Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-09-08T11:56:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1814093 bytes, checksum: 43e62c8dd9ac1a5d7319541690bb9f83 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T11:56:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1814093 bytes, checksum: 43e62c8dd9ac1a5d7319541690bb9f83 (MD5) Previous issue date: 2015-07-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho avaliou a aplicação do hidróxido duplo lamelar (HDL) de cálcio e alumínio (Hidrocalumita, HC) na remoção dos íons metálicos Cu2+, Ni2+ e Zn2+, por meio do processo de reconstrução lamelar com base no método de precipitação química. A hidrocalumita obtida neste estudo foi sintetizada pelo método de coprecipitação em diferentes proporções de cálcio e alumínio (Ca:Al), sendo que a proporção de 4:1 (4HC) apresentou o melhor resultado na remoção dos cátions metálicos da solução aquosa. A 4HC mostrou-se adequada para ser utilizada na remoção dos cátions metálicos em soluções aquosas com valores de pH acima de 3. Os experimentos feitos com 1,0 g L-1 de 4HC e com soluções separadas de 300 mg L-1 de Cu2+, Ni2+ e Zn2+, possibilitou obter uma remoção de 100 % dos metais. Nos estudos de cinética verificou-se que em um tempo de 10 minutos atingiram-se valores de remoção para o Cu2+, Ni2+ e Zn2+ na ordem de 87,6; 97,2 e 77,5 %, sendo que neste tempo a solução atingiu valores de pH próximos a 9,0; 10,5 e 11,0, respectivamente. O pH da solução foi diminuindo com o tempo, onde atingiu o valor próximo a 7,0 em um tempo 420 minutos. A caracterização por difração de raio-x e espectrofotometria na região do infravermelho dos HDLs de CuAl, NiAl e ZnAl obtidos no final do processo de remoção (pH 7,0), possibilitou verificar que os HDLs formados apresentam estruturas lamelares e contem como ânion interlamelar o íon carbonato (CO32-). A construção de curvas de precipitação para a remoção dos cátions metálicos pela 4HC, possibilitou verificar que ocorre uma troca equimolar entre o cálcio e os cátions Cu2+, Ni2+ e Zn2+ da solução. A capacidade de remoção utilizando a 4HC foi de 444,8; 410,0 e 412,0 mg g-1 para o cobre, níquel e zinco, respectivamente, sendo superior a outros trabalhos que envolvem a adsorção na remoção desses metais. Os estudos de competição entre os metais Cu2+, Ni2+ e Zn2+ foram feitos com uma solução contendo 200 mg L-1 de cada metal, onde determinou-se que, na reconstrução lamelar, a troca do cálcio da 4HC pelos metais segue a seguinte ordem de preferência: Cu2+ >> Zn2+ ≅ Ni2+. O processo de reconstrução lamelar com a 4HC foi avaliado na remoção de oxiânions. Neste estudo foram preparadas soluções de 200 mg L-1 de íons Cr(VI) contendo separadamente 400 mg L-1 de cada um dos cátions Cu2+, Ni2+ ou Zn2+. A reconstrução lamelar utilizando a 4HC com os íons metálicos em solução formaram os HDLs de CuAl, NiAl e ZnAl, que possibilitaram realizar a adsorção do íons Cr(VI) com uma capacidade de remoção de 120,0; 113,0; 103,0 mg g-1, respectivamente. A 4HC quando utilizada com a solução contendo apenas 200 mg L-1 de íon Cr(VI), apresentou uma capacidade de remoção de 28,0 mg g-1. A hidrocalumita (4HC) pode ser utilizada com sucesso na remoção dos cátions Cu2+, Ni2+ e Zn2+ e de oxiânions (Cr(VI)) pelos HDLs formados no processo de reconstrução lamelar com base no método de precipitação química. / This study evaluated the application of the layered double hydroxide (LDH) of calcium and aluminum (Hydrocalumite, HC) in the removal of metal Cu 2+, Ni2+ and Zn2+ ions, by means of layered reconstruction process based on the chemical precipitation method. The hydrocalumite obtained in this study was synthesized by coprecipitation method in different proportions of aluminum and calcium (Ca: Al), with the ratio of 4:1 (4HC) showed the best result in the removal of metal cations from aqueous solution. The 4HC proved to be suitable for use in the removal of metal ions in aqueous solutions with pH values above 3. The experiments made with 1.0 g L-1 of 4HC and separate solutions of 300 mg L-1 Cu2+, Ni2+ and Zn2+, possible to get a 100% removal of metals. In kinetic studies it was found that in a 10 minute time is reached, removal values for Cu2+, Ni2+ and Zn2+ on the order of 87,6; 97,2 and 77,5%, and this time the solution reached pH close to 9.0; 10.5 and 11.0, respectively. The pH of the solution decreased with time, which reached a value close to 7,0 at a time of 420 minutes. The characterization by x-ray diffraction and infrared spectrophotometry in the region of LDHs CuAl, NiAl and ZnAl obtained at the end of the removal process (pH 7,0), allowed to verify that the lamellar structures formed LDHs present and contains as interlayer anion the carbonate ion (CO32-). The construction of precipitation curves for the removal of metal cations by 4HC, it is possible to verify an equimolar exchange between the calcium and the Cu2+, Ni2+ and Zn2+ cations into the solution. The removal capacity using 4HC was 444,8; 410,0 and 412,0 mg g-1 for copper, nickel and zinc, respectively, higher than other jobs involving adsorption in removing these metals. The competition studies between Cu2+ metal, Ni2+ and Zn2+ were made with a solution containing 200 mg L-1 of each metal where it has been determined that in the lamellar reconstruction, the exchange of calcium of 4HC by metals follows the following order preferably: Cu2+ >> Zn2+ ≅ Ni2+. The lamellar reconstruction process with 4HC was evaluated in the removal of oxyanions. In this study, solutions were prepared of 200 mg L -1 Cr(VI) ion separately containing 400 mg L-1 of each of the Cu2+, Ni2+ or Zn2+ cations. The layered reconstruction using 4HC with the metal ions in the solution formed LDHs of CuAl, NiAl and ZnAl, which make it possible adsorption of Cr(VI) ions with a removal capacity 120,0; 113,0; 103,0 mg g-1, respectively. The 4HC when used with the solution containing only 200 mg L-1 of Cr(VI) ion showed a removal capacity of 28,0 mg g-1. The hydrocalumite (4HC) can be successfully used in the removal of the Cu2+, Ni2+ and Zn2+ cations and (Cr(VI)) oxyanions by LDHs formed in the layered reconstruction process based on the chemical precipitation method.

O mecanismo de ação da Histatina-5 (Hst-5), um peptídeo antimicrobiano da saliva humana com ação fungicida, não está esclarecido. Dicroísmo circular (CD), fluorescência e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foram empregados para examinar as propriedades conformacionais de Hst-5 e seu análogo contendo o aminoácido paramagnético TOAC N-terminal (TOAC0-Hst-5) em solução aquosa, em função do pH, de TFE, e de íons metálicos, e em presença de membranas modelo de composição. Foi examinada a atividade dos dois peptídeos em membranas lipídicas planas, na permeabilização de membranas modelo e frente o fungo Candida albicans e eritrócitos humanos, com o objetivo de estabelecer correlações entre a atividade e a estrutura dos peptídeos. Estudos de fluorescência mostraram a capacidade de TOAC de suprimir a fluorescência e que o pK dos resíduos de Tyr foram deslocados. Espectros de CD mostraram pequenas flutuações conformacionais, mas foram mantidas estruturas ao acaso. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 mostraram a coexistência de duas populações, protonada e desprotonada, em troca lenta. A partir de medidas de desdobramento hiperfino (aN), foram calculados pKs de TOAC; a relação de altura dos picos de campo central e alto também foi sensível à titulação do peptídeo. Em TFE os peptídeos adotaram conformação α-helicoidal (CD). Espectros de fluorescência de Hst-5 mostraram aumento da fluorescência, e os de TOAC0-Hst-5 mostraram supressão, indicando aproximação de TOAC dos resíduos de Tyr. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 também refletiram as mudanças conformacionais. Estudos de fluorescência mostraram a interação de Hst-5 e TOAC0-Hst-5 com Cu2+, Mn2+ e Zn2+, permitindo o cálculo de constantes de ligação. Espectros de CD refletiram pequenas variações conformacionais, sem aquisição de estrutura secundária. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 na presença dos íons paramagnéticos Cu2+ e Mn2+ indicaram interações spin-spin, permitindo o cálculo das distâncias metal-nitróxido. Curvas de tempo de correlação rotacional em função da concentração dos íons permitiram calcular constantes de ligação da mesma ordem de grandeza daquelas obtidas por fluorescência. Hst-5 e TOAC0-Hst-5 ligaram-se em maior extensão a micelas negativas do que a zwitteriônicas num processo pH-dependente. Estudos de supressão de fluorescência por acrilamida confirmaram esses resultados, indicando a modulação por interações eletrostáticas. Espectros de CD mostraram que os peptídeos adotam conformação em dobra β tipo I. Estudos de RPE da interação de TOAC0-Hst-5 com vesículas de composição lipídica mimetizando membranas de E. coli e C. albicans (carga líquida negativa) e eritrócitos (carga líquida zero) confirmaram essa modulaçao. Na presença das membranas negativamente carregadas os espectros apresentaram extremos externos e internos, indicando que o eixo z do nitróxido orienta-se paralelamente à normal à bicamada. Estudos funcionais utilizando bicamadas lipídicas planas mostraram que TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, forma poros. Também, TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, permeabiliza vesículas carregadas negativamente. Ainda, a atividade fungicida de TOAC0-Hst-5 foi maior do que a de Hst-5 na ausência de íons, porém foi a mesma na presença de Mn2+ e Zn2+. Finalmente, TOAC0-Hst-5 mostrou maior atividade hemolítica que Hst-5. Esses resultados sugerem uma possível diferença nos mecanismos de ação de Hst-5 e seu análogo marcado, apesar da semelhança no comportamento conformacional dos peptídeos. / The mechanism of action of histatin-5 (Hst-5), an antifungal antimicrobial peptide from human saliva is not completely clarified. Circular dichroism (CD), fluorescence, and electron paramagnetic resonance (EPR) were used to examine the conformational behavior of Hst-5 and its analogue containing the paramagnetic amino acid TOAC at the N-terminus (TOAC0-Hst-5). Conformational properties were investigated in aqueous solution, as a function of pH, TFE, and addition of metal ions, and in the presence of model membranes of variable lipid composition. The activity of both peptides was examined in planar lipid membranes and with regard to permeabilization of model membranes. Activity was also tested towards the fungus Candida albicans and human erythrocytes, with the scope of establishing structure-function correlations. Fluorescence studies showed that TOAC0-Hst-5 is able to quench the peptide fluorescence and that the pK of the Tyr residues was shifted to lower values. CD spectra indicated that small conformational fluctuations occurred with increasing pH, but the overall unordered structure of the peptides was kept. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 showed the coexistence of two populations, one protonated and one unprotonated, in slow exchange. The pK of TOAC was calculated from measurements of the isotropic hyperfine splitting (aN); the ratios of heights of the mid-field line and the high-field line were also sensitive to the peptide titration. In TFE, the peptides acquired -helical conformation (CD). Fluorescence spectra of Hst-5 showed an increase of fluorescence, while those of TOAC0-Hst-5 revealed quenching, indicating that, on the average, the TOAC residue becomes closer to the Tyr residues as a consequence of the peptide acquiring α-helical conformation. EPR spectra also reflected the conformational changes undergone by the peptide. Fluorescence studies indicated that Hst-5 and its spin labeled analogue interacted with Cu2+, Zn2+, and Mn2+ ions, allowing the calculation of binding constants. CD spectra reflected the occurrence of small conformational fluctuations, without acquisition of stable secondary structure. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 in the presence of the paramagnetic ions Cu2+ and Mn2+ evinced the occurrence of spin-spin interactions, allowing the calculation of metal-nitroxide distances. Curves of rotational correlation times as a function of ion concentration yielded values for the binding constants of the same order of magnitude as those calculated from fluorescence measurements. Hst-5 and TOAC0-Hst-5 bound to a larger extent to negatively charged than to zwitterionic micelles, in a pH-dependent process. Studies of fluorescence quenching by water soluble acrylamide confirmed these results, pointing to the fact that binding is largely modulated by electrostatic interactions. CD spectra indicated that, upon binding to micelles, the peptides acquire a type I β-turn conformation. EPR studies of the interaction between TOAC0-Hst-5 and lipid vesicles whose composition mimicked those of E. coli and C. albicans (both with net negative surface charge) and erythrocytes (net zero surface charge) confirmed this modulation. In the presence of negatively charged membranes, the spectra presented outer and inner extrema, indicating that the nitroxide z axis is oriented parallel to the bilayer normal. Functional studies with planar lipid bilayers showed that TOAC0-Hst-5, but not the native peptide, forms pores. Also, TOAC0-Hst-5, but not Hst-5, permeabilizes negatively charged vesicles. Moreover, the fungicidal activity of TOAC0-Hst-5 was greater than that of Hst-5 in the absence of metal ions. However, in contrast with the native peptide, whose activity increased in the presence of Zn2+ and Mn2+, that of the analogue was the same in the absence and presence of the ions. Finally, TOAC0-Hst-5 had a more pronounced hemolytic activity than Hst-5. These results suggest a possible difference in the mechanisms of action of Hst-5 and its spin labeled analogue, in spite of the similarity of their conformational behavior.

O mecanismo de ação da Histatina-5 (Hst-5), um peptídeo antimicrobiano da saliva humana com ação fungicida, não está esclarecido. Dicroísmo circular (CD), fluorescência e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foram empregados para examinar as propriedades conformacionais de Hst-5 e seu análogo contendo o aminoácido paramagnético TOAC N-terminal (TOAC0-Hst-5) em solução aquosa, em função do pH, de TFE, e de íons metálicos, e em presença de membranas modelo de composição. Foi examinada a atividade dos dois peptídeos em membranas lipídicas planas, na permeabilização de membranas modelo e frente o fungo Candida albicans e eritrócitos humanos, com o objetivo de estabelecer correlações entre a atividade e a estrutura dos peptídeos. Estudos de fluorescência mostraram a capacidade de TOAC de suprimir a fluorescência e que o pK dos resíduos de Tyr foram deslocados. Espectros de CD mostraram pequenas flutuações conformacionais, mas foram mantidas estruturas ao acaso. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 mostraram a coexistência de duas populações, protonada e desprotonada, em troca lenta. A partir de medidas de desdobramento hiperfino (aN), foram calculados pKs de TOAC; a relação de altura dos picos de campo central e alto também foi sensível à titulação do peptídeo. Em TFE os peptídeos adotaram conformação α-helicoidal (CD). Espectros de fluorescência de Hst-5 mostraram aumento da fluorescência, e os de TOAC0-Hst-5 mostraram supressão, indicando aproximação de TOAC dos resíduos de Tyr. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 também refletiram as mudanças conformacionais. Estudos de fluorescência mostraram a interação de Hst-5 e TOAC0-Hst-5 com Cu2+, Mn2+ e Zn2+, permitindo o cálculo de constantes de ligação. Espectros de CD refletiram pequenas variações conformacionais, sem aquisição de estrutura secundária. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 na presença dos íons paramagnéticos Cu2+ e Mn2+ indicaram interações spin-spin, permitindo o cálculo das distâncias metal-nitróxido. Curvas de tempo de correlação rotacional em função da concentração dos íons permitiram calcular constantes de ligação da mesma ordem de grandeza daquelas obtidas por fluorescência. Hst-5 e TOAC0-Hst-5 ligaram-se em maior extensão a micelas negativas do que a zwitteriônicas num processo pH-dependente. Estudos de supressão de fluorescência por acrilamida confirmaram esses resultados, indicando a modulação por interações eletrostáticas. Espectros de CD mostraram que os peptídeos adotam conformação em dobra β tipo I. Estudos de RPE da interação de TOAC0-Hst-5 com vesículas de composição lipídica mimetizando membranas de E. coli e C. albicans (carga líquida negativa) e eritrócitos (carga líquida zero) confirmaram essa modulaçao. Na presença das membranas negativamente carregadas os espectros apresentaram extremos externos e internos, indicando que o eixo z do nitróxido orienta-se paralelamente à normal à bicamada. Estudos funcionais utilizando bicamadas lipídicas planas mostraram que TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, forma poros. Também, TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, permeabiliza vesículas carregadas negativamente. Ainda, a atividade fungicida de TOAC0-Hst-5 foi maior do que a de Hst-5 na ausência de íons, porém foi a mesma na presença de Mn2+ e Zn2+. Finalmente, TOAC0-Hst-5 mostrou maior atividade hemolítica que Hst-5. Esses resultados sugerem uma possível diferença nos mecanismos de ação de Hst-5 e seu análogo marcado, apesar da semelhança no comportamento conformacional dos peptídeos. / The mechanism of action of histatin-5 (Hst-5), an antifungal antimicrobial peptide from human saliva is not completely clarified. Circular dichroism (CD), fluorescence, and electron paramagnetic resonance (EPR) were used to examine the conformational behavior of Hst-5 and its analogue containing the paramagnetic amino acid TOAC at the N-terminus (TOAC0-Hst-5). Conformational properties were investigated in aqueous solution, as a function of pH, TFE, and addition of metal ions, and in the presence of model membranes of variable lipid composition. The activity of both peptides was examined in planar lipid membranes and with regard to permeabilization of model membranes. Activity was also tested towards the fungus Candida albicans and human erythrocytes, with the scope of establishing structure-function correlations. Fluorescence studies showed that TOAC0-Hst-5 is able to quench the peptide fluorescence and that the pK of the Tyr residues was shifted to lower values. CD spectra indicated that small conformational fluctuations occurred with increasing pH, but the overall unordered structure of the peptides was kept. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 showed the coexistence of two populations, one protonated and one unprotonated, in slow exchange. The pK of TOAC was calculated from measurements of the isotropic hyperfine splitting (aN); the ratios of heights of the mid-field line and the high-field line were also sensitive to the peptide titration. In TFE, the peptides acquired -helical conformation (CD). Fluorescence spectra of Hst-5 showed an increase of fluorescence, while those of TOAC0-Hst-5 revealed quenching, indicating that, on the average, the TOAC residue becomes closer to the Tyr residues as a consequence of the peptide acquiring α-helical conformation. EPR spectra also reflected the conformational changes undergone by the peptide. Fluorescence studies indicated that Hst-5 and its spin labeled analogue interacted with Cu2+, Zn2+, and Mn2+ ions, allowing the calculation of binding constants. CD spectra reflected the occurrence of small conformational fluctuations, without acquisition of stable secondary structure. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 in the presence of the paramagnetic ions Cu2+ and Mn2+ evinced the occurrence of spin-spin interactions, allowing the calculation of metal-nitroxide distances. Curves of rotational correlation times as a function of ion concentration yielded values for the binding constants of the same order of magnitude as those calculated from fluorescence measurements. Hst-5 and TOAC0-Hst-5 bound to a larger extent to negatively charged than to zwitterionic micelles, in a pH-dependent process. Studies of fluorescence quenching by water soluble acrylamide confirmed these results, pointing to the fact that binding is largely modulated by electrostatic interactions. CD spectra indicated that, upon binding to micelles, the peptides acquire a type I β-turn conformation. EPR studies of the interaction between TOAC0-Hst-5 and lipid vesicles whose composition mimicked those of E. coli and C. albicans (both with net negative surface charge) and erythrocytes (net zero surface charge) confirmed this modulation. In the presence of negatively charged membranes, the spectra presented outer and inner extrema, indicating that the nitroxide z axis is oriented parallel to the bilayer normal. Functional studies with planar lipid bilayers showed that TOAC0-Hst-5, but not the native peptide, forms pores. Also, TOAC0-Hst-5, but not Hst-5, permeabilizes negatively charged vesicles. Moreover, the fungicidal activity of TOAC0-Hst-5 was greater than that of Hst-5 in the absence of metal ions. However, in contrast with the native peptide, whose activity increased in the presence of Zn2+ and Mn2+, that of the analogue was the same in the absence and presence of the ions. Finally, TOAC0-Hst-5 had a more pronounced hemolytic activity than Hst-5. These results suggest a possible difference in the mechanisms of action of Hst-5 and its spin labeled analogue, in spite of the similarity of their conformational behavior.