Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bruno_nunes_ioc_mest_2014.pdf: 816582 bytes, checksum: df0c77d440b819eb23207534911162dd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae, um parasita intracelular obrigatório com tropismo para Macrófagos na pele e células de Schwann nos nervos periféricos. As manifestações clínicas da hanseníase correspondem ao tipo de resposta imune do hospedeiro ao patógeno para conferir suscetibilidade. Muitas doenças têm sido relacionadas com o sistema HLA devido à sua importância na resposta imune adaptativa. Diversos estudos genéticos, em diferentes populações, têm sido realizados com o propósito de associar o HLA-DRB1 com a ocorrência da hanseníase per se e suas formas clínicas. Porém, os trabalhos realizados com HLA classe I são limitados. O presente estudo teve como objetivo analisar possíveis associações entre os alelos e haplótipos HLA classe I, além do polimorfismo TNF -308G>A e a hanseníase per se. Dessa forma, um estudo de caso-controle foi realizado em uma população de 778 pacientes não relacionados, portadores de hanseníase e 661 controles residentes na mesma área geográfica do Rio de Janeiro. Inicialmente, foram identificadas as frequências alélicas e haplotípicas de HLA-A, HLA-B e HLA-C, assim como o polimorfismo TNF -308G>A, que foram comparadas entre os casos e controles. Posteriormente, foram identificadas as frequências dos haplótipos estendidos (HLA-A-B-C-DRB1-TNF -308G>A) e comparadas entre as duas populações do estudo Os resultados demonstraram uma associação entre os alelos HLA-A* 11 e HLA-A* 30 com a susceptibilidade à hanseníase (p= 0,009 e p= 0,017, respectivamente), enquanto os alelos HLA-A* 01, HLA-B27, HLA-B*50 e HLA-C*05 sugeriram uma associação com a resistência à doença (p= 0,029, p= 0,005, p= 0,002 e p= 0,039, respectivamente). As análises dos haplótipos revelaram associação significativa de HLA-A*11-B*15 (OR=6,15) e HLA-A*30-B*42-C*17 (OR=4,16) com a susceptibilidade à hanseníase, assim como o HLA-A*11-B*35-C*04 (OR=2,37), mas com perda de significância do teste quando corrigido para as covariáveis sexo e etnia (p=0,117). Por outro lado, os haplótipos HLA-A*01-C*06 (OR=0,34), HLA-B*27-C*02 (OR=0,10) e HLA-B*50-C*06 (OR=0,18) demonstraram associações significativas com a resistência à doença. Os resultados também mostraram que o genótipo GA do TNF -308 esteve associado com a proteção à hanseníase (OR=0,74), porém com o nível de significância considerado \201Cborderline\201D quando corigido (p=0.06). Em relação ao haplótipo estendido, o estudo indicou associação entre HLA-A*02-B*07- C*07-DRB1*15-TNF -308G (OR=4,66) e HLA-A*03-B*07-C*07-DRB1*15-TNF -308G (OR=4.72) e a suscetibilidade à hanseníase, porém com perda de nível de significância quando corrigido para as covariáveis sexo e etnia (p=0,077 e p=0,101, respectivamente). Muitas dessas associações já foram encontradas em outras populações, confirmando a importância desse sistema no desenvolvimento da doença / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae that is an obligate intracellular parasite with tropism for Macrophages in the skin and Schwann cells in the peripheral nervous system. Clinical manifestations of Leprosy correlate with the type of immune response from the susceptible host to the pathogen. The HLA system has been related to several diseases, due to its important role in the adaptive immune re sponse. Several genetic studies of different populations have been conducted to correlate suscep tibility or resistance of the HLA-DRB1to leprosy per se and its clinical forms, whereas HLA class I studie s are limited. This present study aimed to analyze the possible association between a lleles and haplotypes HLA class I and the TNF -308G>A polymorphism and leprosy per se. Therefore, we used a population-based case control study with 778 unrelated patients with leprosy and 661 controls from de same geographic area of Rio de Janeiro. First, HLA-A, HLA-B and HLA-C were evaluated, resulting in the allele and haplotype frequencies that were compared between ca ses and controls, as well as the TNF - 308G>A polymorphisms. Lastly, the extensive haploty pe frequencies (HLA-A-B-C-DRB1- TNF - 308G>A) were performed and compared between both po pulations. Our results suggested association of the HLA-A*11 and A*30 alleles and le prosy susceptibility (p=0.009 and p=0.017, respectively), whereas HLA-A*01; HLA-B*27; HLA-B*50 and HLA-C*05 appeared associated with resistance to leprosy (p=0.029; p=0.005; p=0.0 02 and p=0.039, respectively). Analyses of the haplotypes demonstrated significant association of HLA-A*30-B*15 (OR=6.15) and A*30-B*42- C*17 (OR=4.15) with susceptibility of leprosy, as w ell as the HLA-A*11-B*35-C*04 (OR=2.37), but did not significant level when adjusted for the covariates gender and ethnicity (p=0.117). In opposite, HLA-A*01-C*06 (OR=0.34), B*27-C*02 (OR=0. 10) and B*50-C*06 (OR=0.17) haplotypes demonstrated significant association wit h resistance to leprosy. Results also showed that the GA genotype of TNF -308 was associated to prote ction to leprosy (OR=0.74), but with the significance level considered “borderline” when adj usted (p=0.06). For the extensive haplotype, the study indicated association between HLA-A*02-B*07-C *07-DRB1*15- TNF -308G (OR=4.66) and HLA-A*03-B*07-C*07-DRB1*15- TNF -308G (OR=4.72) and susceptibility to leprosy, but with lost significance level when adjusted for the covar iates gender and ethnicity (p=0.077 and p=0.101, respectively). Many of these associations have alre ady been found in other populations with leprosy, which confirmed the importance of this sys tem in the disease development.

Made available in DSpace on 2016-05-11T12:56:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_ruivo_ioc_mest_2016.pdf: 2337878 bytes, checksum: 69b7ee821ee7eed53dca00b82150fc69 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Alterações no perfil de glicosilação de proteínas, células e tecidos têm sido utilizadas como marcadores biológicos para processos fisiológicos e patológicos. Glicoconjugados contendo o ácido siálico (Neu5Ac) estão envolvidas em interações celulares e parasito-hospedeiro, tráfego de linfócitos e regulação do sistema imune. O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas (DC), expressa em sua superfície e libera no plasma do hospedeiro, uma enzima restrita ao gênero Trypanosoma, a trans-sialidase (TS). Esta é capaz de transferir Neu5Ac de moléculas doadoras e realocá-las em moléculas na superfície do parasito ou sialilar glicoproteínas de células do hospedeiro. A molécula CD43 é um importante aceptor de Neu5Ac em células T e um provável sítio de ação da TS. Na infecção experimental pelo T. cruzi, as células T CD8+ apresentam, majoritariamente, perfis segregados (i) perforina+ (Pfn+), com ação citotóxica, ou (ii) interferon-gama+ (IFN\03B3+), com perfil inflamatório. Estas células estão diferencialmente compartimentalizadas e atuam de forma antagônica, enquanto as Pfn+ se acumulam na inflamação cardíaca e contribuem para a injúria tecidual, as IFN\03B3+ estão majoritariamente na periferia (sangue e baço) e atuam de forma benéfica. Neste trabalho, propomos que na infecção pelo T. cruzi há alterações de glicofenótipos em proteínas séricas e subpopulações de linfócitos T CD8+ funcionalmente segregadas. Camundongos C57BL/6 foram infectados pela cepa Colombiana do T. cruzi e analisados clinicamente. O glicofenótipo de proteínas séricas foi analisado por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e o glicofenótipo de tecido cardíaco e de células do baço foi analisado usando lectinas por histoquímica e citometria de fluxo, respectivamente Não detectamos modificação no perfil glicosídico em proteínas séricas em animais infectados. Observamos, no tecido cardíaco, reduzida marcação para a lectina Peanut agglutinin (PNA), aumento para Sambucus nigra (SNA) e não alteração para Maackia amurensis (MAL) em células musculares e inflamatórias. Notamos nas fases aguda (42 dpi) e crônica (120 dpi) aumento na frequência de células PNA+ nas células T CD8+CD43+ e CD4+CD43+, redução no percentual de células SNA+ nas células T CD8+ e CD4+ e diminuição na proporção de células MAL+ nas células T CD4+ e CD8+CD4+. Células T CD8+ totais ou CD8+PNA+ apresentaram perfis semelhantes de ativação (CD44+CD62L-), migração (LFA-1+CCR5+ ou LFA-1+CCR1+) e funcionalidade (Pfn+, Pfn+IFN\03B3+ ou IFN\03B3+). Em 120 dpi, detectou-se enriquecimento de células CD8+PNA+IFN\03B3+ no baço. Assim, durante a DC experimental, células T CD8+PNA+ apresentam-se ativadas e com potencial de migrar e exercer atividade inflamatória (IFN\03B3+), contudo estas não foram detectadas em tecido cardíaco. Resta-nos esclarecer se estas células não migram para este tecido, acumulando-se na periferia, ou se ao entrarem no tecido cardíaco têm seu glicofenótipo alterado ou morrem de modo seletivo. Embora nossos achados não permitam a identificação de biomarcadores de natureza glicosídica de progressão e/ou gravidade da DC, abrem perspectivas para explorar outros modelos experimentais de infecção e para estudos sobre a compartimentalização de células fenotipicamente distintas e funcionalmente relacionadas à proteção contra a injúria cardíaca na infecção pelo T. cruzi / Changes in glycosylation profile of proteins, cells and tissues have been used as biological markers of physiological and pathological processes. Glicoconjugates containing sialic acid (Neu5Ac) are involved in cell and host-parasite interactions, lymphocyte traffic and regulation of the immune system. Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease (CD), expresses on the surface and releases in the host plasma, a restricted enzyme to the genus Trypanosoma, the trans-sialidase (TS). This enzyme transfers Neu5Ac from donor molecules and relocates them on parasite surface molecules or sialylates glycoproteins of the host cells. The CD43 molecule is a major acceptor of Neu5Ac on T cells and a target site for TS. In experimental T. cruzi infection, CD8+ T cells have, mostly, segregated profiles (i) perforin+ (Pfn+) with cytotoxic action, or (ii) interferon-gamma+ (IFN\03B3+), with inflammatory profile. These cells are differentially compartmentalized and play antagonistic roles, while the Pfn+ cells accumulate in cardiac inflammation and contribute to tissue injury, the IFN\03B3+ are, mostly, at the periphery (blood and spleen) and play a beneficial role. In the present study, we propose that in T. cruzi infection there are glycophenotype changes in serum proteins and subpopulations of functionally segregated CD8+ T lymphocytes. C57BL/6 mice were infected with the Colombian strain of T. cruzi and analyzed for clinical changes. The glycophenotype of serum proteins was analyzed by mass spectrometry (MALDI-TOF) and glycophenotypes of the cardiac tissue and splenic cells were analyzed using a lectin-based immunohistochemistry and flow cytometry, respectively In infected mice, we did not detect changes in glycoside profile of serum proteins. In the cardiac tissue, we observed reduced staining for the lectin Peanut agglutinin (PNA), increased for Sambucus nigra (SNA) and no alterations for Maackia amurensis (MAL) in muscle and inflammatory cells. In the acute (42 dpi) and chronic (120 dpi) phases, we noticed increased frequency of PNA+ cells among CD8+CD43+ and CD4+CD43+ T cells, reduced percentage of SNA+ cells among CD8+ and CD4+ T cells and decreased proportion of MAL+ cells among CD4+ and CD8+CD4+ T cells. Total and PNA+ CD8+ T cells showed similar profiles of activation (CD44+CD62L-), migration (LFA-1+CCR5+ cells or LFA-1+CCR1+) and functionality (Pfn+, Pfn+IFN\03B3+ or IFN\03B3+). At 120 dpi, there is an enrichment in IFN\03B3+ cells among splenic CD8+PNA+. Thus, in experimental CD PNA+ CD8+T cells are activated and potentially able to migrate towards heart tissue and show inflammatory profile (IFN\03B3+); however, PNA+ cells were not detected in this tissue. It remains to be clarified whether these cells do not migrate to this tissue, accumulating in peripheral tissues, or whether they enter the cardiac tissue but have their glycophenotype modified or selectively dye. Although, our finds do not allow identifying glycosidic biomarkers of progression and/or severity of CD, they open new pathways to be explored using other experimental models of infection and studying the compartmentalizationof phenotypically and functionally distinct cells associated with detrimental or protective role in heart injury in T. cruzi infection

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:55:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_roque_ioc_mest_2011.pdf: 2207785 bytes, checksum: 5965085ee04bb1de36ccb11445b61038 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A formação de corpúsculos lipídicos é um evento que tem sido recentemente descrito durante a tuberculose tanto em condições clinicas quanto experimentais. O aumento no número dessas organelas é um fenômeno bem regulado que parece ter uma importante implicação na patogênese microbiana. Contudo, os mecanismos pelos quais as micobactérias desencadeiam a formação dos corpúsculos lipídicos bem como o seu papel na infecção ainda não estão totalmente compreendidos. Investigamos nesse trabalho os primeiros eventos da defesa do hospedeiro em resposta a infecção por BCG, bem como a formação de corpúsculos lipídicos, os receptores envolvidos na sua biogênese e o seu papel na modulação via endocítica. Durante a infecção experimental por BCG ocorreu uma intensa migração de neutrófilos nas 6 h iniciais. Em 24 h, um grande número de neutrófilos infectados (92%) apresentavam características de morte celular por apoptose. Nos experimentos in vitro, tanto os neutrófilos apoptóticos quanto a infecção com BCG sozinho foram capazes de induzir a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos. Contudo, a resposta foi amplificada no grupo contendo tanto os neutrófilos apoptóticos quanto o BCG. Ainda, o pré-tratamento in vivo com um inibidor de pan-caspase, o zVAD, inibiu a apoptose de neutrófilos, sem modificar o recrutamento destas células nos camundongos C57Bl/6 infectados com BCG. Sob esta condição, a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos foi significativamente inibida nos animais infectados, indicando o papel da célula apoptótica na formação dos corpúsculos lipídicos durante a infecção Além disso, foi observado o envolvimento dos receptores CD14 e CD36 na biogênese dos corpúsculos lipídicos induzidos por BCG in vitro e in vivo respectivamente. A parede celular das micobactérias tem sido apresentada como importante componente na interação patógeno-hospedeiro. Dessa forma, analisamos o papel de componentes da parede micobacteriana na indução de corpúsculos lipídicos. Foi observado que o LAM, TDM e TMM além do BCG, foram capazes de induzir a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos após 24 h de estimulação in vitro. Porém, a micobactéria não patogênica M. smegmatis e partículas de látex não revestidas não foram capazes de induzir um aumento no número de corpúsculos lipídicos. A análise por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou a associação dos corpúsculos lipídicos com os fagossomas além da imagem sugestiva de um corpúsculo lipídico internalizado por um fagossoma infectado durante a infecção experimental por BCG in vivo Por imunofluorescência, foi observado que a interação dos corpúsculos lipídicos com os fagossomas não é dependente da viabilidade bacteriana. Partículas de látex revestidas com os componentes da parede micobacteriana LAM ou PIM apresentaram-se próximas dos corpúsculos lipídicos em diferentes tempos em experimentos in vitro. Após 24 h de infecção por BCG in vivo foi observada a presença da proteína da via endocítica Rab7 e do seu efetor a RILP, mas não da Rab5, co-localizada com os corpúsculos lipídicos, sugerindo que os corpúsculos lipídicos possam estar seqüestrando a Rab7, necessária para a maturação fagossomal. Nossos resultados mostraram diferentes mecanismos envolvidos na biogênese dos corpúsculos lipídicos induzidos por BCG sugerindo que a modulação dessas organelas pelo patógeno pode representar um importante mecanismo de escape da resposta imune do hospedeiro e um futuro alvo terapêutico / Lipid body formation is an event that has been recently described during tuberculosis in both clinical and experimental conditions. The increase of these organelles is a well regulated phenomenon that seems to have an implication in microbial pathogenesis. However, the mechanisms by which the microbial trigger the lipid bodies formation as well as its role in the infection are still not fully understood. We investigated in this work the first events of the host defense in the BCG infection response, as well as the lipid bodies formation, the receptors involved in their biogenesis, and their role in endocytic pathway modulation. During the experimental infection by BCG a great neutrophils influx happened in the initial 6 h. In 24h, a great number of infected neutrophils (92%) showed apoptotic cell death features. In in vitro experiments, both apoptotic neutrophils and BCG infection alone were able to induce lipid bodies formation in macrophages. However, the response was amplified in the group containing both apoptotic neutrophils and BCG. Still, the pre treatment in vivo with pan-caspase inhibitor, zVAD, inhibited the neutrophils apoptosis, without modifying the influx of these cells in the BCG infected C57Bl/6 mice. Under this condition, the lipid body formation in macrophages was drastically inhibited in infected animals, indicating the role apoptotic cells in the lipid body biogenesis during the infection. Beyond that, was observed the involvement of CD14 and CD36 receptors in the lipid bodies biogenesis induced by BCG in vitro and in vivo, respectively. The mycobacteria cell wall has been presented as an important component of host-pathogen interaction. In this way, we analyzed the role of mycobacteria cell wall component in the lipid bodies induction. It was observed that LAM, TDM, and TMM, beside BCG, were able to induce the lipid bodies formation in macrophages after 24h of in vitro stimuli. However, the non-pathogenic mycobacteria M. smegmatis and non coated latex beads were not able to induce an increase in the numbers of lipid bodies. Transmission electronic microscopic analyze showed an interaction between the lipid bodies and phagosomes, beside a suggestive image of an infected phagosome with an internalized lipid body during the experimental BCG infection in vivo. By imunofluorescence, it was observed that the interaction between the lipid bodies and phagosomes is not dependent of bacterial viability. Latex beads coated with mycobacterial cell wall components LAM or PIM presented themselves close of the lipid bodies in different times in in vitro experiments. After 24h of in vivo BCG infection, was observed the presence of Rab7 endocytic pathway protein and its effector RILP, but not the Rab5, co-localized with the lipid bodies, suggesting that the lipid bodies could be highjacking the Rab7, needed for the phagosome maturation. Our results showed different mechanisms involved in the lipid bodies biogenesis induced by BCG, suggesting that modulation of these organelles by the pathogen could represent an important escape mechanism of the host immune response and a future therapeutic target.

The aim of this study was to analyze the expression of interferon-gamma (INF-γ) in gingival biopsies from shallow and deep sites in patients with severe chronic periodontitis. The secondary objective was to correlate the expression of INF-γ in the gingival crevicular fluid (GCF) with sites where the gingival biopsies were collected. Biopsies from 22 patients with chronic generalized or localized severe periodontitis (mean age 45.5 SD 8.9 years), 22 deep and 18 shallow sites were collected. The control group consisted of 14 patients clinically healthy (mean age 39.35 SD 16.5 years). In total, 54 biopsies were collected from 36 patients. The GCF samples were collected from some of the same sites where biopsies were performed, totaling 12 deep sites, 8 shallow sites and 4 control sites. Clinical evaluation parameters including probing pocket depth (PPD), clinical attachment level (CAL), visible plaque index (VPI) and gingival bleeding index (GBI) were used. The tissue was removed with a 2 mm of diameter punch, in the surgery area (control group) or in the subgingival scaling with or without surgical access (test group) and stored in an Eppendorff with 1 ml of 10% formaldehyde for subsequent morphological and immunohistochemical analysis. The intensity of staining was evaluated semi - quantitatively in the epithelial cells, plasma cells, macrophages, fibroblasts and endothelial cells, considering strong staining (score 2), weak staining (score 1) or absence of staining (score 0). The Kruskal-Wallis test was used to compare the expression of INF-γ in epithelial and connective tissues between the three groups (shallow and deep sites of periodontitis and control sites). We observed a trend for a similar pattern of staining in the shallow and deep sites, with a predominance of weak staining in deep sites. In control sites the staining of the epithelium was predominant. However, we could not demonstrate statistically significant differences between the expression of INF-γ in epithelial and connective tissues in the groups that were analyzed. The Spearman correlation analysis showed a strong correlation between the immunohistochemical expression of INF-γ in the epithelium with macrophages, fibroblasts and endothelial cells (r ≥ 0.6 and p ≤ 0.01). There was no correlation with the expression of INF-γ in the epithelial and connective tissues with the clinical data and with the GCF. We conclude that there were no differences in the expression of INF-γ in gingival biopsies in shallow and deep sites of pacients with periodontitis compared to healthy subjects, which may be attributed to the biphasic character of INF-γ. The low detection of INF-γ in the GCF, within the limitations of the study, may suggest that the GCF may not be the election method for detection of INF-γ. / O objetivo desse estudo foi analisar a expressão do interferon-gamma (INF-) em biópsias gengivais de sítios rasos e profundos de pacientes com periodontite crônica severa. O objetivo secundário foi correlacionar a expressão do INF- no fluido gengival com os sítios onde foram coletadas as biópsias gengivais. Foram coletadas biópsias de 22 pacientes portadores de periodontite crônica generalizada ou localizada severas (idade média 45,5  DP 8,9 anos), sendo 22 sítios profundos e 18 sítios rasos. O grupo controle foi composto por 14 pacientes clinicamente saudáveis (idade média 39,35  DP 16,5 anos). No total, foram 54 biópsias coletadas de 36 pacientes. As amostras do fluido gengival foram coletadas de alguns dos mesmos sítios de onde foram realizadas as biópsias, totalizando 12 sítios profundos, 8 sítios rasos e 4 sítios controle. Foram utilizados os parâmetros clínicos de avaliação de profundidade de bolsa à sondagem (PB); nível de inserção clínica (NIC); índice de placa visível (IPV) e índice de sangramento gengival (ISG). O tecido foi removido com punch de 2 mm de diâmetro, na área cirúrgica (grupo controle) ou na consulta para raspagem subgengival com ou sem acesso cirúrgico (grupo teste) e armazenados em Eppendorffs com 1 ml de solução de formaldeído a 10% para posterior análise morfológica e imuno-histoquímica. A intensidade da marcação do INF- foi avaliada semiquantitativamente nas células epiteliais, plasmócitos, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais, considerando-se marcação forte (escore 2), marcação fraca (escore 1) ou ausência de marcação (escore 0). O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar a expressão do INF- nos tecidos epitelial e conjuntivo, entre os três grupos (sítios profundos e rasos da periodontite e sítios controle). Observamos uma tendência a um padrão de marcação similar nos sítios rasos e profundos, com predomínio de marcação fraca nos sítios profundos. Nos sítios controle a marcação do epitélio demonstrou ser predominante. Porém, não foi possível demonstrar diferenças estatisticamente significativas entre a expressão do INF- nos tecidos epitelial e conjuntivo nos grupos analisados. A análise da correlação de Spearman revelou uma forte correlação entre a expressão imuno-histoquímica do INF- no epitélio com macrófagos, fibroblastos e células endoteliais (r ≥ 0,6 e p ≤ 0,01). A expressão do INF- nos tecidos demostrou não ter correlação significante com os dados clínicos apresentados e com o fluido gengival. Concluímos que não foi possível observar diferenças na expressão do INF- em biópsias gengivais nos sítios rasos e profundos de pacientes com periodontite quando comparados à indivíduos saudáveis, o que pode ser atribuído ao caráter bifásico do INF-. A baixa detecção do INF- no fluido gengival, dentro das limitações do estudo, pode sugerir que este talvez não seja o método de eleição para a detecção do INF-Y.

Submitted by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-03-30T20:43:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Fernanda Mattos de Souza.pdf: 3472551 bytes, checksum: 2895a9a8c269897020faa6fabc695397 (MD5) / Approved for entry into archive by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-04-08T18:11:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Fernanda Mattos de Souza.pdf: 3472551 bytes, checksum: 2895a9a8c269897020faa6fabc695397 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T18:11:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Fernanda Mattos de Souza.pdf: 3472551 bytes, checksum: 2895a9a8c269897020faa6fabc695397 (MD5) Previous issue date: 2014-04 / Introdução: Os ensaios de liberação do interferon- γ (ELIG) surgiram como uma alternativa para o diagnóstico de infecção latente pelo Mycobacterium tuberculosis (ILTB). Neste estudo, nós comparamos o desempenho de um dos ELIG, teste Quantiferon TB Gold in tube – QFT, com a prova tuberculínica (PT) em dois pontos de corte (≥ 5 mm e ≥ 10 mm), em profissionais de saúde da atenção básica à saúde (ABS). Métodos: Estudo transversal realizado em profissionais de saúde da ABS de quatro capitais nacionais com alta incidência de TB. O resultado do teste QFT foi comparado com o resultado da PT nos pontos de corte ≥ 5mm e ≥ 10 mm. Resultados: Foram incluídos 632 profissionais de saúde. Ao considerar o ponto de corte ≥ 10 mm para a PT, a concordância entre QFT e a PT foi de 69% (k = 0,31) e para o ponto de corte ≥ 5 mm, a concordância entre os testes foi de 57% (k = 0,22). Devido a baixa concordância entre a PT e o QFT, nós avaliamos os possíveis fatores associados com a discordância entre eles. Ao comparar o grupo PT- / QFT- com o grupo PT+ / QFT-, no ponto de corte ≥ 5 mm, a idade entre 41-45 [OR = 2,70, IC 95%: 1,32-5,51] e 46-64 [OR = 2,04, IC 95%: 1,05-3,93], presença de cicatriz vacinal do BCG [OR = 2,72, IC 95%: 1,40-5,25] e trabalhar apenas na ABS [OR = 2,30, IC 95 %: 1,09-4,86] apresentaram associação estatística significativa. Para o ponto de corte ≥ 10 mm, a presença de cicatriz vacinal do BCG [OR = 2,26, IC 95%: 1,03-4,91], ter tido contato domiciliar com paciente portador de tuberculose ativa [OR = 1,72, IC 95%: 1,01-2,92] e ter feito a PT anteriormente [OR = 1,66, IC 95%: 1,05-2,62] revelaram associação estatística significativa. Curiosamente, a discordância observada no grupo PT- / QFT + não apresentou associação estatistica com nenhuma das variáveis consideradas, independentemente do ponto de corte da PT. Conclusões: Apesar de termos identificado que a vacina BCG contribuiu para a discordância entre os testes, as recomendações brasileiras para o início do tratamento da ILTB não devem ser alteradas devido as limitações do QFT. / Background: A new interferon-γ release assay, QuantiFERON-TB (QFT) test, poses as an alternative test for the diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection (LTBI). Here, we compared the performance of QFT with tuberculin skin test (TST) measured at two different cut-off points among primary health care workers (HCW) in Brazil. Methods: A cross-sectional study was carried out among HCWs in four Brazilian cities with a known history of high incidence of TB. Results of the QFT were compared to TST results based on both ≥5mm and ≥10 mm as cut-off points. Results: We enrolled 632 HCWs. When the cut-off value of ≥10 mm was used, agreement between QFT and TST was 69% (k=0.31), and when the cut-off of ≥5 mm was chosen, the agreement was 57% (k=0.22). We investigated possible factors of discordance of TST vs QFT. Compared to the TST-/QFT– group, the risk factors identified for discordance at the TST+/QFT- group when the TST cut-off of ≥5 mm was used were age between 41-45 [OR=2.70; CI 95%: 1.32-5.51] and 46-64 [OR=2.04; CI 95%: 1.05-3.93], BCG scar [OR=2.72; CI 95%: 1.40-5.25], and having worked only in primary health care [OR=2.30; CI 95%: 1.09-4.86]. On the other hand, for the cut-off of ≥10 mm BCG scar [OR=2.26; CI 95%: 1.03-4.91], being a household contact of a TB patient [OR=1.72; CI 95%: 1.01-2.92] and having had a previous TST [OR=1.66; CI 95%: 1.05-2.62], were significant. Interestingly, discordance observed at the TST-/QFT+ group showed no statistically significant association with any of the variables regardless of TST cut-off value used. Conclusions: Although we identified BCG vaccination to contribute to the discordance in spite of TST cut-offs, the current Brazilians recommendation for the initiation of LTBI treatment, based on TST, should not be changed, based on QFT limitations and decreased accuracy of the method.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:23:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:04Z : No. of bitstreams: 1 000853903.pdf: 918508 bytes, checksum: d82c80d39357f403a66df5582254910d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O interferon alfa (IFN-α), um IFN do tipo I, se apresenta como uma citocina com grande potencial terapêutico, pois atua no combate direto às células tumorais, além de agir sobre a maturação de células dendríticas (DCs), que são células apresentadoras de antígenos profissionais e peças chave na elaboração da uma resposta antitumoral. Entretanto, a administração sistêmica de citocinas pode produzir toxicidade importante nos pacientes, de modo que a indução de sua produção in situ poderia representar uma forma de imunomodulação mais adequada. Assim, o objetivo deste estudo é verificar a ação de vetores lentivirais carregando o gene do IFN-α para transdução de células tumorais, permitindo assim a produção localizada de IFN-α, a fim de explorar, in vitro, seu potencial lítico e imunomodulatório sobre DCs. Vetores lentivirais carregando o gene do IFN-α humano (Lego-IFN) ou GFP (Lego-GFP) foram utilizados para a transdução in vitro de células de câncer colorretal. A transdução foi feita com diferentes multiplicidades de infecção (MOIs - 0.3, 1.0, 2.0, 4.0) para avaliarmos o efeito dose-dependente, seguido de co-cultura com DCs derivadas de monócitos de doadores saudáveis (DC-0.3, DC-1.0, DC-2.0, DC-4.0). Após 48h de co-cultura, as DCs foram avaliadas fenotípica e funcionalmente, através da análise dos marcadores de membrana por citometria de fluxo, capacidade de aloestimulação e de indução de linfócitos T citotóxicos (CTLs). Nós observamos que a transdução com Lego-GFP, mas não com Lego-IFN, aumentou a imunogenicidade das células tumorais, com aumento de expressão de CD54 e HLA-DR. A co-cultura de DCs com células tumorais transduzidas com Lego-IFN aumentou discretamente seu perfil de ativação, mas não seu potencial aloestimulatório in vitro. Observamos que linfócitos cultivados com DC-2.0 produziram níveis mais altos de IFN-γ, sugerindo a indução de um perfil Th1, enquanto que... / Interferon alpha (IFN-α) is a type I IFN with great therapeutic potential, since it is able to directly fight tumor cells and enhance the maturation of dendritic cells (DCs), the main antigen-presenting cells, required for an effective antitumor response. However, the systemic administration of cytokines can induce severe collateral effects. Therefore, the induction of cytokine secretion in situ should represent a more adequate approach for cytokine-based immunotherapy. Thus, the goal of this study was to induce IFN-α secretion by colon cancer cells by transduction with a lentivirus vector carrying the human IFN-α gene, followed by analysis of its immunomodulatory potential over DCs. Transduction was made with different multiplicities of infection (MOIs - 0.3, 1.0, 2.0 and 4.0) to evaluate the dose-dependent effects. Such cells were co-cultured with monocyte-derived DCs from healthy donors (DC-0.3, DC-1.0, DC-2.0 and DC-4.0). Forty-eight hours later, DCs were evaluated for their phenotype (surface activation/maturation markers) by flow cytometry, their ability to induce allogeneic response in a mixed leukocyte reaction (MLR) and effectiveness to induce cytotoxic T cells. We observed that transduction with Lego-GFP, but not Lego-IFN, increased tumor cells' immunogenicity with up-regulation of the markers CD54 and HLA-DR. Co-culture of Lego-IFN-transduced tumor cells with DCs slightly enhanced their activation phenotype but not their potential to stimulate T cell proliferation in vitro. Furthermore, we observed that lymphocytes cultured with DC-2.0 produced higher levels of IFN-γ, suggesting an induction of Th1 profile on T cells, while DC-GFP induced more IL-10 and IL-4. Additionally, DC-4.0 was more efficient in generating cytotoxic T lymphocytes (CTLs) that the control DC, however DC-GFP induced even more CD8+T cell proliferation. The enhancement of tumor cell immunogenicity and the superior induction of CLTs ...

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-30Bitstream added on 2015-04-09T12:47:20Z : No. of bitstreams: 1 000808994_20150530.pdf: 370146 bytes, checksum: b57ece1272febc6027177478678bf29b (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:28Z: 000808994_20150530.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:00Z : No. of bitstreams: 1 000808994.pdf: 1388656 bytes, checksum: ff666b142c12af73f1f96183ae305879 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora novos medicamentos de ação direta anti-HCV tenham sido recentemente aprovados no mercado, com exceção do genótipo 1, a terapia mais utilizada ainda é baseada em Interferon (IFN) e Ribavirina. Desta forma, o genótipo 3 é o que apresenta mais baixa taxa de sucesso no tratamento, no atual cenário. Um dos fatores determinantes do insucesso deste tratamento no paciente é a variabilidade viral. O HCV apresenta alta taxa de mutação durante a replicação, implicando na produção de variantes intra-hospedeiro, denominadas quasispecies. A região hipervariável 1 (HVR1) da proteína do envelope é uma região de alta variabilidade do genoma viral. A detecção das quasispecies minoritárias pode ser realizada de forma confiável e eficiente por pirossequenciamento de alta cobertura (UPDS), técnica capaz de detectar variantes presentes em frequência <1% na população. Com base neste contexto, foram determinados quasispecies da HVR1-HCV de 14 pacientes infectados com o genótipo 3 do vírus, utilizando a técnica de UPDS. No total, 64.400 sequencias da HVR1 foram obtidas de amostras pré-tratamento. Destas, 27.398 sequências de alta qualidade foram filtradas e corrigidas. Valores de distância genética e entropia de Shannon não foram correlacionados a resposta ao tratamento. Estas sequências foram posteriormente submetidas a construção de redes median-joining e análise Bayesiana de estrutura populacional (BAPS). A análise identificou amostras com diferentes estruturas, desde altamente conservadas (apenas uma população de quasispecies) até altamente estratificadas (6 subpopulações). Este resultado foi condizente com a estrutura das redes median-joining. Várias mutações ao longo da HVR1 do mesmo paciente e algumas repetiram em pacientes do mesmo grupo de resposta. Quanto a avaliação de análise das sequências de aminoácidos, embora haja grande variação quanto a sequência e propriedades físico-químicas, pode-se ... / Hepatitis C is a major public health problem. New HCV antiviral drugs were released on market on 2010; however, excluding for genotype 1, the most used therapy used currently is still based on Interferon (IFN) and Ribavirin. Nowadays, genotype 3 is the one with the highest rate of treatment failure. Viral genome variability is one of the factors that lead in therapy failure. HCV presents a high mutability during replication course, implicating in arising of intra-host variants called quasispecies. The hypervariable region 1 (HVR1) from envelope protein presents as quasispecies and may be related to IFN therapy resistance. Resistant quasispecies may not represent majority of variants population in the host, therefore, in these cases traditional sequencing techniques are unable to detect. For detection of minority quasispecies, ultra-deep pyrosequencing (UPDS) is a reliable and efficient tool, being able to detect even variants with frequency <1% in the population. Regarding this issue, we determined HVR1 quasispecies from 14 patients infected with HCV genotype 3 using the UPDS approach. In total, 64,400 HVR1 sequences were obtained from pre-therapy sample. From these sequences, 27,398 ones with high quality were filtered. Genetic distance and Shannon entropy values were not related to therapy outcome. These sequences were analyzed using median-joining networks and Bayesian population structural analysis. These analysis identified samples with different structures, from high conserved (one sub-population) to high stratified ones (6 sub-populations). Networks analysis also confirmed this result. Mutations exclusive for a type of response of therapy were identified along HVR1. Amino acid sequences indicated that this region presents conserved structure, even if sequence and physical and chemicals properties seem flexible. Especially in turns and coils positions, this conservation seems notable. Potential epitopes positions are concentrated ...

A capacidade dos vírus em inibir a resposta imune inata é uma condição que os permite manterem-se na natureza. O vírus parainfluenza 5 (PIV5), por exemplo, expressa a proteína V, a qual é descrita como uma inibidora da sinalização de interferon (IFN), assim antagonizando seu efeito antiviral. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos do bloqueio do receptor de IFN-I no crescimento de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) in vitro e elucidar as relações entre a replicação viral e a resposta de IFN-I pela célula infectada. Para isso, foi modificada uma linhagem celular de bovinos (CRIB) que expressa de forma permanente a proteína V do PIV5. Esta linhagem celular foi denominada CRIB/V. Foram, então, realizados ensaios de penetração, tamanhos de placas virais e curvas de crescimento usando as amostras de BoHV-1 e BoHV-5 em células CRIB e CRIB/V. A análise com BoHV-1 não mostrou diferenças significativas nas cinéticas de penetração e crescimento. Entretanto os tamanhos de placa foram maiores em CRIB/V do que em CRIB. Para o BoHV-5, a penetração foi um pouco mais rápida em CRIB/V. Mesmo que os títulos finais não tenham sido diferentes nas duas células, o BoHV-5 alcançou títulos mais altos em CRIB/V do que em CRIB em períodos iniciais da curva de crescimento em CRIB/V em comparação a CRIB. Além disso, a média do tamanho de placa para BoHV-5 foi maior em CRIB/V do que nas células CRIB. Diferentemente das observações com BoHV-1, nossos resultados sugerem que o bloqueio do receptor de IFN-I pela proteína V facilitou a penetração, liberação e disseminação célula-célula do BoHV-5 nas células bovinas, suprimindo uma resposta antiviral, pelo menos, durante os estágios iniciais da infecção. / The ability of viruses to inhibit innate immune responses dictates a possibility to maintain in nature. For instance, Parainfluenza virus 5 (PIV5) expresses the V protein, which is described to inhibit type I interferon (IFN-I) signaling , then, antagonizing its antiviral effects. The aim of this work was to study the effect of blocking the IFN-I receptor signaling by this V protein on the growth properties of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) in vitro. A plasmid expressing the V protein of PIV5 was transfected into CRIB cells. We performed penetration kinetics, measured viral plaque sizes and determined one step growth curves using BoHV-1 and BoHV-5 strains in both CRIB and CRIB/V cells. The analysis on BoHV-1 showed no significant difference in penetration and growth kinetics. However the BoHV-5 viral plaques were bigger in CRIB/V than CRIB. The penetration of BoHV-5 in CRIB/V cells was slightly faster than in CRIB cells. Even though the final titers did not differ in both cells, BoHV-5 reached higher titers in CRIB/V than in CRIB at earlier time points of its growth. Moreover, the mean plaque size caused by BoHV-5 in CRIB/V cells was spectacularly bigger in CRIB/V than in CRIB cells. Unlike the observations with BoHV-1, our results suggest that blocking the signaling via the IFN-I receptor by the V protein facilitated penetration, release and cell-to-cell spread of BoHV-5 in bovine cells, counteracting an antiviral response, at least, during the early stages of infection.

Submitted by MILENE ROCHA RIBEIRO (mrocharibeiro@yahoo.com.br) on 2018-07-12T17:13:42Z No. of bitstreams: 1 tese milene Final 2018.pdf: 2347108 bytes, checksum: e7698208bc381aa0ba18d041fd938d1b (MD5) / Approved for entry into archive by Paula Torres Monteiro da Torres (paulatms@sjrp.unesp.br) on 2018-07-13T18:00:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ribeiro_mr_do_sjrp.pdf: 2347108 bytes, checksum: e7698208bc381aa0ba18d041fd938d1b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-13T18:00:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ribeiro_mr_do_sjrp.pdf: 2347108 bytes, checksum: e7698208bc381aa0ba18d041fd938d1b (MD5) Previous issue date: 2018-06-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O ZIKV é um vírus de RNA, não segmentado, de fita simples e sentido positivo membro da família Flaviviridae. O genoma viral possui uma arquitetura típica de flavivírus, com cerca de 11kb de comprimento, que codifica três proteínas estruturais (Capsídeo, precursor-Membrana, Envelope) e sete proteínas não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Nas Américas, emergiu rapidamente após surto na ilha da Páscoa, Chile. No Brasil, o surto iniciou em 2015, aumentando consideravelmente casos de microcefalia em recém-nascidos. Aliada a esses casos, também foi observada a ocorrência de síndrome neurológica de Guillain-Barré. Essas associações transformaram o impacto da transmissão e infecções por ZIKV em uma preocupação de saúde pública global. O vírus é transmitido principalmente pelos mosquitos do gênero Aedes, que possuem ampla distribuição e apresentam grandes adaptações a ambientes urbanos. Além de transmissão vetorial, pode ser transmitido via sexual e materno-fetal. O objetivo deste trabalho foi comparar as infecções por uma cepa contemporânea de ZIKV com DENV2 em modelo de explantes de placenta humana a termo, bem como quantificar expressão de citocinas, interferons do tipo I, II e III e marcadores de apoptose induzida via infecção viral. Os resultados demonstram que os explantes da placenta a termo são permissivos e apoiam a infecção por ZIKV. A quantificação da carga viral entre infecções ZIKV e DENV2 foram similares. No entanto, DENV2 apresentou decréscimo na liberação de carga viral em 24 horas pós-infecção. A cinética da replicação viral coincidiu com a expressão de citocinas pró-inflamatórias e o aumento de apoptose no tecido infectado. Clivagem de caspase 3 foi parcialmente dependente de TNF- α e o tratamento com Anti-TNF-α diminuiu significativamente essa ativação mediada por infecção viral. Cumulativamente, este modelo demonstra que os tecidos placentários humanos são alvo de infecção por ZIKV e que a infecção é patogênica para o tecido placentário. Palavras-chave: placenta humana, Flavivírus, explantes, apoptose, interferon, caspase 3. / ZIKV is a non-segmented, single-stranded, positive-sense RNA virus and a member of the Flaviviridae family. Its genome has a typical 11 kB-long flavivirus architecture that encodes three structural proteins (Capsid, PrecursorMembrane, Envelop) and seven non-structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5). In the Americas, the viruses emerged rapidly after outbreak on Pascoa Island, Chile. The outbreak reached Brazil in 2015, substantially increasing cases of microcephaly in newborns. In addition to microcephaly, cases associated with neurological diseases such as GuillainBarré syndrome have made ZIKV a global public health concern. The virus is mainly transmitted by mosquitoes of the genus Aedes, which are widely distributed and which have adapted well great to urban environments. In addition to vector transmission, ZIKV can be transmitted via sexual and maternal-fetal routes, the virus has been isolated is from sperm, amniotic fluid and central nervous systems of stillborn fetuses. The goal of this report was compare ZIKV-infected to DENV2 in full-term human placenta explant model. Quantify expression of cytokines, type I, II and III interferons and markers of induced-apoptosis by viral infection. The results demonstrated that full-term placenta explants are permissive and support ZIKV infection. Viral loads in ZIKV and DENV2 infections were similar. However, DENV2 presented a decrease in viral load release at 24 hours post infection (h.p.i). The kinetics of viral replication coincided with the expression of proinflammatory cytokines and the increase of apoptosis in the infected tissue. Apoptosis was partially dependent on TNF-α. Anti-TNF-α treatment significantly decreased the activated-caspase 3 mediated viral infection. Cumulatively, this model demonstrates that human placental tissues are targets of ZIKV-infection and that the infection is pathogenic to placental tissue.

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Yury Khudyakov / Banca: Ana Carolina Gomes Jardim / Banca: Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Mello Membro / Banca: Camila Malta Romano / Banca: Paola Jocelan Scarin Provazzi Trabulsi / Banca: Cintia Bittar / Resumo: Embora novos medicamentos de ação direta anti-HCV tenham sido recentemente aprovados no mercado, com exceção do genótipo 1, a terapia mais utilizada ainda é baseada em Interferon (IFN) e Ribavirina. Desta forma, o genótipo 3 é o que apresenta mais baixa taxa de sucesso no tratamento, no atual cenário. Um dos fatores determinantes do insucesso deste tratamento no paciente é a variabilidade viral. O HCV apresenta alta taxa de mutação durante a replicação, implicando na produção de variantes intra-hospedeiro, denominadas quasispecies. A região hipervariável 1 (HVR1) da proteína do envelope é uma região de alta variabilidade do genoma viral. A detecção das quasispecies minoritárias pode ser realizada de forma confiável e eficiente por pirossequenciamento de alta cobertura (UPDS), técnica capaz de detectar variantes presentes em frequência <1% na população. Com base neste contexto, foram determinados quasispecies da HVR1-HCV de 14 pacientes infectados com o genótipo 3 do vírus, utilizando a técnica de UPDS. No total, 64.400 sequencias da HVR1 foram obtidas de amostras pré-tratamento. Destas, 27.398 sequências de alta qualidade foram filtradas e corrigidas. Valores de distância genética e entropia de Shannon não foram correlacionados a resposta ao tratamento. Estas sequências foram posteriormente submetidas a construção de redes median-joining e análise Bayesiana de estrutura populacional (BAPS). A análise identificou amostras com diferentes estruturas, desde altamente conservadas (apenas uma população de quasispecies) até altamente estratificadas (6 subpopulações). Este resultado foi condizente com a estrutura das redes median-joining. Várias mutações ao longo da HVR1 do mesmo paciente e algumas repetiram em pacientes do mesmo grupo de resposta. Quanto a avaliação de análise das sequências de aminoácidos, embora haja grande variação quanto a sequência e propriedades físico-químicas, pode-se ... / Abstract: Hepatitis C is a major public health problem. New HCV antiviral drugs were released on market on 2010; however, excluding for genotype 1, the most used therapy used currently is still based on Interferon (IFN) and Ribavirin. Nowadays, genotype 3 is the one with the highest rate of treatment failure. Viral genome variability is one of the factors that lead in therapy failure. HCV presents a high mutability during replication course, implicating in arising of intra-host variants called quasispecies. The hypervariable region 1 (HVR1) from envelope protein presents as quasispecies and may be related to IFN therapy resistance. Resistant quasispecies may not represent majority of variants population in the host, therefore, in these cases traditional sequencing techniques are unable to detect. For detection of minority quasispecies, ultra-deep pyrosequencing (UPDS) is a reliable and efficient tool, being able to detect even variants with frequency <1% in the population. Regarding this issue, we determined HVR1 quasispecies from 14 patients infected with HCV genotype 3 using the UPDS approach. In total, 64,400 HVR1 sequences were obtained from pre-therapy sample. From these sequences, 27,398 ones with high quality were filtered. Genetic distance and Shannon entropy values were not related to therapy outcome. These sequences were analyzed using median-joining networks and Bayesian population structural analysis. These analysis identified samples with different structures, from high conserved (one sub-population) to high stratified ones (6 sub-populations). Networks analysis also confirmed this result. Mutations exclusive for a type of response of therapy were identified along HVR1. Amino acid sequences indicated that this region presents conserved structure, even if sequence and physical and chemicals properties seem flexible. Especially in turns and coils positions, this conservation seems notable. Potential epitopes positions are concentrated ... / Doutor