L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés. / Hepatitis C infection is a worldwide health problem since the risk to develop a persistent infection is relatively elevated (40 to 60%) and nearly half of the infected patients do not respond to the classical anti-HCV therapy based on a combination of PEG-IFNα and ribavirin. Viral persistence is based on powerful evasion strategies of the host’s innate immune system. In our study, we characterized antiviral response in primary human normal and chronically HCV-infected hepatocytes, a cutting-edge in our field due to the difficulty to isolate this particular cell type. In order to better define the antiviral response in freshly isolated human primary hepatocytes, we stimulated these cells with extracellular and intracellular dsRNA to trigger TLR3/TRIF and RIG-I-MDA5/CARDIF-mediated antiviral signaling pathways. By using qRT-PCR and microarray analysis, we report that both detection pathways are functional in normal human hepatocytes, their activation leading to the expression of both common (IFIT1, OASL, ISG15 and CXCL10) and specific genes (IL28A, IL28B and IL29), these last ones being a signature of the intracellular dsRNA-mediated pathway. HCV NS3/4A plays a key role in the viral polyprotein processing and upon viral RNA detection by interfering with the host’s antiviral signalling cascades. We report that major antiviral genes induction following activation of RIG-I mediated pathway are severely impaired in ectopically NS3/4A expressing normal hepatocytes due to CARDIF cleavage, but can be restored by specific NS3/4A inhibitor BILN2061. Our microarray analysis also revealed a role for NS3/4A following TRL3-mediated pathway activation on regulation of apoptosis and programmed cell death, which could be linked to strategies for the virus to persist in its host. Despite HCV strategies to circumvent the host’s immune defense system, we observed significant upregulation of ISGs and chemokines in liver biopsies and corresponding isolated hepatocytes from chronically HCV-infected patients. However, no type I and III interferon, neither key-antiviral genes (e.g., CCL5) were detected, underlying an ongoing –but inefficient- antiviral response unable to eradicate the virus. Moreover, we obtained significant inverse correlations between ISGs mRNAs and viral RNA in addition to CARDIF decrease, clearly unravelling efficient viral interfering strategies in a context of chronic HCV infection. This sustained -albeit incomplete- hepatic innate immune response is certainly associated to the failure of the classical IFN-based therapy in half of the infected patients and to the chronic inflammation causing liver damages and eventually leading to hepatocarcinoma which is often observed at late stage of the disease.

L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés. / Hepatitis C infection is a worldwide health problem since the risk to develop a persistent infection is relatively elevated (40 to 60%) and nearly half of the infected patients do not respond to the classical anti-HCV therapy based on a combination of PEG-IFNα and ribavirin. Viral persistence is based on powerful evasion strategies of the host’s innate immune system. In our study, we characterized antiviral response in primary human normal and chronically HCV-infected hepatocytes, a cutting-edge in our field due to the difficulty to isolate this particular cell type. In order to better define the antiviral response in freshly isolated human primary hepatocytes, we stimulated these cells with extracellular and intracellular dsRNA to trigger TLR3/TRIF and RIG-I-MDA5/CARDIF-mediated antiviral signaling pathways. By using qRT-PCR and microarray analysis, we report that both detection pathways are functional in normal human hepatocytes, their activation leading to the expression of both common (IFIT1, OASL, ISG15 and CXCL10) and specific genes (IL28A, IL28B and IL29), these last ones being a signature of the intracellular dsRNA-mediated pathway. HCV NS3/4A plays a key role in the viral polyprotein processing and upon viral RNA detection by interfering with the host’s antiviral signalling cascades. We report that major antiviral genes induction following activation of RIG-I mediated pathway are severely impaired in ectopically NS3/4A expressing normal hepatocytes due to CARDIF cleavage, but can be restored by specific NS3/4A inhibitor BILN2061. Our microarray analysis also revealed a role for NS3/4A following TRL3-mediated pathway activation on regulation of apoptosis and programmed cell death, which could be linked to strategies for the virus to persist in its host. Despite HCV strategies to circumvent the host’s immune defense system, we observed significant upregulation of ISGs and chemokines in liver biopsies and corresponding isolated hepatocytes from chronically HCV-infected patients. However, no type I and III interferon, neither key-antiviral genes (e.g., CCL5) were detected, underlying an ongoing –but inefficient- antiviral response unable to eradicate the virus. Moreover, we obtained significant inverse correlations between ISGs mRNAs and viral RNA in addition to CARDIF decrease, clearly unravelling efficient viral interfering strategies in a context of chronic HCV infection. This sustained -albeit incomplete- hepatic innate immune response is certainly associated to the failure of the classical IFN-based therapy in half of the infected patients and to the chronic inflammation causing liver damages and eventually leading to hepatocarcinoma which is often observed at late stage of the disease.

La surinfection par HDV/ HBV est la forme la plus grave d'hépatite virale chronique et affecte entre 15-20 millions de patients au niveau mondial. HDV n'est pas susceptible aux traitements anti-HBV et le taux de réponse à l'IFNα est <25%. Malgré une progression plus rapide de la maladie hépatique, la majorité des patients présente une suppression de la réplication du HBV. Les détails des interactions entre HDV, HBV et le système immunitaire inné des cellules infectées restent inconnus. Les objectifs de ces travaux de thèse ont été: i) l'étude de l'infection par HDV et son interaction avec la réponse innée cellulaire; ii) l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-HDV; iii) l'exploration de l'interaction entre HDV et HBV. L'approche expérimentale a été basée sur l'infection de cellules dHepaRG, capables d´entretenir des cycles réplicatifs complets de HBV et HDV et ayant une réponse immunitaire innée physiologique. Nous avons observé que: i) l'infection par HDV est associée à un réplication forte dans un nombre limité de cellules, et à une induction de l'expression des ISGs; ii) le traitement des cellules infectées par HDV avec de l'IFNα ne conduit pas à une induction accrue des ISGs et a une faible activité antivirale. Quelques agonistes de PRR, notamment activant la voie NF-kB, induisent une forte diminution de la réplication de HDV; iii) malgré le faible nombre de cellules infectées, HDV et ses protéines induisent une diminution de la réplication de HBV. Ces travaux ouvrent des perspectives importantes concernant la caractérisation de la pathogénèse de l'hépatite delta et l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques immuno modulatrices / HDV/HBV superinfection is the most aggressive form of chronic viral hepatitis and is estimated to affect 15-20 million patients worldwide. HDV is not susceptible to available direct anti-HBV drugs and sustained response to IFNα therapy occurs in less than 1/4 of patients. Despite the faster progression of liver disease, most HDV/ HBV infected patients present a suppression of HBV replication. The details of the interactions between HDV, HBV and the host cell innate immune response remain largely unexplored and research efforts have been limited by the lack of infection models. The aims of this thesis work were: i) to study HDV infection and the interplay with the host innate immune response; ii) to identify novel therapeutic strategies for the inhibition of HDV; iii) to further explore HDV/ HBV interference. The experimental strategy was based on infection of dHepaRG cells, which are known to be permissive to both HBV and HDV full replicative cycles and to present physiological innate immune responses. We observed that: i) HDV infection is associated with a strong, yet transient replication, a potent induction of the expression of ISGs; ii) IFN-α treatment of HDVinfected cells does not induce a further increase of ISG expression and has a modest antiviral activity. Conversely, some PRR agonists, in particular those inducing the NFkB pathway, induce a strong decline in HDV replication; iii) despite the low number of coinfected cells, HDV as well as its encoded proteins exert a repressive effect on HBV replication. Our work opens an array of perspectives on the pathogenesis of hepatitis delta and the identification of novel immune modulatory therapeutic strategies