’ADCY8, une isoforme peu exprimée dans les cellules ß- pancréatiques? et stimulée par le Ca2+, se trouve au carrefour des voies de signalisation activées par le glucose et le GLP-1. La diminution de son expression est ainsi partiellement responsable des effets induits par la glucotoxicité sur la régulation de la sécrétion d’insuline. D’autre part, plusieurs résultats récents suggèrent l’implication des voies de signalisation AMPc-dépendantes dans la protection des cellules ß contre l’apoptose et dans ce contexte, le rôle de l’ADCY8 dans ces cellules a été abordé. / Glucotoxicity, or prolonged exposure to elevated levels of glucose, alters the function of pancreatic??-cells and is involved in diabetes pathogenesis. It has been demonstrated that glucotoxicity modifies gene expression and induces considerable changes in [Ca2+]i and in cAMP-dependent signalling (Dubois et al, Endocrinology, 148(4):1605-14 ; 2007) as well as a it decreases insulin exocytosis in response to glucose and increases apoptosis. The molecular mechanisms of these effects are not known but several observations suggest that changes in gene expression profiles are involved. To address that, a genomic study has been done in the clonal b-cell line INS-1E and revealed important modifications in the expression rates of many genes involved in glucose metabolism and vesicular traffic. This approach also revealed the alteration of cAMP-mediated signalling pathways and as the role of calcium and the importance of the correlation between cAMP and Ca2+-mediated signalling pathways had been shown, it was interesting to address the role of this second messenger in this process. Actually, cAMP regulates the activity of a large number of signalling proteins, it is also an important messenger involved in vesicular traffic, insulin secretion and gene expression. Interestingly, we also found that the expression of the adenylyl cyclase VIII (ADCY8) was largely diminished by glucotoxicity and this suggests that an alteration of cAMP synthesis could be involved in the decrease of insulin secretion in this condition. For this reason, we decided to address the functional consequences of altered ADCY8 expression on cAMP-mediated signalling pathways and on its correlation with the decrease of insulin secretion in glucotoxicity. Our results demonstrate a requirement for ADCY8 in glucose as well as in GLP-1 activated signalling pathways and strongly suggest a central role for ADCY8 in glucotoxicity. Moreover, recent publications suggest the implication of cAMP-mediated signalling pathways in the protection of b-cells against apoptosis induced by glucotoxicity, and the role of ADCY8 in this process was investigated.

E2F1, un régulateur crucial du métabolisme dans les cellules normales et cancéreuses.Résumé: Le facteur de transcription E2F1 est largement décrit pour son implication dans le contrôle du cycle cellulaire. Notre laboratoire et d'autres ont montré qu'il jouait également un rôle majeur dans le contrôle de l'homéostasie du glucose et des lipides. Dans les travaux présentés dans cette thèse, nous avons démontré ici en utilisant les souris invalidées pour E2F1 (souris E2f1-/-), qu'il joue un rôle dans le mécanisme de sécrétion d'insuline, dans la lipogenèse et la gluconéogenèse hépatique et dans le contrôle du métabolisme oxydatif. Dans la cellules β pancréatique, E2F1 contrôle la sécrétion d'insuline via le contrôle de l'expression de Kir6.2. Nous avons également montré l'implication de E2F1 dans la régulation de l'expression de gènes oxydatifs dans le TAB et le muscle. De plus, l'étude du foie de ces souris a permis de montrer le rôle de E2F1 dans le contrôle de la lipogenèse et la néoglucogenèse. E2F1 semble en effet capable de réguler l'expression d'un gène clé de la lipogenèse, Fas et de la G6Pase, un gène impliqué dans la production hépatique de glucose, en coopérant avec le facteur de transcription foxo-1. Enfin, nous avons observé que la diminution de la néoglucogenèse en absence de E2F1 empêche la formation de métastases pulmonaires. Ces différents résultats démontrent que E2F1 est un régulateur clé du métabolisme, et que la modulation de son activité pourrait avoir des conséquences majeures dans le développement de maladies comme le diabète, l'obésité, les myopathies et le cancer.Mots clés: E2F1, sécrétion d'insuline, métabolisme oxydatif, lipogenèse, gluconéogenèse, cancer. / E2F1, a crucial regulator of metabolism in normal and cancer cells. Abstract: E2F1 is a key transcription factor involved in the control of the cell cycle. We and others have previously demonstrated a a major role for E2F1 in the control of glucose and lipid homeostasis. In this thesis, we showed bu using E2F1 null mice, that E2F1 plays a major role in the control of insulin secretion, oxidative metabolism, lipogenesis and gluconeogenesis. E2F1 controls insulin secretion through the modulation of Kir6.2 expression. Moreover, we demonstrated that E2F1 controls the expression of oxidative genes in BAT and muscle. In addition, we observed that E2F1 is involved in the control of lipogenesis and gluconeogenesis in the liver. E2F1regulates the expression of key lipogenic genes, such as Fas, and G6Pase, a gene involved in hepatic glucose production, through cooperation with foxo-1. Finally, we observed that the inhibition of gluconeogenesis upon E2f1 genetic ablation impaired the formation of lung metastases. These different results show that E2F1 is a key regulator of metabolism, and that modulating its activity could have High outcomes on diseases such as diabetes, obesity, muscular distrophies or cancers.Key words: E2F1, insulin secretion, oxidative metabolism, lipogenesis, gluocneogenesis, cancer.

La sécrétion d'insuline est un phénomène physiologique majeur déclenché par l'entrée du glucose dans la cellule β-pancréatique. Elle est naturellement modulée par de nombreux facteurs comme des métabolites, des neurotransmetteurs et des hormones. Parmi les modulateurs hormonaux, les incrétines, dont le chef de file est le Glucagon Like Peptide (GLP-1), sont des amplificateurs gluco-dépendants de la sécrétion d'insuline. Ils activent la voie AMPc-PKA et leurs effets sur la glycémie sont à la base de stratégies pharmacologiques antidiabétiques. Cependant, si les actions physiologiques des incrétines sont bien connues, la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu demeure incomplète. Pour ce travail, nous sommes partis de l'hypothèse suivant laquelle la PKA pourrait potentialiser la sécrétion d'insuline, par phosphorylation de cibles moléculaires spécifiques, grâce à son adressage par les A Kinase Anchoring Proteins (AKAPs) au niveau de la machinerie de l'exocytose. Cette étude s'appuie sur des techniques moléculaires d'invalidation génique (RNAi), de peptides inhibiteurs et de fractionnement subcellulaire, ainsi que sur des analyses en microscopie électronique et confocale. Durant ce travail, nous avons mis en évidence la distribution de la sous-unité RIIα de la PKA à la surface des granules d'insuline matures. Nous avons également montré que la suppression de l'expression de la sous-unité RIIα de la PKA, comme la dissociation des complexes de type PKARII-AKAPs provoquent une réduction importante de l'effet amplificateur du GLP-1 sur la sécrétion d'insuline. Ainsi, cette étude nous a permis d'identifier la sous-unité RIIα de la PKA comme l'isoforme indispensable à la potentialisation AMPc-dépendante de la sécrétion d'insuline induite par le GLP-1, et surtout de placer le granule d'insuline mature au centre des mécanismes liés à l'effet « incrétine ». Ce travail constitue une première étape vers l'identification des différents partenaires du complexe protéique impliqué dans la potentialisation de l'exocytose d'insuline par la voie AMPc-PKA. / Insulin secretion is a major physiological function triggered in the body upon glucose entry into pancreatic β cells. This process is naturally subject to modulation by numerous metabolites, neurotransmitters or hormones. Among the modulatory hormones, incretins, mainly Glucagon Like Peptide (GLP1), act on β cells as physiological amplifiers of glucose-dependent insulin secretion. Incretins are known to recruit the cAMP signaling transduction pathway and their effects on glucose homeostasis represent a current basis for promising anti-diabetic approaches. However, while physiological actions of incretins are well known, the molecular mechanisms underlying these actions are not fully understood.In this thesis, we based our work on the hypothesis that the PKA (cAMP-dependent protein kinase) might potentiate glucose-induced insulin secretion via direct phosphorylation of PKA targets at the level of the exocytosis components, through specific anchoring of the kinase to this microdomain by A-Kinase Anchoring Proteins (AKAPs).The present work involving specific molecular approaches, such as siRNA, cell-permeable peptide competitors, subcellular fractionations as well as confocal and ultrastructural analysis of β cells, culminated to provide compelling evidence that the RIIα PKA isotype is physically associated to mature insulin granules. We demonstrate that in pancreatic β cells, either suppression of RIIαPKA expression or endogenous disruption of RIIαPKA from AKAPs results in almost complete loss of GLP1-induced amplification of insulin secretion.In conclusion, the present work allowed the identification of RIIα as a crucial effector of the cAMP/PKA axis for the amplification by incretins of insulin secretion. This finding represents a first and important step towards the identification of the molecular partners involved in the GLP1-induced PKA-dependent potentiation of insulin exocytosis.

Les lipopolysaccharides sont des molécules présentes à la surface des bactéries Gram(-). Dans certaines situations, ces molécules se retrouvent dans la circulation sanguine et induisent une réponse inflammatoire. Quelle que soit l’intensité de la réponse initiée par les LPS, de profondes perturbations métaboliques vont avoir lieu. Le métabolisme glucidique est particulièrement affecté. Chez l’homme, en cas d’infection sévère, telle que le sepsis, le contrôle strict de l’hyperglycémie induite par les LPS via une insulinothérapie est le sujet d’actives recherches de la communauté scientifique et médicale. Par ailleurs, ces dernières années, est apparue la notion d’endotoxémie métabolique, réliée en partie à des régimes alimentaires riches en graisses. Les LPS seraient l’un des nombreux facteurs impliqués dans l’étiologie des maladies métaboliques. Dans ce contexte, nous avons étudié la réponse de l’organisme au glucose dans le cas d’endotoxémie expérimentale contrôlée. Exclusivement basée sur l’étude de différents modèles animaux, notre approche expérimentale a permis de montrer que l’administration aigüe ou continue de LPS, induisait une augmentation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose ainsi qu’une augmentation de la clairance du glucose. Enfin, cette augmentation de sécrétion d’insuline était due à une augmentation des taux circulants de glucagon like peptide-1(GLP-1) et que le récepteur au GLP-1 était impliqué dans cette réponse. Elucider les mécanismes moléculaires à l’origine de la perturbation du métabolisme glucidique en réponse aux LPS permettra de mieux appréhender les conséquences physiologiques et pathologiques induites par ces molécules. / Lipopolysacharrides are molecules present on the surface of Gram (-) bacteria. In some situations, these molecules enter in the bloodstream. They induce an inflammatory reaction. Whatever the intensity of the response initiated by LPS, profound metabolic disturbances will take place. Carbohydrate metabolism is particularly affected. In humans, in cases of severe infection, such as sepsis, the strict control of LPS-induced hyperglycemia by insulin therapy is the subject of active research by the scientific and medical community. In addition, recent years have seen emerge the concept of metabolic endotoxemia, partly due to increased plasma concentrations of LPS as a result of high fat diets. These LPS molecules could be one of the many factors involved in the etiology of metabolic diseases. In this context, we investigated the glucose response during different experimental endotoxemia. Exclusively based on the study of various animal models, our experimental approach allowed us to demonstrate that the acute injection or continuous infusion of LPS, was accompanied by an increased glucose-stimulated insulin secretion associated with an increase of glucose disposal. We also demonstrated that this enhanced insulin secretion was due to an increase in circulating levels of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and that theGLP-1 receptor was involved in this response. Elucidating the molecular mechanisms underlying the disruption of glucose metabolism in response to LPS will enhance our understanding of the physiological and pathological consequences of these molecules.

La prévalence de l'obésité et du diabète de type II est en constante augmentation dans les pays industrialisés. La manifestation hépatique de ces pathologies est la NAFLD (" Non-Alcoholic Fatty Liver Disease "). Celle-ci représente aujourd'hui un réel problème de santé publique et résulte d'atteintes métaboliques et hépatiques. La NAFLD démarre par l'accumulation excessive de lipides dans les hépatocytes nommée " stéatose hépatique ". Ces lipides s'accumulent sous différentes formes comme les triglycérides, les esters de cholestérol, les diglycérides et les céramides. La lipotoxicité induite par l'accumulation de ces espèces lipidiques est à l'origine d'un dysfonctionnement au niveau cellulaire et d'une insulino-résistance. Dans ce contexte, les objectifs de ce travail de thèse ont été d'étudier in vivo le rôle des céramides dans l'apparition et les complications de la NAFLD. Pour cela, nous avons utilisé différentes approches : pharmacologiques, génétiques et nutritionnelles. Par une approche pharmacologique, nous avons montré que la fumonisine B1, un contaminant alimentaire ciblant la synthèse des céramides, est à l'origine d'une toxicité hépatique dépendante d'un facteur de transcription essentiel du métabolisme lipidique, LXR (" Liver X Receptor "). Puis, nous avons combiné différentes approches nutritionnelles et génétiques permettant d'induire ou de protéger de la stéatose hépatique. Pour cela, nous avons utilisé des souris invalidées de façon totale ou hépatocyte-spécifique pour PPARa (" Peroxisome Proliferator-Activated Receptor alpha "), un facteur de transcription essentiel au catabolisme des lipides. Cela nous a permis de confirmer le rôle essentiel de PPARa hépatocytaire dans la réponse au jeûne et l'implication systémique de PPARa dans la régulation du métabolisme des céramides au cours de l'obésité induite par un régime HFD (" High Fat Diet "). Enfin, nous avons utilisé des souris invalidées au niveau hépatocytaire pour la sous-unité catalytique de la PI3 Kinase alpha, p110a. Cela nous a permis de confirmer le rôle majeur de la voie de signalisation à l'insuline dépendante de p110a dans l'apparition de l'insulino-résistance dissociée de la stéatose hépatique induite par un régime HFD. De façon intéressante, grâce à ce modèle, nous avons démontré que la lipolyse adipocytaire (et non l'inhibition de la voie insulinémique) représente le signal dominant de l'activité hépatique de PPARa durant le jeûne. L'ensemble de ces travaux mettent en avant le rôle des céramides dans la lipotoxicité associée à la stéatose hépatique. / Prevalence of obesity and type II diabetes is constantly increasing in industrialized countries. NAFLD (" Non-Alcoholic Fatty Liver Disease ") is the hepatic manifestation of these pathologies. NAFLD represents a significant public health problem and is defined as a nexus of metabolic and hepatic diseases. NAFLD begins with fatty accumulation in the liver named "hepatic steatosis". Lipids can accumulate in different forms like triglycerides, cholesterol esters, diglycerides and ceramides. Lipotoxicity induced by the accumulation of these lipid species leads to cellular dysfunction and insulin resistance. In this context, we studied the role of ceramides in apparition and evolution of NAFLD in vivo. For this purpose, we used pharmacological, genetic and nutritional approaches. By pharmacological approach, we showed that fumonisin b1, a mycotoxin targeting ceramide synthesis, leads to hepatic toxicity, which is dependent from LXR ("Liver X Receptor"), a major transcriptional regulator of lipid metabolism. Then, we combined genetic and nutritional approaches in order to induce or protect from hepatic steatosis. For this, we used mice with hepatic or total deletion for PPARa (" Peroxisome Proliferator-Activated Receptor alpha "), a transcriptional factor essential in fatty acid catabolism. First, this model allow us to confirm the role of hepatocyte PPARa in response to fasting and second, to demonstrate the systemic involvement of PPARa in regulating ceramide metabolism during obesity induced by an HFD ("High Fat Diet"). Last, we used p110a liver-specific knockout mice, the catalytic subunit of PI3Kinase alpha. With this model, we confirmed the critical role of p110a-dependent insulin signaling in insulin resistance dissociated from hepatic steatosis induced by a HFD. Interestingly, we demonstrated with this model that free fatty acid released from adipocyte lipolysis (rather than inhibition by p110a-dependent insulin signaling) determines PPARa activity in the liver. Finally, this work highlights the key role of ceramides in lipotoxicity associated with hepatic steatosis.

Confidentiel / Confidentiel

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

INTRODUCTION: Depuis une quinzaine d'années, il est reconnu que l'utilisation des substrats énergétiques à l'exercice chez l'homme et la femme en santé diffère de plusieurs façons importantes. Les hommes utiliseraient plus les glucides et les acides aminés comme carburant à l'exercice alors que les femmes utiliseraient de façon prédominante les gras. Ceci Iaisse entrevoir la possibilité du même phénomène chez les diabétiques. Pourtant, à ce jour, aucune étude n'a été réalisée à cet effet auprès d'une population de personnes diabétiques de type 2. MÉTHODOLOGIE: Nous avons comparé 5 femmes diabétiques de type 2 postménopausées à 5 hommes diabétiques de type 2 selon 5 conditions expérimentales randomisées. RÉSULTATS: Le repas sucré à l'aide du fructose a entraîné une augmentation de l'insulinémie inférieure à celle présente suite au repas sucré à l'aide du sucrose (p=O.040) chez les femmes diabétiques de type 2. De plus, une réponse insulinique différant de manière statistiquement significative entre les hommes et les femmes a été notée 2 heures suite au repas riche en gras (p=O.035). À l'exercice, les réponses insuliniques ont différé de façon statistiquement significative entre les hommes et les femmes dans la condition suivant un repas riche en gras (p=O.035). CONCLUSION: Il semble que le type de repas ainsi que le genre de la personne influencent l'utilisation des substrats énergétiques des personnes diabétiques de type 2. / INTRODUCTION: Since about fifteen years, it is recognized that the use of the energy substrates while exercising differs in several important ways in healthy men and women. Men would use more carbohydrates and amine acids at exercise while women would use fat in a dominant way. These data let glimpse the possibility of the" same phenomenon in a type 2 diabetes population. Nevertheless, this day, no study has been realized for that purpose with a population of type 2 diabetic people. METHODOLOGY: We compared 5 postmenopausal women with type 2 diabetes to 5 men with type 2 diabetes according to 5 randomized experimental conditions. RESUL TS: ln type 2 diabetic women, the meal sweetened by fructose was associated with a lower increase in insulin levels than the one sweetened by sucrose (p=O.040). Furthermore, the insulin response differing in a statistically significant way between men and women was noted 2 hours further the fat rich meal (p=O.035). While exercising, the insulin responses differed in a statistically significant way between men and women in the condition following a fat rich meal (p=O.035). CONCLUSION: It seems that the type of the meal as well as the gender of the person influence the energy substrate utilization of people with type 2 diabetes.